程林，曾昭馳，呂植桐，郭洪興，王英永*，程松林*，曾利劍

(1.江西武夷山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，江西鉛山334500；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州510275；3.深圳市雙花木生物科技有限公司，廣東深圳518000)

琴蛙屬Nidirana是東洋界特有類群，該屬物種廣泛分布于東亞和東南亞的亞熱帶地區(qū)(Lyuetal.，2017)。目前，琴蛙屬已知15種，其中8種是近年內(nèi)發(fā)表的新物種(Lyuetal.，2017，2019，2020a，2020b；Lietal.，2019；Weietal.，2020)，所有物種在我國(guó)均有分布(Lyuetal.，2020a)。歷史上琴蛙屬物種的多樣性被嚴(yán)重低估。此前被廣泛記錄于我國(guó)華東、華南、西南乃至東南亞等地的彈琴蛙N.adenopleura種群(費(fèi)梁等，2012)，被重新進(jìn)行了分類修訂，真正的彈琴蛙只分布于我國(guó)臺(tái)灣、福建北部、浙江南部、江西中部等地(Lyuetal.，2017，2020b)。而分布于我國(guó)東南各地的其他琴蛙種群，被分別發(fā)表為新種：瑤琴蛙N.yaoica(Lyuetal.，2019)、粵琴蛙N.guangdongensis、孟聞琴蛙N.mangveni、湘琴蛙N.xiangica(Lyuetal.，2020b)。

江西武夷山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的琴蛙種群此前均被鑒定記錄為彈琴蛙(費(fèi)梁等，2012；王同亮等，2015)。本研究通過(guò)對(duì)保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)的琴蛙種群進(jìn)行采樣，結(jié)合形態(tài)比較和線粒體COⅠ基因的分子系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)這個(gè)琴蛙種群包含 2個(gè)物種——彈琴蛙和孟聞琴蛙。孟聞琴蛙系江西省兩棲類新記錄，這一發(fā)現(xiàn)將其分布區(qū)域由已知的浙江北部和東部向南擴(kuò)展至贛東北地區(qū)，為琴蛙屬的系統(tǒng)學(xué)和譜系地理學(xué)研究提供了重要資料。此外，在江西武夷山自然保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)發(fā)現(xiàn)彈琴蛙和孟聞琴蛙同域分布的現(xiàn)象，為該類群進(jìn)一步的物種形成與演化研究提供了重要的素材。

1 材料與方法

1.1 材料

11號(hào)標(biāo)本于2019年7月27、28日采自江西武夷山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)(117°39′30″～117°55′47″E，27°48′11″～28°00′35″N)。經(jīng)安樂(lè)死后，剪取大腿腹側(cè)肌肉樣品置于95%乙醇中保存，供后續(xù)分子系統(tǒng)發(fā)育研究；標(biāo)本使用5%甲醛溶液固定，5 h后轉(zhuǎn)移至70%乙醇溶液中保存；標(biāo)本及肌肉樣品均保存于中山大學(xué)生物博物館(SYS)。

1.2 形態(tài)鑒定與測(cè)量

使用游標(biāo)卡尺對(duì)11號(hào)標(biāo)本的形態(tài)特征進(jìn)行測(cè)量，精確到0.1 mm。測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)及形態(tài)特征鑒定均依照Lyu等(2017)的定義。

1.3 分子系統(tǒng)發(fā)育研究

參照Lyu等(2017)的方法，提取肌肉樣品的基因組DNA并利用PCR擴(kuò)增線粒體COⅠ基因片段。PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序，所得序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載琴蛙屬部分物種及其近緣類群拇棘蛙屬Babina物種的相關(guān)COⅠ基因序列(表1)。拇棘蛙屬物種作為構(gòu)建分子系統(tǒng)樹的外群，參照Lyu等(2017)的方法進(jìn)行序列比對(duì)、計(jì)算最佳核苷酸替代模型、基于P-distance距離模型計(jì)算各物種間的遺傳距離、采用最大似然法(maximum likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 本研究使用的所有樣品的采集信息、標(biāo)本憑證和GenBank登錄號(hào)

2 結(jié)果與分析

2.1 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增得到線粒體COⅠ基因序列11條，長(zhǎng)度569 bp。計(jì)算得到的用于系統(tǒng)發(fā)育分析的最佳核苷酸替代模型為GTR+G+I。

ML法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)顯示，采自江西武夷山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)的琴蛙樣品，屬于2個(gè)不同的譜系，且均得到顯著支持(>95%)。一個(gè)譜系代表真正的彈琴蛙譜系，包含分布于臺(tái)灣、福建北部、浙江南部、江西中部的種群和保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)的4號(hào)琴蛙樣品。保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)的另外7號(hào)琴蛙樣品與浙江北部和東部的孟聞琴蛙樣品聚為另一個(gè)譜系。

基于P-distance距離模型計(jì)算的遺傳距離(表2)顯示，保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)的彈琴蛙種群內(nèi)部的遺傳距離為0.4%；與福建北部、浙江南部、江西中部種群的遺傳距離為0.9%，略小于福建北部、浙江南部、江西中部種群間的遺傳距離(1.2%)。保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)的孟聞琴蛙種群內(nèi)部的遺傳距離為0.3%；與浙江北部和東部種群的遺傳距離為0.3%，略大于浙江北部和東部種群內(nèi)部的遺傳距離(0.1%)。保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)的彈琴蛙種群和孟聞琴蛙種群之間的遺傳距離為5.1%，與其物種間的遺傳距離(5.0%)相當(dāng)。

表2 基于線粒體COⅠ基因的琴蛙屬物種間遺傳距離

分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，11號(hào)琴蛙標(biāo)本屬于彈琴蛙和孟聞琴蛙2個(gè)物種。

2.2 形態(tài)描述

11號(hào)琴蛙標(biāo)本經(jīng)形態(tài)測(cè)量及檢視，4號(hào)標(biāo)本符合彈琴蛙的鑒定特征，7號(hào)標(biāo)本符合孟聞琴蛙的鑒定特征(表3)。彈琴蛙標(biāo)本鑒別特征為：(1)體型大；(2)指、趾端吸盤膨大，呈圓形；(3)除第1指外的各指、趾均具腹側(cè)溝；(4)指序?yàn)?<1<4<3；(5)后肢跟部重疊；(6)后肢貼體前伸時(shí)脛跗關(guān)節(jié)達(dá)眼吻之間；(7)體背后部皮膚粗糙，具密集疣粒；(8)雄性體背皮膚全部或后部具白色角質(zhì)刺；(9)具 1對(duì)咽下外聲囊；(10)第1指具一婚墊，婚刺不可見。孟聞琴蛙標(biāo)本鑒別特征為：(1)體型大；(2)指、趾端吸盤膨大，呈圓形；(3)第3、4指和各趾具腹側(cè)溝；(4)指序?yàn)?<2<4<3；(5)后肢跟部重疊；(6)后肢貼體前伸時(shí)脛跗關(guān)節(jié)達(dá)眼前角；(7)體背后部皮膚粗糙，具密集疣粒；(8)雄性體背皮膚全部或后部具白色角質(zhì)刺；(9)具1對(duì)咽下外聲囊；(10)第1指具一婚墊，婚刺不可見。

表3 采自江西武夷山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)的雄性彈琴蛙、孟聞琴蛙標(biāo)本的形態(tài)量度

孟聞琴蛙體型大，所采集的7號(hào)標(biāo)本均為雄性。頭體長(zhǎng)46.2～54.9 mm。頭長(zhǎng)大于頭寬，頭頂平坦。吻端鈍圓，側(cè)面觀突出于下唇，吻長(zhǎng)大于眼徑；吻棱明顯，頰部向內(nèi)略微凹陷；鼻孔位于吻、眼之間，靠近吻端；具頜腺及口角腺。頭頂眼間松果體顯著；眼間距小于鼻間距。瞳孔橢圓，水平；鼓膜清晰，接近眼，鼓膜徑小于眼徑。具犁骨棱和犁骨齒；舌末端具缺刻；具1對(duì)咽下外聲囊。

前肢較粗壯；指細(xì)長(zhǎng)，指序?yàn)?<2<4<3；指末端略膨大成吸盤，第3、4指具腹側(cè)溝，在末端不相接；無(wú)蹼，第2、3、4指內(nèi)外側(cè)具顯著緣膜；指腹面關(guān)節(jié)下瘤圓形、顯著凸起，各指基部均具顯著的指基下瘤；掌突3個(gè)，橢圓形、大而顯著。第1指基部外側(cè)具單個(gè)婚墊，無(wú)婚刺。

后肢相對(duì)粗壯，后肢貼體前伸時(shí)脛跗關(guān)節(jié)達(dá)眼前角，后肢垂直于體中軸線時(shí)跟部重疊；趾細(xì)長(zhǎng)，趾序?yàn)?<2<5<3<4；趾末端略膨大成長(zhǎng)而尖的吸盤，各趾均具顯著腹側(cè)溝，在末端不相接；腳蹼中等大小，各趾內(nèi)外側(cè)均具顯著緣膜；趾腹面關(guān)節(jié)下瘤圓形、顯著凸起；內(nèi)蹠突橢圓形，長(zhǎng)約為寬的3倍；外蹠突不顯著，小而圓。

頭及身體前端背面皮膚光滑；后背部皮膚粗糙，具密集疣粒，疣粒上具錐狀角質(zhì)刺；體側(cè)密集疣粒；前肢基部后方的體側(cè)具光滑的肩上腺；背側(cè)褶自上眼瞼后緣延伸至腹股溝上方，末端斷斷續(xù)續(xù)、較不顯著；上臂具不顯著皮膚棱和稀疏疣粒；后肢具顯著皮膚棱和密集、被角質(zhì)刺的疣粒。腹面皮膚光滑，腿后部及肛周圍具扁平疣。

孟聞琴蛙生活時(shí)體色多變，背面皮膚綠褐色、棕褐色或黃褐色。體表角質(zhì)刺白色；松果體淺黃褐色；體背具一黃色背中線，起自松果體，延伸至肛部上方，部分個(gè)體背中線斷續(xù)不完整。體側(cè)上部綠褐色，下部淺黃色，上部具黑色大圓斑；肩上腺米黃色或灰白色。前肢淺褐色，后肢深褐色，具深色橫紋。頰部及顳部棕色，鼓膜淺褐色，鼓膜后方具一黑色斑；虹膜上1/3灰褐色，下2/3紅棕色。咽下外聲囊粉色；胸腹部白色。

3 討論

Lyu等(2020b)基于結(jié)合形態(tài)比較、分子系統(tǒng)發(fā)育分析和聲學(xué)分析的綜合分類法，將分布于浙江北部和東部此前記錄為彈琴蛙的種群，描述發(fā)表為新物種孟聞琴蛙；而真正的彈琴蛙僅分布于我國(guó)臺(tái)灣、福建北部、浙江南部、江西中部等地。

本文報(bào)道孟聞琴蛙在江西武夷山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)的新分布，將其分布區(qū)域由已知的浙江東北部向西南方向擴(kuò)展至江西東北部(圖3)。另一方面，此前福建北部武夷山市、浙江南部景寧畬族自治縣已報(bào)道有彈琴蛙分布(Lyuetal.，2017)，而本研究首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道彈琴蛙和孟聞琴蛙存在同域分布的現(xiàn)象(圖3,圖4)。因此，需要對(duì)江西東北部武夷山脈西北坡、浙江中部金衢盆地以及浙江南部仙霞嶺山區(qū)等地開展深入、全面的調(diào)查，以厘清這2個(gè)物種在該區(qū)域的具體分布格局。

琴蛙屬物種的同域分布現(xiàn)象并不常見，此前已報(bào)道過(guò)的僅有2例，即南昆山琴蛙N.nankunensis和粵琴蛙同域分布于廣東南昆山(Lyuetal.，2017，2020b)、琉球琴蛙N.okinavana和彈琴蛙同域分布于臺(tái)灣南投縣蓮花池(林思民，個(gè)人通訊)。其中，南昆山琴蛙和粵琴蛙的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系相去甚遠(yuǎn)，且二者具有顯著不同的形態(tài)特征和生態(tài)習(xí)性(Lyuetal.，2017，2020b)；琉球琴蛙與彈琴蛙雖然在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上是姐妹物種，但是二者也可通過(guò)形態(tài)特征和生態(tài)習(xí)性顯著地進(jìn)行區(qū)分(Matsui & Utsunomiya，1983；Lyuetal.，2020b)。南昆山琴蛙和粵琴蛙、以及琉球琴蛙和彈琴蛙的同域分布，主要是地理分布區(qū)域的重疊，由于生態(tài)習(xí)性的差異(主要表現(xiàn)為：南昆山琴蛙和琉球琴蛙有筑巢求偶行為，并直接產(chǎn)卵于泥巢中；而粵琴蛙和彈琴蛙不筑巢，直接于靜水中求偶并產(chǎn)卵)，其對(duì)生態(tài)位及微生境的選擇并不完全相同。

本文報(bào)道的江西武夷山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)彈琴蛙和孟聞琴蛙同域分布的現(xiàn)象，與上述情況略有不同：彈琴蛙和孟聞琴蛙的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較為接近，且二者在形態(tài)特征上十分接近；而且二者均不筑巢求偶，其生態(tài)習(xí)性及生態(tài)位均無(wú)差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，部分彈琴蛙和孟聞琴蛙的個(gè)體采自同一處?kù)o水中(如彈琴蛙SYS a008088和孟聞琴蛙SYS a008089、彈琴蛙SYS a008106和孟聞琴蛙SYS a008105)。作為2個(gè)同域生活的近緣物種，彈琴蛙和孟聞琴蛙之間保持了穩(wěn)定的線粒體基因的遺傳分化。而Lyu等(2020b)的研究指出，這 2個(gè)物種可通過(guò)求偶鳴聲的不同進(jìn)行區(qū)分，但該研究并未涉及到同域分布的種群。因此，江西武夷山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)的彈琴蛙和孟聞琴蛙是一個(gè)值得長(zhǎng)期深入研究的案例，對(duì)揭示兩棲類物種的成種機(jī)制將會(huì)有重要的指導(dǎo)意義。