羅嬌 盧玲 羅竹林 張曉英 曹煜

【摘要】目的 研究珊瑚姜油（Zingiber corallinum oil，ZCO）對人黑色素瘤WM35細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。方法 不同濃度（2.5-40mg/L）ZCO體外作用于人黑素瘤WM35細(xì)胞。采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力; 免疫熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化;比色法測Caspase-3酶活性;RT-qPCR檢測Bax/BcL-2 表達(dá)水平;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及周期。結(jié)果 ZCO以時間-劑量依賴性方式抑制黑素瘤WM35細(xì)胞株增殖，鏡下可見典型細(xì)胞凋亡形態(tài)，Caspase-3酶活性呈劑量依賴性增加。隨著ZCO藥物濃度增加，Bax mRNA表達(dá)上調(diào)，而BcL-2 mRNA表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞周期被阻滯在G1期，G2/M期及S期細(xì)胞數(shù)減少。結(jié)論 ZCO對人黑素瘤WM35細(xì)胞增殖具有抑制作用，其機(jī)制可能與上調(diào)Bax及下調(diào)BcL-2表達(dá)有關(guān)，并使細(xì)胞周期阻滯在G1期，同時，Caspase-3作為凋亡途徑的終末關(guān)鍵酶也參與其中。

【關(guān)鍵詞】珊瑚姜油;WM35;增殖;凋亡

【中圖分類號】R453? ?【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A? ?【文章編號】2026-5328（2021）07-009-03

黑色素瘤（melanoma）又稱為惡性黑色素瘤，是一種能產(chǎn)生黑色素的高度惡性腫瘤，其特點(diǎn)為惡性程度高，轉(zhuǎn)移發(fā)生早，死亡率高[1]。近年來，黑素瘤發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但目前的治療方法在提高病人的生存率上作用有限。珊瑚姜是中國的傳統(tǒng)苗藥之一，通過超臨界二氧化碳法從珊瑚姜中提取ZCO，近幾年研究顯示，ZCO具有抗細(xì)菌、真菌、殺蟲、抗氧化等活性[2，3]。吳春維等人發(fā)現(xiàn)ZCO對HeLa細(xì)胞具有抑制其增殖并促凋亡作用，但是ZCO是否會影響黑素瘤WM35細(xì)胞的增殖和凋亡仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)主要研究ZCO對WM35細(xì)胞增殖的抑制及凋亡的影響，探討其作用機(jī)制，為ZCO治療人黑色素瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及試劑? ZCO（貴陽舒美達(dá)藥廠）DMSO溶解后過濾除菌備用;WM35細(xì)胞（上海一研生物科技有限公司），CCK-8（日本同仁化學(xué)）、青鏈霉素雙抗、RPMI1640（貴州泰思騰生物科技有限公司），胎牛血清（杭州四季青有限公司），AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒及周期試劑盒（上海貝博生物），caspase-3檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），Bax/BcL-2引物（上海生工生物工程有限公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)? WM35細(xì)胞用RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（含10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗）， 置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25 %胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞毒性檢測? 離心收集對數(shù)生長期細(xì)胞，參考涂云華等人方法[4]，調(diào)整細(xì)胞密度為1.2×105個/ml后接種于96孔板，0.05ml/孔，培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組加入ZCO，補(bǔ)足培養(yǎng)基至總體積為0.1ml/孔，使藥物終濃度分別為2.5、5、10、20、40mg/L;設(shè)對照組，每一濃度均設(shè)6個復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h及72h，培養(yǎng)結(jié)束的1.5h前，每孔加入10L CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，酶標(biāo)儀測定波長為450nm時吸光度（OD）值。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)觀察? 調(diào)整細(xì)胞密度為1.1×104個/ml，接種至6孔板，培養(yǎng)12小時后，加入ZCO，使其終濃度為2.5、10、40mg/L，設(shè)空白對照，培養(yǎng)48h后，經(jīng)過AO/EB染色，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4Caspase-3酶活性? 離心收集細(xì)胞，每兩百萬細(xì)胞加入50ul裂解液的比例加入裂解液，12000g離心15min，吸取上清，按試劑盒步驟加入試劑，37℃孵育4h，酶標(biāo)儀檢測（波長為405nm）吸光度。Caspase-3活化程度=實(shí)驗(yàn)組A405/正常對照A405。

1.2.5RT-PCR測Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)水平? Trizol提取WM35細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)驗(yàn)方法參考涂云華等人[12]。引物設(shè)計(jì)：Bax（sense5'-TCAGGATGCGTCCACCAAGAA -3'，antisense5'-TGTCCACGGCGGCAATCA -3'）及BcL-2（sense5'-ATGGGATCGTTGCCTTATGC -3'，antisense5'-TCAGTCTACTTCCTCTGTGGATGTTG -3'），內(nèi)參：GAPDH（sense5'-TGGACCTGACCTGCCGT-3'，antisense5'-AGGAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3'），按照SYBR Green/ROX qPCR Master Mix步驟操作。反應(yīng)條件： ①BcL-2： 95℃預(yù)變性10min， 95℃變性15s，60℃退火30s， 72℃ 延伸30s， 40個循環(huán)， 最后延伸72℃10min;②Bax： 58℃退火。計(jì)算值=2-[（藥物組目的基因CT值-藥物組管家基因CT值）-（細(xì)胞對照組目的基因CT值-細(xì)胞對照組管家基因CT值）]。

1.2.6細(xì)胞凋亡及周期檢測? 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105/ml，藥物濃度設(shè)置同1.2.3，培養(yǎng)48h后，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×106/ml，參考Wu J等人實(shí)驗(yàn)方法[5]，細(xì)胞固定，AnnexinV-FITC/PI染色后按周期試劑盒染色，BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡及周期。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理? 采用Graphpad prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞毒性檢測? 隨著ZCO濃度增加，WM35細(xì)胞OD值逐漸降低，其作用方式呈時間-劑量依賴性，尤其對培養(yǎng)48h的WM35細(xì)胞增殖速度減慢最為明顯。

2.2細(xì)胞形態(tài)? 正常黑素瘤WM35細(xì)胞貼壁生長，呈多角形及不規(guī)則形（如圖A）。ZCO處理后，細(xì)胞生長變慢，胞質(zhì)間隙增大;AO/EB染色后，隨濃度升高，黃綠色熒光逐漸減少，而紅色熒光逐漸增多，細(xì)胞變成圓形或橢圓形;可見數(shù)量不等的漂浮細(xì)胞及細(xì)胞碎片（如圖B、C、D）。

A正常對照組;B，C，D分別為2.5、10、40mg/L的ZCO處理WM35細(xì)胞（×100）

2.3 Caspase-3酶活性? 運(yùn)用0-40mg/L的ZCO作用于WM35細(xì)胞，結(jié)果顯示：隨著藥物濃度增加，Caspase-3酶活性隨之增強(qiáng)，當(dāng)藥物濃度達(dá)到40mg/L時，酶活性達(dá)到最大（p<0.05）。

2.4Bax/BcL-2 mRNA表達(dá)? 低濃度至高濃度ZCO作用WM35細(xì)胞48h，Bax/BcL-2 mRNA比值升高，其作用方式呈劑量依賴性。

* vs對照組，P<0.05

2.5細(xì)胞凋亡? ZCO作用WM35細(xì)胞48h后，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，由低濃度至高濃度，凋亡逐漸增加，尤其以早期凋亡較為明顯。

A為對照組，B、C、D藥物濃度分別為2.5、10、40mg/L

2.6細(xì)胞周期變化? ZCO作用WM35細(xì)胞48h，隨藥物濃度增加，G2期細(xì)胞逐漸減少，細(xì)胞被阻滯在G2期。

3 討論

珊瑚姜可作藥和食兩用，具有廣泛的藥理活性，且毒性小等優(yōu)點(diǎn)，在治療腫瘤方面的研究報道較少。

本實(shí)驗(yàn)采用不同劑量的ZCO作用于WM35細(xì)胞，結(jié)果顯示， ZCO對WM35細(xì)胞的生長具有抑制作用， 隨著藥物濃度的增加， 抑制作用明顯增強(qiáng)，呈現(xiàn)時間-劑量依賴性，且當(dāng)藥物作用48h，抑制作用最為明顯。吖啶橙透過正常細(xì)胞膜，使細(xì)胞核呈綠色或黃綠色熒光，其使凋亡細(xì)胞染上致密濃染的黃綠色熒光或黃綠色碎片顆粒;而壞死細(xì)胞黃色熒光減弱甚至消失[6]。本實(shí)驗(yàn)中，ZCO由低濃度至高濃度，黃綠色熒光逐漸減少，而紅色熒光逐漸增多，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，可見數(shù)量不等的漂浮細(xì)胞與細(xì)胞碎片。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，隨藥物濃度增加凋亡程度逐漸明顯。

Caspase-3最主要的底物是多聚聚合酶PARP（poly（ADP-ribose） polymerase），該酶與DNA修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)有關(guān)[7]。在細(xì)胞凋亡啟動時，116kD的PARP在Asp216-Gly217之間被Caspase-3剪切成31kD和85kD兩個片段，使PARP中與DNA結(jié)合的兩個鋅指結(jié)構(gòu)與羧基端的催化區(qū)域分離，不能發(fā)揮正常功能[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增加，Caspase-3酶活性逐漸增強(qiáng)，呈時間-劑量依耐性，從而證實(shí)了Caspase-3參與ZCO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程。

細(xì)胞凋亡的兩個進(jìn)化保守信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，BcL-2家族成員的構(gòu)成比例是凋亡調(diào)控的關(guān)鍵因素，尤其是BcL-2/Bax比率是啟動細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”[9]。本實(shí)驗(yàn)中，隨著藥物濃度增加， Bax/BcL-2的比值逐漸增加，說明ZCO通過使凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)上調(diào)，使BcL-2表達(dá)下調(diào)而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞周期是指從一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞開始到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞為止所經(jīng)歷的過程，分為間期與分裂期兩個階段，間期又分為三期即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期），當(dāng)細(xì)胞周期發(fā)生紊亂時，細(xì)胞出現(xiàn)惡性增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)顯示，隨著ZCO濃度增加，G2期細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞周期阻滯在G2期，防止其向G2/M期轉(zhuǎn)換，阻斷了細(xì)胞的有絲分裂，從而對WM35細(xì)胞起到增殖抑制作用。

總之， ZCO可抑制WM35細(xì)胞增殖，其機(jī)制是通過激活凋亡途徑關(guān)鍵酶，使凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞周期阻滯在G2期，最終阻止腫瘤細(xì)胞的增殖與分化。

參考文獻(xiàn)：

[1] Lens M B， Dawes M. Global perspectives of contemporary epidemiological trends of cutaneous malignant melanoma[J]. British Journal of Dermatology，2004，150（2）：179-185.

[2] Dank G， Rassnick K M， Sokolovsky Y， et al. Use of adjuvant carboplatin for treatment of dogs with oral malignant melanoma following surgical excision.[J]. Veterinary & Comparative Oncology，2014，12（1）：78-84.

[3] Yang Z， Luo S， Peng Q， et al. GC-MS Analysis of the Essential Oil of Coral Ginger （Zingiber corallinum Hance） Rrhizome Obtained by Supercritical Fluid Extraction and Steam Distillation Extraction[J]. Chromatographia，2009，69（7-8）：785-790.

[4] 涂云華，康穎倩，周英，等. 姜黃揮發(fā)油對THP-1細(xì)胞增殖及凋亡的影響[J]. 山東大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2015，05期（5）：46-51.

[5] Wu J， Nie X. Effect of Oxymatrine on Cell Proliferation，Apoptosis，Cell Cycle and ERK1 Expression of the Fibroblasts Derived from Hypertrophic Scar and Keloids[J]. Chinese Journal of Minimally Invasive Surgery，2011，11（3）：259-263.

[6] Cao X， Wang A H， Jiao R Z， et al. Surfactin Induces Apoptosis and G2/M Arrest in Human Breast Cancer MCF-7 Cells Through Cell Cycle Factor Regulation[J]. Cell Biochemistry &amp; Biophysics，2009，55（3）：163-171.

[7] Pierre Olivier H， Rapha?l D， Christiane D， et al. Ursolic acid induces apoptosis through mitochondrial intrinsic pathway and caspase-3 activation in M4Beu melanoma cells[J]. International Journal of Cancer，2005，114（1）：1-11.

[8] Fossey S L， Bear M D， Lin J， et al. The novel curcumin analog FLLL32 decreases STAT3 DNA binding activity and expression， and induces apoptosis in osteosarcoma cell lines[J]. Bmc Cancer，2011，11（7）：1240.

[9] 王衛(wèi)東，陳正堂. Bcl-2/Bax比率與細(xì)胞“命運(yùn)”[J]. 中國腫瘤生物治療雜志，2007，04期：393-396.

基金項(xiàng)目：貴陽市科技局科技創(chuàng)新平臺項(xiàng)目[筑科合同（2012303）號];

作者簡介：羅嬌（1988-），女，碩士研究生，主管藥師，藥物的基礎(chǔ)研究及合理運(yùn)用。