胡大明，侯真真，鄧承敏，陳旭，吳杰，陳磊，陳勤，岳碧松，張修月*

(1.四川白水河國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，四川彭州611930；2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，瀕危動(dòng)物繁殖與保護(hù)遺傳四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065；3.四川省養(yǎng)麝研究所，四川都江堰610016)

林麝Moschusberezovskii隸屬鯨偶蹄目Cetartiodactyla麝科Moschidae麝屬，國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，CITES附錄Ⅰ物種(Smith，解焱，2009；魏輔文等，2021)。雄性林麝分泌的麝香是名貴中藥材，也是高級(jí)香水和香料的原材料，具有極高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值(王海燕等，2006；王淯等，2006)。受經(jīng)濟(jì)利益和市場(chǎng)需求驅(qū)使，野生林麝一度受到大量獵殺，加上棲息地喪失等，我國(guó)野生林麝種群數(shù)量急劇下降，由20世紀(jì)60年代的250余萬(wàn)頭下降到 20世紀(jì)90年代的10余萬(wàn)頭(盛和林，1996)。盡管我國(guó)從20世紀(jì)50年代已開(kāi)始林麝的人工馴養(yǎng)與繁殖研究，但由于疾病、遺傳等因素影響，圈養(yǎng)林麝種群數(shù)量增加緩慢、規(guī)模養(yǎng)殖困難(袁陽(yáng)等，2020)。因此，精確了解野生資源和遺傳狀況對(duì)林麝保護(hù)和資源利用具有重要意義。

近年來(lái)，瀕危動(dòng)物種群及其棲息地得到了較好的保護(hù)，但野生林麝資源的研究多是基于糞便、毛發(fā)等痕跡開(kāi)展的種群密度及數(shù)量估算(胡忠軍等，2007；姚剛，2014；姜海瑞等，2015；胡大明等，2019；王霞等，2020)，僅有2個(gè)對(duì)野生種群遺傳多樣性的研究：馮慧等(2014)基于mtDNA D-Loop和姚剛(2014)基于主要組織相容性復(fù)合體對(duì)野生種群和圈養(yǎng)種群的比較，但受選用的分子標(biāo)記限制，沒(méi)有基于個(gè)體識(shí)別的遺傳多樣性調(diào)查。

微衛(wèi)星是目前應(yīng)用得最廣泛、最優(yōu)良的分子標(biāo)記，能夠進(jìn)行精確的個(gè)體識(shí)別和遺傳多樣性估算。白水河國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)林麝具有一定的種群數(shù)量(胡大明等，2019；彭科等，2021；溫平等，2021)，但林麝種群遺傳多樣性未有報(bào)道。本研究基于微衛(wèi)星和mtDNA D-Loop序列對(duì)保護(hù)區(qū)林麝進(jìn)行遺傳多樣性研究和種群數(shù)量估計(jì)，了解保護(hù)區(qū)林麝種群數(shù)量和遺傳狀況，為野生林麝保護(hù)提供基礎(chǔ)資料。

1 研究地概況

四川白水河國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于四川省彭州市龍門(mén)山鎮(zhèn)和小魚(yú)洞鎮(zhèn)(103°41′～103°57′E，31°10′～31°29′N(xiāo))，總面積301.50 km2，野生動(dòng)植物資源豐富，生態(tài)環(huán)境良好(胡大明等，2019)。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

1份圈養(yǎng)林麝肝臟樣本來(lái)自四川省米亞羅養(yǎng)殖場(chǎng)，10份圈養(yǎng)林麝糞便樣本來(lái)自四川養(yǎng)麝研究所都江堰養(yǎng)麝場(chǎng)，46份野生林麝糞便樣本來(lái)自白水河國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(表1)，所有標(biāo)本保存于四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。野外糞便樣品采用樣線采集，樣線設(shè)置在20條保護(hù)區(qū)日常監(jiān)測(cè)線路內(nèi)(根據(jù)糞便顏色和狀況采集5 d以?xún)?nèi)的糞便)，每條線路選擇 3～7條樣線，每條樣線長(zhǎng)3 km。

表1 46份野生林麝糞便樣本采樣信息

2.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增檢測(cè)

分別使用M5 HiPer Universal DNA Mini Kit超強(qiáng)通用型DNA提取試劑盒MF033-plus-04(北京聚合美生物科技有限公司)和土壤/糞便DNA提取試劑盒TD601-50(北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司)提取林麝肝臟以及糞便DNA。提取的DNA-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增體系總體積為25 μL，其中，正、反引物各1 μL、2×PCR Mix 12.5 μL、肝臟0.5 μL、糞便DNA 2 μL，用ddH2O補(bǔ)齊。S1000TM Thermal Cycler進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min;4 ℃保存。

2.3 適于糞便DNA擴(kuò)增的微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選

林麝微衛(wèi)星位點(diǎn)已有較多報(bào)道，但有穩(wěn)定擴(kuò)增特性的四堿基微衛(wèi)星位點(diǎn)較少，且用于糞便DNA擴(kuò)增的報(bào)道更少。糞便等非損傷性取樣的DNA一般量少且降解嚴(yán)重，其質(zhì)量比其他組織DNA差，位點(diǎn)擴(kuò)增能力也較差，因此本研究從林麝基因組序列以及盧婷(2017)已篩選的四堿基微衛(wèi)星中重新挑選了部分四堿基微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化。使用Krait v1.0.3(Duetal.，2017)從林麝基因組中預(yù)測(cè)潛在的多態(tài)性四堿基微衛(wèi)星標(biāo)記，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，送北京擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成備用。根據(jù)引物參考Tm值設(shè)置溫度梯度、使用肝臟DNA進(jìn)行PCR條件優(yōu)化。使用圈養(yǎng)林麝糞便DNA篩選優(yōu)化后具有穩(wěn)定擴(kuò)增的引物對(duì)，選出能穩(wěn)定擴(kuò)增的引物對(duì)用于野生林麝糞便DNA的擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增體系和程序如2.2，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，取5 μL送北京擎科梓熙生物技術(shù)有限公司基因分型。基因分型在ABI3730 DNA Analyzer上進(jìn)行，使用GeneMapper version 4.0決定樣本的等位基因數(shù)，等位基因大小相對(duì)于分子內(nèi)標(biāo)GS500LIZ決定。

2.4 野生林麝糞便鑒定及個(gè)體識(shí)別

野生林麝糞便使用COⅠ基因進(jìn)行分子鑒定，引物序列：COⅠ-F：5’-ATAGCATTTCCCCGGA-3’，COⅠ-R：5’-TGTTCAGGTTTCGGTCTGT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度300 bp。PCR擴(kuò)增后經(jīng)電泳檢測(cè)，產(chǎn)物條帶清晰單一、長(zhǎng)度與預(yù)期一致，送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序后使用BLAST在線比對(duì)鑒定。

利用MICRO-CHECKER(Oosterhoutetal.，2010)評(píng)估基因分型數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性；利用Cervus(Marshalletal.，1998)，以各位點(diǎn)的期望雜合度(HE)、觀察雜合度(HO)以及多態(tài)信息含量(PIC)選擇最優(yōu)位點(diǎn)排列順序，進(jìn)行基于微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)的林麝個(gè)體鑒定，并計(jì)算PID和PID(sib)。PID為一個(gè)群體中隨機(jī)抽取的2個(gè)不相關(guān)個(gè)體有完全相同基因型的概率，PID(sib)為一個(gè)群體中隨機(jī)抽取2個(gè)同父同母的個(gè)體有完全相同基因型的概率(Kalinowskietal.，2010)。當(dāng)PID<0.001且PID(sib)<0.01時(shí)，則得到個(gè)體識(shí)別所需最少數(shù)量的微衛(wèi)星位點(diǎn)(Waits，2001)。

2.5 遺傳多樣性評(píng)估

通過(guò)MEGA 5.2(Tamuraetal.，2011)對(duì)線粒體D-Loop成功測(cè)序的序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)無(wú)誤的序列利用DnaSP v5(Rozas，1995)計(jì)算遺傳多樣性指標(biāo)參數(shù)：?jiǎn)伪缎投鄻有?h)、核苷酸多樣性(π)。

基因分型結(jié)果利用MICRO-CHECKER校正和評(píng)估，檢測(cè)基因分型數(shù)據(jù)結(jié)果的可信度；利用Cervus 3.0.7計(jì)算等位基因數(shù)(A)、HE、HO以及PIC等參數(shù)。衡量微衛(wèi)星位點(diǎn)變異程度的重要指標(biāo)是PIC：PIC>0.5為高度多態(tài)性，0.5>PIC>0.25為中度多態(tài)性，PIC<0.25為低度多態(tài)性。哈迪-溫伯格平衡(HW平衡)檢驗(yàn)利用Genpop1.2(Raymond & Rousset,1995)進(jìn)行，種群內(nèi)Wright近交系數(shù)(Fis)使用PopGene1.31計(jì)算(Yehetal.，1999)。

2.6 種群數(shù)量及密度估算

式中，n為樣線數(shù)，xi為第i條樣線的林麝個(gè)體數(shù)，Li為第i條樣線面積。

式中，S為保護(hù)區(qū)內(nèi)林麝適宜棲息地總面積。

3 結(jié)果

3.1 樣本采集及林麝糞便樣品的鑒定

經(jīng)糞便形態(tài)初步鑒定，在20條樣線上采集到林麝糞便樣品49個(gè)，經(jīng)COⅠ鑒定為 46份林麝樣品。

3.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選

利用Krait v1.0.3從林麝基因組中預(yù)測(cè)獲得33個(gè)四堿基微衛(wèi)星位點(diǎn)，加上盧婷等(2017)篩選的8個(gè)位點(diǎn)，共41個(gè)位點(diǎn)。以肝臟DNA和圈養(yǎng)林麝糞便DNA為模板，篩選出能穩(wěn)定擴(kuò)增的引物 7對(duì)。對(duì)篩選出的7對(duì)引物進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記(FAM或HEX)(表2)。

表2 適于林麝糞便DNA擴(kuò)增的7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)信息

3.3 林麝個(gè)體識(shí)別

按照LS-22、LS19、LS-21、LS-33、LS-17、LS-34、LS-23的順序逐個(gè)增加用于個(gè)體識(shí)別的微衛(wèi)星位點(diǎn)，對(duì)使用6個(gè)及以上微衛(wèi)星位點(diǎn)能成功擴(kuò)增的糞便樣品進(jìn)行微衛(wèi)星分型，得到分型數(shù)據(jù)庫(kù)。利用Cervus3.0.7按照位點(diǎn)的HO對(duì)分型數(shù)據(jù)進(jìn)行個(gè)體識(shí)別模擬分析，當(dāng)使用7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行個(gè)體識(shí)別時(shí)，在46份樣本中識(shí)別出30只林麝，PID(sib)<0.01(表3;圖1)，這符合種群大小精確評(píng)估的要求。

3.4 遺傳多樣性分析

3.4.1 D-Loop序列特征及遺傳多樣性評(píng)估對(duì)46份林麝糞便DNA進(jìn)行線粒體D-Loop的PCR擴(kuò)增，23份能夠成功擴(kuò)增并測(cè)序，序列長(zhǎng)584 bp，堿基含量為A(32.34%)、G(14.17%)、T(31.65%)和C(21.84%)，23個(gè)序列共39個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，占比6.68%。使用DnaSP定義了6個(gè)單倍型，Hap2擁有最多的個(gè)體數(shù)，為10個(gè)(表4)。遺傳多樣性指標(biāo)：h=0.721 3，π=0.023 44。

表4 林麝23個(gè)(6個(gè)單倍型)D-Loop序列(584 bp)的堿基組成

3.4.2 微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多態(tài)性評(píng)估7個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為3～7，共35個(gè)。其中，等位基因數(shù)≥6的2個(gè)，占28.57%；等位基因數(shù)=5的3個(gè)；位點(diǎn)LS-34的等位基因數(shù)量最多(7個(gè))，位點(diǎn)LS-33的最少(3個(gè))。保護(hù)區(qū)野生林麝種群的Ho為0.211～0.800，平均0.563；HE為0.475～0.798，平均0.602；PIC為0.419～0.750，平均0.536；種群內(nèi)的Fis為-0.143 7～0.555 6；3個(gè)位點(diǎn)符合HW平衡(P>0.05)，2個(gè)顯著偏離HW平衡(0.01

表5 基于微衛(wèi)星標(biāo)記的白水河國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)林麝種群遺傳多樣性分析

3.5 保護(hù)區(qū)林麝種群數(shù)量估計(jì)

利用林麝個(gè)體識(shí)別結(jié)果，計(jì)算出樣線內(nèi)林麝的平均密度為4.39頭·km-2，按照保護(hù)區(qū)林麝適宜棲息地面積約248.31 km2(胡大明等，2019)計(jì)算，保護(hù)區(qū)內(nèi)林麝的種群數(shù)量約為1 090頭。

4 討論

物種遺傳多樣性水平與物種進(jìn)化潛力密切相關(guān)(Frankham，1995)，因此瀕危物種遺傳資源保護(hù)是物種保護(hù)的核心內(nèi)容。了解瀕危物種遺傳多樣性狀況，是制定有效保護(hù)措施的基礎(chǔ)。在瀕危動(dòng)物保護(hù)遺傳研究中，通常采用糞便、毛發(fā)等非損傷性取樣，獲得的DNA不但量少且質(zhì)量較差，因此獲得適于非損傷性取樣樣本DNA擴(kuò)增的遺傳標(biāo)記尤為重要。本研究基于基因組和發(fā)表的微衛(wèi)星位點(diǎn)，篩選到7個(gè)四堿基的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，在圈養(yǎng)林麝 1 d 的糞便中能穩(wěn)定擴(kuò)增，對(duì)白水河國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)獲得的46個(gè)林麝糞便DNA樣本擴(kuò)增結(jié)果顯示，在大部分樣本中能成功擴(kuò)增，并且基于 7個(gè)位點(diǎn)在46個(gè)樣本中鑒定到30只林麝個(gè)體，表明這些位點(diǎn)能夠應(yīng)用于基于糞便DNA的野生林麝保護(hù)遺傳學(xué)研究。

與微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)量相比，雜合度不受樣本數(shù)量的影響，是種群遺傳多樣性評(píng)估的較好參數(shù)。黃杰等(2013)利用7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)米亞羅圈養(yǎng)林麝進(jìn)行遺傳評(píng)估，平均HE和HO分別為0.854和0.782，王豆等(2019)使用13對(duì)微衛(wèi)星檢測(cè)巴山、秦嶺和川西林麝3個(gè)圈養(yǎng)群體，平均HE和HO分別為0.830 2和0.389 7，表明這些圈養(yǎng)種群保存了較高的遺傳多樣性水平。野生種群微衛(wèi)星多樣性水平還未見(jiàn)報(bào)道，本研究基于微衛(wèi)星檢測(cè)到白水河保護(hù)區(qū)林麝種群的平均HE和HO為0.602和0.563，處于中等水平。因使用的位點(diǎn)不同，種群間遺傳多樣性比較受限，因此在林麝的保護(hù)工作中，應(yīng)聯(lián)合相關(guān)部門(mén)開(kāi)展標(biāo)準(zhǔn)化微衛(wèi)星標(biāo)記系統(tǒng)的研究，建立共享平臺(tái)，方便種群間比較研究。

HW平衡是評(píng)價(jià)種群遺傳平衡的參數(shù)，處于遺傳平衡的種群不容易受到近交及外來(lái)種群的干擾(楊建寶等，2012)，種群相對(duì)穩(wěn)定。瀕危物種常常表現(xiàn)HW平衡偏離(Ardrenetal.，1999)，造成偏離的原因很多，如近親交配、種群遷移和遺傳漂變等。本研究中有4個(gè)位點(diǎn)偏離HW平衡，均為雜合不足，且表現(xiàn)為近親繁殖。保護(hù)區(qū)林麝種群表現(xiàn)這些遺傳特征的原因有待進(jìn)一步研究。

線粒體D-Loop是遺傳多樣性評(píng)估的常用分子標(biāo)記。保護(hù)區(qū)野生林麝種群線粒體控制區(qū)與先前報(bào)道的線粒體控制區(qū)富含AT的結(jié)論一致(Brownetal.，1986)，且G含量明顯低于其他堿基，表現(xiàn)出較明顯的堿基偏倚。Peng等(2008)對(duì)四川3個(gè)圈養(yǎng)林麝種群進(jìn)行了D-Loop多樣性評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)米亞羅種群的h和π分別為0.752和0.029 9、金鳳山種群的為0.830和 0.028 2、馬爾康種群的為0.836和0.056 8，馮慧等(2014)把陜西1個(gè)圈養(yǎng)種群和3個(gè)野生種群混合進(jìn)行D-Loop遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)了較高的單倍型多樣性(h=0.929)和核苷酸多樣性(π=0.044 24)，但這種混合種群研究可能高估遺傳多樣性水平。本研究在鑒定的30只個(gè)體中，成功擴(kuò)增了21只個(gè)體，鑒定了6個(gè)單倍型，h和π分別為0.721 3和0.023 44，比圈養(yǎng)種群低，可能因?yàn)槿︷B(yǎng)種群建群者來(lái)源于多個(gè)野生種群。

目前對(duì)于林麝野生種群遺傳多樣性評(píng)估報(bào)道較少，無(wú)法評(píng)估各野生種群間遺傳多樣性差異，為了更好保護(hù)林麝，今后應(yīng)大力開(kāi)展類(lèi)似研究工作，以全面了解我國(guó)林麝遺傳資源狀況。