楊國良，楊君，唐君輝，劉政

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科，重慶 400037)

精準(zhǔn)醫(yī)療是以個(gè)體化醫(yī)療為中心，應(yīng)用各類醫(yī)學(xué)前沿技術(shù)實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診斷與靶向治療的新型醫(yī)療模式，自2015年提出即在世界范圍內(nèi)引起廣泛關(guān)注，在此背景下超聲靶向微泡破壞技術(shù)(ultrasound-targeted microbubbles destruction，UTMD)應(yīng)用不斷興起[1]。該技術(shù)是一種安全物理靶向治療方式，以微泡殼或核為載體包裹藥物或基因等物質(zhì)，經(jīng)靜脈注射后行超聲觀察微泡進(jìn)入靶區(qū)并予以一定條件下輻照，使微泡發(fā)生空化效應(yīng)產(chǎn)生破裂，從而達(dá)到定點(diǎn)釋放的目的，同時(shí)其產(chǎn)生的聲孔效應(yīng)可短暫對(duì)靶組織區(qū)域細(xì)胞膜形成小孔，改變靶區(qū)組織結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，增加組織細(xì)胞的通透性，使藥物、基因治療物質(zhì)更易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步促進(jìn)該處藥物吸收及其他外源性藥物的靶向運(yùn)輸，加之微泡本身具備精準(zhǔn)成像功能，即在分子水平實(shí)現(xiàn)疾病顯影診斷的同時(shí)進(jìn)行靶向治療，契合了精準(zhǔn)醫(yī)療背景下個(gè)體化醫(yī)療與精準(zhǔn)給藥等關(guān)鍵問題[2]。現(xiàn)就UTMD技術(shù)特性、作用機(jī)制、技術(shù)應(yīng)用、安全性以及不足等方面進(jìn)行綜述。

1 微泡技術(shù)特性

UTMD技術(shù)核心即微泡，通過改變微泡的各種參數(shù)(如微泡大小、種類、外殼材質(zhì)、核心氣體、靶向配體與傳遞物質(zhì))可以增強(qiáng)治療效果[3]，如微泡粒徑大小可以決定顯影部位，殼膜材料與修飾物決定穩(wěn)定性及靶向功能，以及改變或調(diào)解相關(guān)參數(shù)以適應(yīng)更多應(yīng)用場景。

1.1結(jié)構(gòu)構(gòu)成 現(xiàn)代微泡絕大多數(shù)由氣核和外殼兩部分組成[4]。氣核一般是具有低溶解性的惰性氣體，如全氟化碳、全氟丙烷。早期研究使用氧氣、氮?dú)獾葰怏w作為微泡的氣核，但因可溶性高，經(jīng)靜脈注入微泡后擴(kuò)散明顯從而無法在血液中達(dá)到穩(wěn)定且長時(shí)間存留。利用全氟化碳等重氣體溶解度低的特性，能顯著延長微泡在血液中的穩(wěn)定性和存留時(shí)間[5]。外殼需具有較好的穩(wěn)定性[6]，如磷脂殼外表面具有較好的親水性，內(nèi)表面又具有親油性，能夠形成穩(wěn)定氣核單涂層；脂類殼具有高度的順應(yīng)性，易于在超聲激勵(lì)下發(fā)生膨脹、壓縮、破碎和重新封裝，且脂類殼還有多樣的選擇性，可與基因、藥物、蛋白質(zhì)及其他化合物質(zhì)結(jié)合；蛋白質(zhì)殼以白蛋白作為微泡膜材料，具有安全無毒、易于制備等優(yōu)點(diǎn)，多用于增強(qiáng)超聲顯像與轉(zhuǎn)運(yùn)靶向配體DNA等方面[7-8]。傳統(tǒng)微泡直徑多為1～8 μm，而納米微泡的粒徑更小，為10～200 nm，納米微微泡又分為納米粒、納米液滴、納米泡與聲敏脂質(zhì)體[9]，可通過血管間隙直接進(jìn)入病變處組織內(nèi)進(jìn)行顯像，彌補(bǔ)了微米級(jí)別的微泡不能穿過血管內(nèi)皮屏障的劣勢。

1.2微泡制備 利用不同殼膜材料、氣體核心、靶向修飾物在不同條件參數(shù)下制備微泡，使其具備多種功能及應(yīng)用于不同場景。微泡制備原理主要分為兩類：一是將藥物或基因與微泡膜殼材料混合一并制備來制作荷載微泡；二是利用靜電吸附原理將帶負(fù)電藥物或基因吸附在陽離子脂質(zhì)或陽離子聚合物為膜殼的微泡表面[10]。制備方法又細(xì)分為機(jī)械攪拌法、復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法、探針超聲法、噴霧干燥法、薄膜水化法等。機(jī)械攪拌法主要用于制備聲學(xué)活性微泡和磷脂殼微泡；復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法主要用于制備聚合物殼微泡，同樣可以制備磷脂殼微泡；探針超聲法主要制備蛋白質(zhì)外殼結(jié)構(gòu)微泡，此類微泡外殼有較好的穩(wěn)定性；噴霧干燥法可制備蛋白質(zhì)、磷脂及聚合物等微泡殼；薄膜水化法適用于微泡膜中含有脂質(zhì)、硬脂酸鹽、聚乙二醇等成分的微泡制備[11-13]。

1.3微泡優(yōu)勢 利用微泡作為載體攜帶治療藥物或基因等物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至靶區(qū)具有多種優(yōu)勢，理想情況下的微泡需具備以下條件：①安全低毒和低免疫原性，微泡可隨機(jī)體代謝排出體外且不會(huì)對(duì)正常代謝循環(huán)產(chǎn)生影響，能夠降低全身給藥的毒性，減少全身反應(yīng)，降低免疫原性反應(yīng)[14]；②運(yùn)轉(zhuǎn)穩(wěn)定和重復(fù)性高，微泡在機(jī)體內(nèi)能夠順利通過體、肺循環(huán)且在運(yùn)轉(zhuǎn)過程中保持良好的穩(wěn)定性以及較高可重復(fù)性[15]；③具有良好的特異性和靶向性，利用各類殼、膜材料及不同制備方法予以靶向功能來修飾微泡，以攜帶不同藥物或基因等物質(zhì)，使其具備主動(dòng)靶向或被動(dòng)靶向的功能[16]；④成像效果良好且穩(wěn)定，能夠提高灰階圖像及多普勒信號(hào)，達(dá)到提升顯影質(zhì)量以及減少衰減尾像的效果；⑤容易制備及保存，載藥微泡制作工藝相對(duì)容易，存貯環(huán)境要求不高且隨用隨配。經(jīng)靜脈注射操作簡單且對(duì)機(jī)體創(chuàng)傷較??；以常規(guī)診斷超聲為輔，可邊診斷邊治療，中間步驟少，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)靶區(qū)域的成像與遞送藥物一體化，滿足診療一體化基本要求[17]。

2 UTMD的可能機(jī)制

利用微泡作為有效載體包裹藥物、基因等遞送至靶區(qū)并給予超聲輻照，使微泡發(fā)生“爆破”，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)遞送。此過程有熱效應(yīng)、空化效應(yīng)、聲孔效應(yīng)、細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)與炎癥反應(yīng)、聲輻射力等共同作用，使組織內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一系列改變，從而促進(jìn)微泡所荷載的治療物質(zhì)到達(dá)目標(biāo)區(qū)域[18]。

2.1熱效應(yīng) 超聲所產(chǎn)生的聲波在介質(zhì)中傳播引起質(zhì)點(diǎn)震動(dòng)和質(zhì)點(diǎn)間摩擦，使介質(zhì)溫度升高的作用即為超聲熱效應(yīng)[19]，熱效應(yīng)在UTMD中應(yīng)用主要表現(xiàn)為促進(jìn)靶區(qū)血液循環(huán)、增加動(dòng)能、促進(jìn)藥物擴(kuò)散與吸收等。Chen等[20]研究顯示，熱效應(yīng)能夠增加血管通透性，使細(xì)胞內(nèi)氧自由基增多，間接提高細(xì)胞膜通透性。超聲所產(chǎn)生的熱效應(yīng)還會(huì)使細(xì)胞膜升溫，能夠改變細(xì)胞膜表面的磷脂流動(dòng)性，協(xié)同提高細(xì)胞膜通透性，以促進(jìn)靶區(qū)域組織細(xì)胞攝取藥物，但同時(shí)隨著聲強(qiáng)或頻率等參數(shù)的增加使介質(zhì)或組織溫度相應(yīng)升高，其可能影響所荷載治療物質(zhì)的活性甚至引起靶區(qū)組織細(xì)胞損傷，因此應(yīng)用UTMD技術(shù)進(jìn)行診療時(shí)，需選擇合理參數(shù)以避免治療物質(zhì)失活及熱損傷。

2.2空化效應(yīng) 液體中微氣泡在不同強(qiáng)度聲場負(fù)壓相中產(chǎn)生空化效應(yīng)，又分為瞬態(tài)空化和穩(wěn)態(tài)空化。瞬態(tài)空化是指微泡在一定強(qiáng)度聲場下極短時(shí)間內(nèi)發(fā)生微泡急劇壓縮破裂并產(chǎn)生高溫、高壓、微射流和沖擊波，牽拉血管內(nèi)皮細(xì)胞并增大細(xì)胞間隙；穩(wěn)態(tài)空化是指微泡在低頻超聲負(fù)相聲場中開始膨脹，而后在正相聲場中收縮，反復(fù)震蕩至“爆破”產(chǎn)生一定的輻射壓與微射流，增加細(xì)胞膜的通透性[21]?？栈?yīng)是UTMD技術(shù)的關(guān)鍵，無論是瞬態(tài)空化還是穩(wěn)態(tài)空化都能夠促進(jìn)載藥微泡向血管外靶組織區(qū)域釋放，但同時(shí)微泡的半徑、氣核、殼膜、超聲參數(shù)、環(huán)境壓力、介質(zhì)表面張力、溫度等參數(shù)均可以影響空化效應(yīng)的效果[22]。因此要實(shí)現(xiàn)UTMD技術(shù)的最佳效果，仍需大量工作來調(diào)試眾多參數(shù)，以達(dá)到最佳匹配條件。

2.3聲孔效應(yīng) 微泡發(fā)生空化效應(yīng)所產(chǎn)生的化學(xué)、機(jī)械及熱效應(yīng)可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜表面形成可逆性細(xì)小開口，開口因孔徑不同可持續(xù)數(shù)秒至數(shù)十秒，細(xì)胞間隙增寬又使細(xì)胞通透性增加，進(jìn)一步促進(jìn)藥物進(jìn)入靶區(qū)域組織細(xì)胞內(nèi)[23]。研究顯示，在相同微泡條件下瞬態(tài)空化在細(xì)胞膜上產(chǎn)生的聲孔持續(xù)時(shí)間較穩(wěn)態(tài)空化更長，且恢復(fù)時(shí)間更長，但兩種效應(yīng)均能促進(jìn)微泡所荷載藥物進(jìn)入靶區(qū)組織，增加藥物濃度[24]。聲孔效應(yīng)是在微泡發(fā)生空化后所產(chǎn)生的一系列改變中最重要的效應(yīng)之一，也是UTMD能夠靶向遞送的關(guān)鍵機(jī)制。

2.4細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)與炎癥反應(yīng) 超聲輻照微泡可刺激細(xì)胞吞噬功能，在過氧化氫的作用下促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，而后鈣離子所需鉀離子的通道開放，刺激細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，增加細(xì)胞攝取藥物，而微泡在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中阻擋酶對(duì)微泡壁有效荷載的破壞，同時(shí)鈣離子內(nèi)流還可以促進(jìn)細(xì)胞包吞作用。Lentacker等[25]研究顯示，微泡震動(dòng)過程中可使流場產(chǎn)生聲微流，細(xì)胞膜產(chǎn)生形變以致細(xì)胞骨架重新排列，機(jī)械感應(yīng)器對(duì)下游信號(hào)通路產(chǎn)生影響，刺激細(xì)胞內(nèi)吞及分泌作用。此外因組織受損，體內(nèi)啟動(dòng)炎癥反應(yīng)機(jī)制，大量T淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞等在靶組織區(qū)域聚集，從而對(duì)受損組織進(jìn)行清除和修補(bǔ)。炎癥反應(yīng)與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)共同促進(jìn)治療物質(zhì)向靶區(qū)遞送，進(jìn)而完成一系列高精度遞送藥物過程。

2.5聲輻射力 超聲波在介質(zhì)中傳播時(shí)產(chǎn)生作用力使介質(zhì)中的微粒沿聲波方向發(fā)生位移，吸收聲波后的微粒作為第二聲源，使周邊微粒發(fā)生共振或相互吸引。Zhao等[26]發(fā)現(xiàn)在聲輻射力作用下，血管內(nèi)微泡會(huì)更多停留在輻照點(diǎn)位置，因此聲輻射力作用可驅(qū)動(dòng)微泡向血管內(nèi)壁靶點(diǎn)位置黏附、集聚。Frinking等[27]將聲輻射力與腫瘤靶向造影劑BR55聯(lián)合應(yīng)用于小鼠前列腺癌模型以研究超聲成像效果，結(jié)果顯示聲輻射力能夠使腫瘤與靶向造影劑結(jié)合更緊密，產(chǎn)生的圖像效果更清晰。表明聲輻射力可以協(xié)助提高成像效果與診療精準(zhǔn)度，有望成為超聲分子影像未來發(fā)展的方向。

3 UTMD技術(shù)的應(yīng)用

UTMD技術(shù)實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療與無創(chuàng)診療的基礎(chǔ)是通過超聲微泡造影劑荷載治療物質(zhì)遞送至靶區(qū)組織或器官，在超聲輻照的作用下定點(diǎn)釋放，從而達(dá)到診療目的。而微泡所能荷載遞送的治療物質(zhì)種類繁多且治療應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，目前多用于腫瘤、心腦血管疾病、開放血腦屏障等方面。

3.1藥物遞送 UTMD技術(shù)能夠高效率運(yùn)輸與定點(diǎn)釋放荷載藥物，不僅能提高靶區(qū)組織藥物濃度，還可明顯降低藥物的毒副作用。早期研究多集中在血管內(nèi)游離藥物遞送，利用超聲激勵(lì)微泡并產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)以促進(jìn)血管內(nèi)游離藥物向靶區(qū)域組織遞送，提升靶區(qū)藥物濃度，提高治療效果，其中較為典型如Yoshida等[28]將阿霉素藥物加入到人單核細(xì)胞淋巴瘤U937的細(xì)胞培養(yǎng)液中并用超聲進(jìn)行輻照，結(jié)果顯示經(jīng)輻照后的細(xì)胞藥物攝取率和死亡率均明顯增加。而孟慶齊等[29]利用低強(qiáng)度超聲聯(lián)合阿霉素治療人白血病細(xì)胞株K562/A02小鼠模型，結(jié)果顯示低強(qiáng)度超聲在不改變細(xì)胞膜P糖蛋白表達(dá)的情況下，能提高K562/A02細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。超聲增強(qiáng)游離藥物遞送的主要機(jī)制是空化作用發(fā)生的聲孔效應(yīng)增加細(xì)胞膜的通透性從而達(dá)到增強(qiáng)藥效的目的，但游離藥物聯(lián)合超聲遞送的缺點(diǎn)是無法判斷藥物在靶組織區(qū)域的分布情況。

3.1.1微米級(jí)載藥微泡 為了彌補(bǔ)游離藥物遞送方法的不足，研究人員開始將治療物質(zhì)荷載至超聲造影劑上，并利用超聲空化效應(yīng)在靶區(qū)擊破微泡以達(dá)到增加靶區(qū)藥物濃度的目的。如易品詩等[30]利用穿膜肽和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1修飾的載多西紫杉醇超聲造影劑應(yīng)用于兔VX2舌癌頸淋巴轉(zhuǎn)移模型，證實(shí)經(jīng)穿膜肽和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1修飾微泡的腫瘤抑制率和腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于空白微泡組和單純藥物組，為臨床治療舌癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供了參考。燕翼等[31]采用“生物素-親和素”橋接法制作攜帶唾液酸化路易斯靶向微泡和同型對(duì)照微泡，注射到心肌缺血再灌注小鼠模型，結(jié)果顯示，與對(duì)照微泡相比，攜帶唾液酸化路易斯靶向微泡可以顯著增強(qiáng)心肌缺血區(qū)域顯影，證明載藥微泡對(duì)心肌缺血再灌注損傷的組織具有靶向探查的優(yōu)勢。唐勇等[32]應(yīng)用低頻超聲與載鏈激酶微泡造影劑共同作用于體外血栓模型，結(jié)果顯示溶栓藥物不僅對(duì)微泡穩(wěn)定性影響輕微，且可明顯促進(jìn)深靜脈血栓溶解。但以上研究所構(gòu)建的載藥微泡直徑多為微米級(jí)，不僅載藥量有限，其穩(wěn)定性受環(huán)境、溫度、參數(shù)等條件的限制，所以研發(fā)兼具荷載量大、穩(wěn)定性強(qiáng)的載藥微泡成為亟待解決的問題。

3.1.2納米級(jí)微泡載體復(fù)合物 盡管載藥微泡可以充當(dāng)藥物載體，同時(shí)還可以作為空化核達(dá)到促進(jìn)空化效應(yīng)的目的，但微米級(jí)載藥微泡存在荷載藥量少以及穩(wěn)定性差等弊端。針對(duì)此類問題，凌茜[33]利用親和素-生物素法將生物素抗6次跨膜前列腺上皮抗原抗體1與生物素納米微泡鏈接，成功制備出荷載前列腺上皮抗原抗體1靶向納米微泡造影劑，通過對(duì)微泡表面修飾，該造影劑可在體外與前列腺PC3細(xì)胞特異性靶向結(jié)合，具有高靶向性及增強(qiáng)顯像的作用。羅婉賢等[34]利用天然大分子肝素荷載紫杉醇制備出具有高載藥性、高穿膜作用的納米級(jí)微泡，并證實(shí)該納米微泡對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有敏感的抗腫瘤活性，能更好地發(fā)揮抗腫瘤藥物的作用。因此，與常規(guī)微米級(jí)微泡相比，納米級(jí)微泡復(fù)合物在載藥量與穩(wěn)定性上均有所提升。

3.2基因遞送 基因治療是將正常基因細(xì)胞導(dǎo)入靶區(qū)域組織細(xì)胞以糾正或補(bǔ)償異?；蛉毕莼蛞赃_(dá)到治療疾病的目的。UTMD技術(shù)可以協(xié)助將基因安全且高效地導(dǎo)入靶區(qū)細(xì)胞并促進(jìn)其表達(dá)轉(zhuǎn)染，目前有以下幾種方法。

3.2.1基因?qū)蛐悦盖疤狍w藥物治療 也稱為藥物前體激活基因治療或自殺基因治療，其原理是將細(xì)菌、病毒等基因?qū)氚袇^(qū)腫瘤細(xì)胞內(nèi)，通過該基因編碼特殊的酶，將無毒性的藥物前體催化成細(xì)胞毒性物質(zhì)，干擾細(xì)胞DNA合成，達(dá)到腫瘤細(xì)胞凋亡的目的，以單純皰疹病毒胸苷激酶、腺病毒聯(lián)合丙氧鳥苷、胞嘧啶脫氨酶和5-氟胞嘧啶自殺基因系統(tǒng)最為常見。Li等[35]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌的基因治療中，運(yùn)用UTMD聯(lián)合微泡介導(dǎo)單純皰疹病毒胸苷激酶/丙氧鳥苷和胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶在MCF-7細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)轉(zhuǎn)染，其腺病毒介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子受體啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)自殺基因在MCF-7細(xì)胞中產(chǎn)生特異性表達(dá)，具有協(xié)同殺傷腫瘤的作用?；?qū)蛐悦盖疤狍w藥物治療方法因高轉(zhuǎn)染率及強(qiáng)大的腫瘤殺傷作用，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

3.2.2基因替代 基因替代是指將抑癌基因轉(zhuǎn)染給腫瘤細(xì)胞，以糾正基因缺陷達(dá)到治療目的，也稱為替代性基因治療。Guo等[36]將抑癌基因p53聯(lián)合微泡造影劑，經(jīng)超聲引導(dǎo)下對(duì)乳腺癌大鼠進(jìn)行瘤內(nèi)注射并實(shí)施超聲激勵(lì)，結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞大量退行性壞死，腫瘤細(xì)胞生長抑制率高達(dá)62.62%，與單獨(dú)p53基因?qū)虢M相比，p53基因?qū)?超聲造影劑+超聲激勵(lì)組p53表達(dá)更高，能夠引起腫瘤細(xì)胞阻滯在G2期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。劉海艷[37]以UTMD技術(shù)增強(qiáng)野生抑癌基因wtp53轉(zhuǎn)染鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞來抑制腫瘤發(fā)展，結(jié)果轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的wtp53信使RNA表達(dá)量增多，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡百分比明顯增高且wtp53基因表達(dá)穩(wěn)定。UTMD技術(shù)為膠質(zhì)瘤的基因治療提供了新方向，同時(shí)也證明了以基因荷載的微泡在超聲作用下發(fā)揮協(xié)同和激勵(lì)的作用。

3.2.3RNA干擾 RNA干擾是指具有同源雙鏈RNA觸發(fā)轉(zhuǎn)錄功能后的基因沉默現(xiàn)象，該現(xiàn)象可引起該基因編碼信使RNA降解來抑制其功能，但細(xì)胞攝取率極低且穩(wěn)定性差，限制了RAN干擾技術(shù)的應(yīng)用。Zhao等[38]研究發(fā)現(xiàn)，通過UTMD技術(shù)聯(lián)合叉頭框蛋白A1轉(zhuǎn)染干擾小RNA荷載卟啉微泡治療乳腺癌具有良好的治療效果，低頻超聲聯(lián)合微泡可以促進(jìn)干擾小RNA轉(zhuǎn)染與卟啉攝取，表明超聲聯(lián)合微泡輻照能夠提高雙鏈RNA的攝取率及體內(nèi)血液遞送的安全性。Zhang等[39]利用UTMD為介質(zhì)，構(gòu)建短發(fā)夾RNA與促黃體激素釋放激素類似物合成靶向微泡，應(yīng)用于卵巢癌培養(yǎng)細(xì)胞中并加以超聲輻照，結(jié)果顯示超聲靶向微泡提高了RNA干擾效率，且卵巢癌A2780/DDP細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞增殖抑制率明顯增高。目前RNA干擾在腫瘤研究中已表現(xiàn)出巨大的潛力，有望成為腫瘤基因治療的新方向。

3.3細(xì)胞遞送 干細(xì)胞、免疫細(xì)胞是近年來的研究熱點(diǎn)，同樣UTMD技術(shù)也可以攜載治療細(xì)胞，目前研究領(lǐng)域主要集中于腫瘤及心血管疾病。Li等[40]以間質(zhì)干細(xì)胞荷載微泡造影劑，應(yīng)用于心肌梗死模型小鼠并實(shí)施超聲輻照，結(jié)果顯示聯(lián)合治療組間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢數(shù)量顯著增加，證實(shí)了UTMD技術(shù)可以有效介導(dǎo)干細(xì)胞遞送且能改善治療效果。賈啟明等[41]利用UTMD技術(shù)沉默T淋巴細(xì)胞的Itch基因表達(dá)，構(gòu)建出靶向納米微泡，對(duì)胃癌MFC細(xì)胞進(jìn)行免疫治療，結(jié)果顯示該方法能夠有效抑制Itch基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞活性，提高對(duì)胃癌MFC細(xì)胞的免疫殺傷效率。

3.4開放血腦屏障 中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物治療效果不佳的主要原因是藥物無法跨越血腦屏障，但UTMD技術(shù)能夠可逆性地開放血腦屏障。崔海[42]利用伊文藍(lán)荷載微泡造影劑，經(jīng)健康SD大鼠顳骨予以超聲輻照，結(jié)果顯示UTMD技術(shù)可以安全、有效且可逆地靶向開放大鼠單側(cè)血腦屏障。蔡文斌等[43]利用生物素-親和素方法將干擾小RNA與納米微泡進(jìn)行荷載，制備出干擾小RNA-納米微泡復(fù)合體，并應(yīng)用UTMD技術(shù)靶向治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，證實(shí)干擾小RNA-納米微泡復(fù)合體聯(lián)合UTMD技術(shù)可以有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活性并提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率，實(shí)現(xiàn)了膠質(zhì)瘤的非創(chuàng)傷性治療。該研究證實(shí)了開放血腦屏障并進(jìn)行靶向遞送治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可行性，在一定程度上解決了藥物經(jīng)靜脈注射無法通過血腦屏障的問題，為膠質(zhì)瘤的非侵入性治療提供了新思路。

4 UTMD技術(shù)的安全性與不足

UTMD技術(shù)具有高度特異的靶向性和安全無創(chuàng)性，具有廣闊的應(yīng)用前景，但尚存在至少以下兩方面技術(shù)難題。

4.1安全性 雖然UTMD技術(shù)在腫瘤、心血管疾病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中取得較大進(jìn)展，但目前國內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于UTMD技術(shù)安全性的結(jié)論大多體現(xiàn)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞水平層面，其安全性仍需要進(jìn)一步探討。如超聲輻照能量過大對(duì)靶區(qū)細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，對(duì)細(xì)胞膜也有一定程度的損傷，在高強(qiáng)度超聲輻照下微泡的空化也可能導(dǎo)致動(dòng)物模型內(nèi)皮細(xì)胞壞死、組織出血及溶血，既往研究顯示，應(yīng)用UTMD靶向治療心臟疾病時(shí)，其他器官如肺、肝、腎和肌肉也會(huì)出現(xiàn)不同程度的損傷[44-45]。超聲微泡在打開血腦屏障的同時(shí)也可能造成腦損傷，在空化作用及聲孔效應(yīng)的作用下，微泡的爆破不僅能夠打開血腦屏障，實(shí)現(xiàn)釋放藥物或基因，還可破壞腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血腦屏障的損傷。張留影[46]在低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡開放大鼠血腦屏障的研究中提出，低強(qiáng)度超聲所引起的空化作用等一系列聲學(xué)效應(yīng)導(dǎo)致熱激蛋白水平升高，提示可能出現(xiàn)無菌性炎癥反應(yīng)。此外，超聲微泡聯(lián)合遞送藥物還可能導(dǎo)致其他并發(fā)癥，董倩等[47]利用超聲聯(lián)合替莫唑胺載脂體微泡應(yīng)用于大鼠腦膠質(zhì)瘤模型中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)治療后瘤體周圍存在廣泛腦組織損傷及瘤體內(nèi)部出血，同時(shí)出現(xiàn)大鼠活動(dòng)受限及靶區(qū)皮膚毒性等一系列不良反應(yīng)。因此，超聲與微泡聯(lián)合藥物或基因進(jìn)行超聲治療的安全性需要引起廣泛關(guān)注及重視。

4.2技術(shù)不足 目前UTMD技術(shù)最佳參數(shù)仍在探索中，各類參數(shù)錯(cuò)綜復(fù)雜又環(huán)環(huán)相扣。以超聲為例，其中頻率、占空比、聲強(qiáng)、輻照方法、總輻照時(shí)間等主要聲學(xué)參數(shù)影響微泡發(fā)生一系列效應(yīng)。而微泡類型、大小，濃度、外殼材質(zhì)、包裹氣體等參數(shù)又間接影響聲學(xué)參數(shù)調(diào)整。參數(shù)優(yōu)化及微泡類型又對(duì)治療效果或轉(zhuǎn)染效率至關(guān)重要。例如聲學(xué)參數(shù)設(shè)置偏低，易導(dǎo)致治療效果不理想或轉(zhuǎn)染率下降；聲學(xué)參數(shù)設(shè)置過高又會(huì)引發(fā)過度的熱效應(yīng)從而導(dǎo)致毛細(xì)血管損傷，甚至燙傷、誤傷、微血栓等不良反應(yīng)[48]。除聲學(xué)參數(shù)及微泡參數(shù)外，還與靶區(qū)域組織細(xì)胞學(xué)類型有關(guān)，如根據(jù)不同癌灶組織細(xì)胞學(xué)的類型及是否為多重耐藥細(xì)胞株等實(shí)際情況，選擇不同理化性質(zhì)的靶向微泡及聲學(xué)參數(shù)，以達(dá)到最佳治療效果[49]。另外，靶區(qū)域腫瘤組織的大小、位置、深度、侵犯周圍程度同樣影響各類參數(shù)調(diào)整，所以優(yōu)化UTMD技術(shù)仍需要開展大量實(shí)驗(yàn)和研究以實(shí)現(xiàn)最佳參數(shù)匹配。

超聲微泡診斷技術(shù)因精準(zhǔn)診斷的特性已在臨床廣泛應(yīng)用，但微泡介導(dǎo)靶向治療技術(shù)目前仍面臨以下問題需要解決：①微泡制備工藝仍有較大提升空間，首先微氣泡大小直徑不均勻是導(dǎo)致超聲空化不完全、不穩(wěn)定的重要原因之一，因而制備出粒徑均勻的微泡對(duì)于優(yōu)化超聲參數(shù)，達(dá)到穩(wěn)定的空化效果尤為重要；其次是微泡穩(wěn)定性，如氣核與微泡在血液中存留時(shí)長密切相關(guān)，外殼則直接影響微泡在聲場中順應(yīng)性，氣核與外殼共同影響微泡膨脹、碎裂、重新密封與壓縮等每一個(gè)聲學(xué)周期。如何制備出粒徑均勻且穩(wěn)定的微泡是UTMD技術(shù)亟待解決的問題之一。②荷載量與吸收率，通常磷脂及其他類型外殼微泡的載藥量<1%，即使利用陽離子高分子聚合物聚乙烯亞胺為載體制作微泡也難有質(zhì)的提升[50]。如果單純以增大微泡粒徑以加大荷載量則難以穿透血管內(nèi)膜屏障到達(dá)組織間隙，使治療物質(zhì)僅在靶組織區(qū)域血管內(nèi)釋放，難以達(dá)到最佳治療效果[11]。③可控的基因表達(dá)，F(xiàn)arhadi等[51]以中空蛋白為載體制作納米微泡，利用UTMD技術(shù)將多條基因轉(zhuǎn)錄至小鼠細(xì)胞內(nèi)使其表達(dá)，小鼠體內(nèi)注射癌細(xì)胞以誘導(dǎo)腫瘤生成，利用超聲造影成像功能，成功觀察到腫瘤組織中空蛋白基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了靶向基因技術(shù)可視化。但同時(shí)也存在基因表達(dá)不完全穩(wěn)定、表達(dá)效率不高以及可視化成像模式與其他成像模式結(jié)合等難題。

5 展 望

在精準(zhǔn)醫(yī)療的時(shí)代背景下，UTMD技術(shù)以其安全、高效、靶向治療及增強(qiáng)顯像等優(yōu)勢在精確診斷與精準(zhǔn)治療上展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，不僅是當(dāng)前超聲醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，還具有巨大經(jīng)濟(jì)效益與醫(yī)學(xué)價(jià)值。以精準(zhǔn)醫(yī)療為核心研發(fā)安全、無毒、高成像效果、高特異性、高穿透性、低劑量和低成本的超聲靶向微泡破壞技術(shù)，將成為未來超聲醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個(gè)重要方向。盡管當(dāng)前研究仍存在安全性、穩(wěn)定性及最佳參數(shù)匹配等技術(shù)難點(diǎn)，但隨著超聲技術(shù)和分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的不斷深入，多學(xué)科支持與跨領(lǐng)域合作，相關(guān)作用機(jī)制與各類參數(shù)優(yōu)化逐漸明確，必將更好地服務(wù)于臨床，值得廣泛深入研究。