胡傳翠，李波，趙達(dá)

卵巢癌是惡性程度最高的婦科腫瘤，患者的預(yù)后差，化療耐藥率高是其預(yù)后不良的重要原因[1]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)對(duì)于卵巢癌具有雙重調(diào)控作用[2]，同時(shí)參與腫瘤耐藥，是卵巢癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)之一[3]，研究TGF介導(dǎo)卵巢癌耐藥的分子機(jī)制有利于提高患者的生存情況[4]。Wnt信號(hào)通路參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展[5]。研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路可促進(jìn)卵巢癌發(fā)生化療耐藥，通過(guò)干預(yù)相關(guān)Wnt通路分子可以促進(jìn)化療藥物的殺傷作用[6-7]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1(transforming growth factor-β activated kinase 1，TAK1)屬于絲裂原活化蛋白三激酶(mitogen activated protein three kinases，MAP3Ks)家族[8]。但除了介導(dǎo)MAPK信號(hào)外，TAK1還可調(diào)控Wnt相關(guān)信號(hào)通路[9]。本課題將初步研究TGF-β1對(duì)于卵巢癌紫杉醇耐藥的作用，對(duì)于TAK1、β-catenin表達(dá)的調(diào)控作用以及敲減TAK1/β-catenin后對(duì)于TGF-β1促紫杉醇耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 SK-ΟV-3人上皮性卵巢癌細(xì)胞株購(gòu)于上海中科院細(xì)胞所。

1.1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素+鏈霉素、lipofactemine3000、均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；TGF-β1購(gòu)自美國(guó)R&D公司；一抗(抗TAK1、抗β-catenin、抗cleaved caspase3、抗GAPDH)、二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；紫杉醇購(gòu)自美國(guó)MCE公司；CCK-8細(xì)胞增殖能力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；siRNA購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng) SK-OV-3人上皮性卵巢癌細(xì)胞株培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 本文所涉及siRNA，包括NC-siRNA、TAK1-siRNA、β-catenin-siRNA均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。使用Lipofactemine3000進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，步驟詳細(xì)參照說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 CCK-8細(xì)胞增殖活力檢測(cè) SK-OV-3細(xì)胞接種于96孔板后使用lipo3000進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染第3天后添加40 nM紫杉醇或10 ng/mL TGF-β1繼續(xù)處理24 h，后參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞增殖能力檢測(cè)。簡(jiǎn)要步驟如下，每孔加入10 μL CCK-8后37 ℃孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)A490 nm處的吸光度值。細(xì)胞增殖抑制率=(1-shRNA-NF-κB平均吸光度值)/(shRNA-NC平均吸光度值-空白孔平均吸光度值)× 100%。

1.2.4 細(xì)胞蛋白抽提及Western blotting實(shí)驗(yàn) 使用RIPA提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。使用PVDF膜濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗4℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜后加入相應(yīng)種屬的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h后使用ECL發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1促進(jìn)SK-OV-3細(xì)胞中β-catenin及TAK1的表達(dá)

WB的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β1可顯著促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞系SK-OV-3中β-catenin及TAK1的蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)下頁(yè)圖1。

2.2 siRNA敲減效率驗(yàn)證

本研究使用siRNA干擾SK-OV-3細(xì)胞中TAK1及β-catenin的表達(dá)，使用WB驗(yàn)證敲減效率。WB結(jié)果顯示TAK1-siRNA可顯著敲減(70±8)%的蛋白表達(dá)量(下頁(yè)圖2A；P<0.01,n=3)，β-catenin可顯著敲減(73±6)%的蛋白表達(dá)量(下頁(yè)圖2B；P<0.001,n=3)。

2.3 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1通過(guò)β-catenin促進(jìn)SK-OV-3對(duì)紫杉醇耐藥

為進(jìn)一步探究TGF-β1是否促進(jìn)SK-OV-3發(fā)生耐藥，且是否通過(guò)β-catenin介導(dǎo)耐藥，本部分使用CCK-8及WB檢測(cè)TGF-β1及β-catenin-siRNA處理后SK-OV-3細(xì)胞增殖及凋亡的變化。CCK-8結(jié)果顯示40 nM紫杉醇可以顯著抑制SK-OV-3細(xì)胞的增殖活力，而外源添加10 ng/mL TGF-β1處理24 h可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖活力(下頁(yè)圖3A)。通過(guò)RNA干擾下調(diào)SK-OV-3中β-catenin的表達(dá)后，TGF-β1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的作用減弱。WB的結(jié)果顯示，紫杉醇顯著促進(jìn)凋亡相關(guān)執(zhí)行蛋白cleaved caspase3的表達(dá)，TGF-β1抑制了caspase3的剪切，而下調(diào)β-catenin表達(dá)后逆轉(zhuǎn)了TGF-β1的作用(下頁(yè)圖3B)。

注：使用WB檢測(cè)TGF-β1對(duì)SK-OV-3中β-catenin及TAK1蛋白表達(dá)的調(diào)控作用(n=3)。**，P<0.01；***，P<0.001。Ctrl為對(duì)照組，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖1 TGF-β1促進(jìn)SK-OV-3細(xì)胞中β-catenin及TAK1的表達(dá)

注：WB檢測(cè)TAK1-siRNA(A)及β-catenin-siRNA(B)的敲減效率。**，P<0.01；***，P<0.001。NC-siRNA為對(duì)照組，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖2 siRNA敲減效率驗(yàn)證

注：(A)CCK-8檢測(cè)TGF-β1/β-catenin通路在SK-OV-3對(duì)紫杉醇耐藥中的作用。(B)WB檢測(cè)TGF-β1及β-catenin-siRNA對(duì)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase表達(dá)的作用。****，P<0.0001。NC-siRNA為對(duì)照組，進(jìn)行單因素方差分析。圖3 TGF-β1通過(guò)β-catenin促進(jìn)SK-OV-3對(duì)紫杉醇耐藥

2.4 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1通過(guò)TAK1/β-catenin促進(jìn)SK-OV-3對(duì)紫杉醇耐藥

TGF-β1可通過(guò)TAK1調(diào)控MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，且TAK1可調(diào)控T細(xì)胞淋巴瘤中Wnt/β-catenin信號(hào)通路[10]。本研究使用CCK-8及WB檢測(cè)TGF-β1及TAK1-siRNA處理SK-OV-3后對(duì)于細(xì)胞增殖及凋亡的變化。CCK-8結(jié)果顯示下調(diào)SK-OV-3中TAK1的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)TGF-β1介導(dǎo)的對(duì)紫杉醇耐藥的作用(圖4A)。WB的結(jié)果顯示，10 ng/mL TGF-β1可以顯著促進(jìn)SK-OV-3細(xì)胞中TAK1及β-catenin的蛋白表達(dá)，而下調(diào)TAK1后可以抑制TGF-β1促進(jìn)β-catenin表達(dá)的作用以及促進(jìn)cleaved caspase3表達(dá)的作用(圖4B)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌中TGF-β1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥，下調(diào)TGF-β1的下游TAK1及β-catenin后可以拮抗耐藥的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡。同時(shí)TGF-β1可通過(guò)TAK1調(diào)控β-catenin的表達(dá)，提示TGF-β1/TAK1/β-catenin信號(hào)通路在卵巢癌紫杉醇耐藥過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。研究報(bào)道TGF-β1在卵巢癌中發(fā)揮著重要的作用，通過(guò)調(diào)控信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、自噬、腫瘤代謝重編程發(fā)揮促進(jìn)耐藥的作用[11-14]。唾液酸轉(zhuǎn)移酶在多種癌癥中上調(diào)，研究發(fā)現(xiàn)ST3GAL1在卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞系中上調(diào)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移/侵襲以及紫杉醇耐藥。TGF-β1可上調(diào)ST3GAL1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)耐藥及腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)卵巢癌的惡性進(jìn)展[11]。糖皮質(zhì)激素廣泛用于腫瘤化療，以減輕化療藥物的不良反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)地塞米松可上調(diào)卵巢癌細(xì)胞表面的TGF-β受體Ⅱ，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)于TGF-β1的反應(yīng)性，通過(guò)整合素β1、TGF-β1信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附作用并促進(jìn)對(duì)于紫杉醇的耐藥[12]。另外，來(lái)自于腫瘤微環(huán)境中的TGF-β1也參與了腫瘤耐藥性的獲得。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)前列腺癌對(duì)多西紫杉醇的耐藥，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的TGF-β1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的自噬過(guò)程，并介導(dǎo)對(duì)于化療藥物的耐藥，通過(guò)自噬抑制劑可以逆轉(zhuǎn)該過(guò)程[13]。另外，TGF-β1還可通過(guò)調(diào)控腫瘤代謝重編程促進(jìn)耐藥的發(fā)生。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，參與非小細(xì)胞肺癌的順鉑耐藥。TGFβ1通過(guò)激活FOXM1-HMGA1-G6PD正反饋環(huán)路維持G6PD的表達(dá)及活性，干預(yù)該通路可以減弱腫瘤細(xì)胞的耐藥性[14]。上述研究同樣支持本研究的發(fā)現(xiàn)，TGF-β1是一個(gè)潛在的分子靶點(diǎn)，深入研究相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制有利于改善卵巢癌耐藥現(xiàn)狀。TAK1可在不同的細(xì)胞環(huán)境中被激活，如腫瘤壞死因子α、脂多糖和TGF-β[15]。研究報(bào)道紫杉醇耐藥的卵巢癌細(xì)胞中TAK1的表達(dá)量增加，并且磷酸化程度越高，其耐藥性越高。使用TAK1的抑制劑5Z-7-惡唑烯醇可以改善體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥[15]。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞中TAK1的表達(dá)，敲減TAK1可逆轉(zhuǎn)TGF-β1介導(dǎo)的紫杉醇耐藥。TAK1激活與相關(guān)位點(diǎn)的磷酸化密切相關(guān)，如T184、T187、T344、S389、T444、T511等[10,16]。在淋巴瘤中，通過(guò)藥理學(xué)和遺傳學(xué)的方法干擾TAK1 T344、S389、T444和T511位點(diǎn)的磷酸化可以抑制β-catenin的激活[10]。這也與本研究的結(jié)果一致，TAK1可調(diào)控β-catenin的表達(dá)。β-catenin通路的激活與卵巢癌耐藥密切相關(guān)，同時(shí)相關(guān)分子的單核苷酸多態(tài)性也可作為化療療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)[17]。卵巢漿液性癌中，c-Kit與PHB結(jié)合后促進(jìn)PHB酪氨酸259位點(diǎn)的磷酸化，進(jìn)一步調(diào)控β-catenin/ABCG2信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)藥物治療的耐受性[18]。本研究尚未研究TGF-β1對(duì)于TAK1磷酸化修飾的調(diào)控作用，在進(jìn)一步研究中將深入研究TAK1中受TGF-β1調(diào)控的磷酸化位點(diǎn)以及相關(guān)位點(diǎn)對(duì)于β-catenin及紫杉醇耐藥表型的分子調(diào)控機(jī)制。

注：(A)CCK-8檢測(cè)TGF-β1/TAK1/β-catenin信號(hào)通路在SK-OV-3對(duì)紫杉醇耐藥中的作用。(B)WB檢測(cè)TGF-β1及TAK1-siRNA對(duì)β-catenin及cleaved caspase3表達(dá)的作用。**，P<0.01；***，P<0.001；*** *，P<0.0001。NC-siRNA為對(duì)照組，進(jìn)行單因素方差分析。圖4 TGF-β1通過(guò)TAK1/β-catenin促進(jìn)SK-OV-3對(duì)紫杉醇耐藥

綜上所述，TGF-β1在卵巢癌紫杉醇耐藥機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。本研究證實(shí)TGF-β1可通過(guò)TAK1調(diào)控β-catenin的表達(dá)并促進(jìn)耐藥的發(fā)生，通過(guò)抑制TAK1及β-catenin可拮抗TGF-β1的作用并逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥，為靶向TGF-β1的分子治療提供了新的理論基礎(chǔ)。