龐 欣，王乙媛，沈明鑫，朱 躍

（蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 215008）

辣椒是中國種植面積最大，加工、消費(fèi)功能最多的蔬菜，也是極受歡迎的的調(diào)味品[1]，同時它還具有很高的藥用價值[2]。辣椒素類是辣椒的重要次生代謝物，辣椒素與二氫辣椒素是辣椒辣味的主要來源[3]。辣椒素是辣椒的主要活性成分，它不僅可以抗疲勞[4]，還具有止痛、健胃、降脂、抵御癌癥等功效[2,5-6]。最近，科研工作者發(fā)現(xiàn)辣椒素在干細(xì)胞增殖、分化方面有一定的作用，并開始探究其中的機(jī)理[7]。因此，研究辣椒素合成途徑的調(diào)控機(jī)理就顯得尤為重要，但目前對這方面的研究還較少。2016 年，謝文忠[8]把通過克隆得到的屬于R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族的MYB 轉(zhuǎn)錄因子的基因命名為Ccmyb，并推測這個基因是MYB 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，通過一系列作用，激活辣椒素合成酶基因的表達(dá)，從而調(diào)控辣椒素的合成；周欣[9]通過對MYB 轉(zhuǎn)錄因子克隆，并對其功能進(jìn)行分析，推測辣椒素含量的合成可能受到多個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。2016 年，朱張生等[10]定位到了Capsaicinoid1 一個數(shù)量性狀位點(diǎn)，這個位點(diǎn)所在的染色體區(qū)域由6 個MYB 轉(zhuǎn)錄因子和2 個假基因構(gòu)成，包括轉(zhuǎn)錄因子Capana07g001604。王紅娟等[11]通過對2 種不同辣度的辣椒的轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定出了可能參與辣椒素含量合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子MYB。2020年，Jin Wang 等[12]對辣椒的R2R3-MYB 全基因組進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)MYB 轉(zhuǎn)錄因子在辣椒素合成過程中起關(guān)鍵作用，并推測有6 個候選CaR2R3-MYB 基因參與調(diào)控辣椒素和二氫辣椒素的合成，Capana07g001604正是參與辣椒素生物合成的候選CaR2R3-MYB 基因。

目前，關(guān)于辣椒素含量合成的轉(zhuǎn)錄因子的研究大多集中于MYB31 上，且有研究表明是MYB 轉(zhuǎn)錄因子MYB31 的自然變異導(dǎo)致了辣椒素的形成，且特異表達(dá)位點(diǎn)是在胎座中[10,13]。但關(guān)于MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因簇的其他基因的研究并不多。因此，為了明確轉(zhuǎn)錄因子Capana07g001604 是否對辣椒素含量的合成有影響，以4 個辣椒株系L0125、L2541、L3025、L4589 為試驗材料，來研究辣椒素的含量變化與Capana07g001604基因表達(dá)的關(guān)系，為之后進(jìn)一步研究MYB 轉(zhuǎn)錄因子簇在辣椒含量合成中所起的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

辣椒株系：L0125、L2541、L3025、L4589。

1.2 試驗設(shè)計

分別將4 個辣椒株系等量的種子播種于裝有濕潤育苗基質(zhì)的育苗盤內(nèi)，每個孔播種2 粒，并置于培養(yǎng)箱內(nèi)育苗，當(dāng)幼苗長至5～6 片真葉時，將其移栽至塑料大棚內(nèi)進(jìn)行定植和管理。

待植株長出花苞后，分別采取株系L4589 的0.25cm、0.50cm、0.70cm、0.80cm、1.00cm、1.20cm、1.45cm 的花，生長至10d、15d、20d、25d、30d、35d、40d、45d、50d、55d、60d 的果實，發(fā)育至20d、25d、30d、35d、40d、45d、50d、55d、60d 種子與胎座（由于果實產(chǎn)生種子的初期10d、15d 內(nèi)，果實內(nèi)的種子與胎盤還未分開，無法分清究竟是種子還是胎盤，故此次試驗不計入），用RT-PCR 法測定轉(zhuǎn)錄因子Capana07g001604 表達(dá)情況。

待辣椒開花結(jié)束后，分別采取4 個辣椒株系L0125、L2541、L3025、L4589 生長至10d、20d、30d、40d、50d、60d 的果實，用HPLC 法測定辣椒果實中辣椒素與二氫辣椒素的含量。

設(shè)置3 個重復(fù)，每個重復(fù)各取5 個樣品。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 辣椒素與二氫辣椒素的提取與測定。分別取4 個株系6 個時期辣椒果實中的胎座組織，由于高溫會影響辣椒素類物質(zhì)的穩(wěn)定性[14]，故用HPLC 法測定凍干胎座組織中辣椒素與二氫辣椒素的含量，具體方法參考曹莉等[15]HPLC 法。

1.3.2 Capana07g001604 表達(dá)含量的測定。使用RNAsimple Total RNA Kit 總RNA 提取試劑盒（Tiangen），依據(jù)說明書操作，提取株系L4589 生長發(fā)育不同大小的花和不同時期的果實、種子、胎座的總RNA；再用FastKing RT Kit（With gDNase）FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒（Tiangen）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。接著對所轉(zhuǎn)錄好的cDNA 用RT-PCR 法進(jìn)行擴(kuò)增分析。使用CaREV05（CA00g79660）作為內(nèi)參基因進(jìn)行基因表達(dá)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsft Office Excel 2010 整理數(shù)據(jù)，進(jìn)行誤差分析，并用Microsft Office Excel 2010 繪制成圖。

2 結(jié)果及分析

2.1 不同辣椒株系不同時期凍干胎盤組織中辣椒素與二氫辣椒素含量變化

4 個辣椒株系L0125、L2541、L3025、L4589 果實發(fā)育過程中胎座組織的辣椒素與二氫辣椒素含量變化趨勢是相同的，均呈先增加后減少的趨勢，且都在40d 時兩者的含量達(dá)到最高，第60d 時兩者的含量仍要高于第20d 的含量（圖1、圖2），但在第10d 時并未檢測到辣椒素與二氫辣椒素的含量，這說明辣椒素類物質(zhì)在胎座中的合成是從第10d 之后開始的，大量的研究表明，辣椒素類物質(zhì)在胎座中是從15d 左右開始的，這與之前科研工作者的研究發(fā)現(xiàn)是一致的，都是先上升至高峰再下降，與辣椒果實的生理變化有一定的聯(lián)系[16]。故辣椒素類的合成表達(dá)具有明顯的階段特異性。每個株系的辣椒素含量都明顯高于二氫辣椒素的含量，在這4 個株系中，L4589 的辣椒素含量要明顯高于其他株系，說明辣椒素在株系L4589 中的含量更高，相較其他3 個株系，果實要更辣一些，即轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄水平更高，合成的辣椒素類物質(zhì)更多。

圖1 不同辣椒株系凍干胎盤組織中不同果實發(fā)育時期辣椒素含量

圖2 不同辣椒株系凍干胎盤組織中不同果實發(fā)育時期二氫辣椒素含量

2.2 轉(zhuǎn)錄因子Capana07g001604 在花果實、種子、胎座不同時間表達(dá)含量的變化

由圖3 可知，轉(zhuǎn)錄因子Capana07g001604 的表達(dá)量并未呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，在果實和種子中均是前期表達(dá)量較高，后期表達(dá)水平明顯降低，而在胎座中整體上隨著胎座生長發(fā)育的變化，表達(dá)水平是逐漸提高的；轉(zhuǎn)錄因子Capana07g001604 在果實中的表達(dá)水平最高，在種子中的表達(dá)水平最低，且同一時期在果實中的表達(dá)含量整體上要高于在種子與胎座中的表達(dá)含量，并未在胎座中特異性表達(dá)，這與轉(zhuǎn)錄因子MYB31 的作用機(jī)理是不同的[10]。

圖3 實時熒光定量PCR 分析轉(zhuǎn)錄因子Capana07g001604 在果實、種子、胎座生長發(fā)育過程中不同時間段的表達(dá)情況

3 結(jié)論與討論

辣椒素類物質(zhì)是辣椒特有的次生代謝物，是評判辣椒品質(zhì)的重要指標(biāo)，在醫(yī)藥等方面也有廣泛的前景。辣椒辣味的強(qiáng)弱是數(shù)量性狀的遺傳[17-18]，但會受多方面因素的影響，基因、環(huán)境、辣椒自身激素調(diào)節(jié)等都會影響到辣椒素類物質(zhì)的含量[19-20]。品種不同，辣椒素與二氫辣椒素的含量有很大的差異。在試驗中，選用辣椒的4 個株系L0125、L2541、L3025、L4589 作為研究材料，測定其胎座中辣椒素與二氫辣椒素的含量，并以L4589 作為研究材料，來測定轉(zhuǎn)錄因子Capana07g001604 在果實、種子、胎座不同發(fā)育時間的表達(dá)情況。結(jié)果表明不同株系的辣椒素與二氫辣椒素在胎座中的含量是隨著胎座的生長發(fā)育在不斷變化的，總體趨勢是先升高后降低，兩者均在40d 時含量達(dá)到最高，當(dāng)胎座初發(fā)育至10d 時，并未檢測到辣椒素與二氫辣椒素的含量，20d 時均可檢測到辣椒素與二氫辣椒素的存在，且辣椒素的含量要高于二氫辣椒素的含量。轉(zhuǎn)錄因子Capana07g001604 在株系L4589 果實、種子、胎座中的表達(dá)水平是不同的，通過比較可以發(fā)現(xiàn)，該基因總體上在果實中的表達(dá)水平要高于其它部位，表達(dá)情況并未出現(xiàn)很明顯的規(guī)律性變化。這可能與轉(zhuǎn)錄因子作用的機(jī)理不同有關(guān)，如備受關(guān)注的轉(zhuǎn)錄因子MYB31 只在胎座中特異性表達(dá)，且受發(fā)育階段的調(diào)控[10]。

目前，關(guān)于辣椒中辣椒素含量的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理的研究越來越受到科研人員的重視。2021 年，赫衛(wèi)等[21]對辣椒R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了全基因組鑒定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Capana07g001604 含有2 個內(nèi)含子，位于R2 的14-61 區(qū)域，R3 的67-112 區(qū)域，并依據(jù)進(jìn)化樹Capana07g001603/Capana07g001604 序列相似性達(dá)到了82.45%，從而推測辣椒MYB 家族在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了串聯(lián)重復(fù)事件[21]。試驗對Capana07g001604 在辣椒果實、種子、胎座中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，但其究竟是如何發(fā)揮作用的還尚不清晰，有待進(jìn)一步探索研究。