孟 靜， 吳裕健， 鐘立霞， 程祥龍， 王 銳

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250100；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東泰安271016)

1 引 言

生物素是水溶性B族維生素，又稱VB7，是合成維生素C的必要物質(zhì)，是一種維持人體自然生長、發(fā)育和正常人體機(jī)能健康所必需的營養(yǎng)素[1，2]。生物素測定的方法主要有液相色譜-質(zhì)譜法[3～5]、高效液相色譜法[6～9]、酶聯(lián)免疫法[10，11]和微生物法[12，13]。在特殊醫(yī)學(xué)配方食品中生物素的測定過程中，由于基質(zhì)影響，樣品前處理和液相色譜沖洗階段出現(xiàn)較大干擾，使得目標(biāo)物測定檢出限高，同時(shí)儀器方法測定的是結(jié)構(gòu)相似的化合物，不能確定是否具有生物活性。而微生物方法測定的是有生物活性的生物素，最大程度反映了食品中能夠被人體利用的生物素的含量，特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品是部分特定人群的唯一營養(yǎng)物質(zhì)來源，因此對(duì)維生素添加量的監(jiān)控尤為重要。GB 5009.259—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物素的測定》是我國現(xiàn)行特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品方法標(biāo)準(zhǔn)中生物素的指定測定方法，該方法為微生物法，它利用植物乳桿菌的生長濃度與生物素含量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，達(dá)到定量的目的。

微生物法中引入了微生物這一生長因素，它的活性及生長狀態(tài)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大，為此對(duì)該方法進(jìn)行不確定度評(píng)估，可為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)參考。

本文采用微生物法測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中生物素含量，并進(jìn)行了不確定度評(píng)定。

2 材料和方法

2.1 材料及試劑

選取市售特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉作為待測樣品，標(biāo)簽標(biāo)識(shí)生物素含量為15 μg/100 g；生物素標(biāo)準(zhǔn)品購自美國藥典(USP)；植物乳桿菌(ATCC 8014)、生物素測定培養(yǎng)基購自北京陸橋；濃硫酸、氫氧化鈉均為分析純。

2.2 儀器與設(shè)備

TOMY SX-500高壓滅菌鍋，Sigma 3-30K高速冷凍離心機(jī)，梅特勒MS204S分析天平，IKA MS3漩渦混合儀，Bioteck Epoch2C酶標(biāo)儀，試管，移液管，移液器及容量瓶。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

(1)生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 μg/mL)

精確稱取100 mg生物素標(biāo)準(zhǔn)品,用乙醇溶液(50%)溶解并轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中,定容至刻度。

(2)生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液(1.0 μg/mL)

吸取1.00 mL生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于100 mL棕色容量瓶中,用乙醇溶液(50%)稀釋并定容至刻度。

(3)生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液(10 ng/mL)

吸取1.00 mL生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液置于100 mL容量瓶中,用水稀釋定容至刻度,混勻。

(4)標(biāo)準(zhǔn)使用工作液

分2個(gè)濃度,高濃度溶液的濃度為0.2 ng/mL;低濃度溶液的濃度為0.1 ng/mL。從工作液中吸取2次各5 mL,用水分別定容到250 mL和500 mL。

2.4 樣品前處理及稀釋

稱取樣品1 g(精確至0.000 1 g)至1個(gè)250 mL錐形瓶中，加入3%(體積比)硫酸溶液100 mL,121 ℃水解30 min,冷卻后用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5±0.2,轉(zhuǎn)到250 mL容量瓶中,用水定容,充分混合。用濾紙過濾,棄去最初的幾毫升。吸取濾液5 mL,加入約20 mL水,用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為6.8±0.2,轉(zhuǎn)至100 mL容量瓶中,用水定容至刻度,作為待測液備用。

2.5 樣品測定

取上述待測液與生物素測定培養(yǎng)基等體積混合后，121 ℃ 5 min滅菌，冷卻后標(biāo)準(zhǔn)曲線管和各待測管中滴加1滴制備好的植物乳桿菌的菌液，36 ℃培養(yǎng)20 h，540 nm處測定其吸光度值，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品測定液的生物素含量。

3 結(jié)果分析

3.1 測定原理及數(shù)學(xué)模型

GB 5009.210—2016[14]是利用植物乳桿菌(lactobacillus plantarum)對(duì)生物素的特異性和靈敏性，定量測定出試樣中待測物質(zhì)的含量。在含有除待測物質(zhì)以外所有營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中，微生物的生長與待測物質(zhì)含量呈線性關(guān)系，根據(jù)透光率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較，即可計(jì)算出試樣中待測物質(zhì)的含量。

測量結(jié)果計(jì)算公式為：

3.2 測量不確定度的主要來源及評(píng)定

含量測定的不確定度主要是由方法的重復(fù)性誤差,以及試驗(yàn)過程中所用試劑、儀器、器皿帶來的系統(tǒng)誤差[15，16]引起的。

3.2.1 測量重復(fù)性引入的不確定度

由于微生物生長的復(fù)雜性，菌株活性、培養(yǎng)溫度的波動(dòng)、生長環(huán)境pH值及溶液中氧的濃度等因素都會(huì)對(duì)菌株的生長有影響，進(jìn)而產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。這些因素引入的不確定度可通過重復(fù)性試驗(yàn)來評(píng)。在不同時(shí)間、同一名檢驗(yàn)人員按照GB 5009.210-2016標(biāo)準(zhǔn)的要求對(duì)同一樣品的生物素含量進(jìn)行10次平行測定，結(jié)果見表1。

表1 乳粉中生物素的含量測定結(jié)果Tab.1 Determination of biotin in milk powder μg/100 g

10次測量結(jié)果的平均值為

測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差為

則測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

測量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.2 生物素標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度

生物素標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度主要包括3個(gè)分量：生物素稱量、生物素純度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。

(1)生物素稱量引入的不確定度

用電子天平準(zhǔn)確稱取100 mg生物素標(biāo)準(zhǔn)品，所用天平最小分度為0.1 mg。根據(jù)檢定證書，天平最大重復(fù)性誤差為0.2 mg；當(dāng)0≤m≤50 g時(shí)，示值誤差為0.5 mg。按均勻分布，示值誤差引入的不確定度u1和重復(fù)性誤差引入的不確定度u2分別為：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(m1)=u(m1)/m1=3.11×10-3

(2)生物素純度引入的不確定度

根據(jù)生物素標(biāo)準(zhǔn)品說明書所述，其純度p≥99.9%，按B類不確定度評(píng)定，區(qū)間的半寬度為0.001，視為均勻分布。

純度引入標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(p)=u(p)/p=5.77×10-4

(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程使用了容量瓶、移液管等玻璃儀器，主要不確定度來源包括移液管體積的不確定度、溫度和重復(fù)性3個(gè)方面。

表2 各器具計(jì)算結(jié)果(標(biāo)準(zhǔn)溶液配制)Tab.2 Calculation result of each appliance (preparation of standard solution)

其中，1 000 mL容量瓶、500 mL容量瓶、250 mL容量瓶使用1次，100 mL容量瓶、5 mL移液管、1 mL移液管使用2次。合成玻璃器皿引入的不確定度：

urel(V1)=6.27×10-3

容量瓶和溶液的溫度與校正時(shí)的溫度不同，假設(shè)實(shí)驗(yàn)室溫度變化介于±5 ℃之間，溶液的體積膨脹系數(shù)為±2.1×10-4，在95%的置信概率下按三角分布，k=1.96，溫度變化帶來的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

u(T1i)=2.1×10-4×5×V1i/1.96
=5.357×10-4V1i

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(T1i)=u(T1i)/V1i=5.357×10-4

合成各容器由溫度帶來的不確定度為：

由生物素標(biāo)準(zhǔn)品引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.3 樣品引入的不確定度

(1)樣品稱量引入的不確定度

稱取的樣品質(zhì)量為1.004 1 g(準(zhǔn)確至0.000 1 g)，因此其最大誤差為±0.000 1 g，按照第3.2.2節(jié)中的方法計(jì)算樣品稱量引入的不確定度u(m)：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

urel(m)=u(m)/m= 3.097×10-4

(2)樣品稀釋引入的不確定度

樣品稀釋過程中使用了容量瓶、移液管、1 mL吸頭、200 μL吸頭等器皿，按第3.2.2節(jié)中的方法評(píng)估的玻璃器皿引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見表3。

表3 各器具計(jì)算結(jié)果(樣品稀釋)Tab.3 Calculation result of each appliance(sample dilution)

合成樣品稀釋過程中玻璃器皿引入的相對(duì)不確定度：

urel(V2)=4.956×10-3

參照第3.2.2節(jié)中的方法計(jì)算溫度變化帶來的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(T2)=1.198×10-3

樣品引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.4 吸光度E測定過程引入的不確定度

根據(jù)檢定證書，酶標(biāo)儀的吸光度示值誤差是0.5%，透射比重復(fù)性是0.0%，測定值一般為對(duì)稱分布，則吸光度測定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc(X)的計(jì)算

3.2.6 擴(kuò)展不確定度的評(píng)定

在95%的置信水平下，k=2，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

U=k×uc(X)=1.15 μg/100 g

最終得出該特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉的生物素含量為：(27.16±1.15)μg/100 g。

4 結(jié) 論

按照J(rèn)JF 1059.1-2012的要求，采用微生物方法對(duì)特殊醫(yī)學(xué)配方食品中生物素含量進(jìn)行多次測定，得到的生物素含量范圍為(27.16±1.15)μg/100 g。分析影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的各個(gè)分量包括重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品稱量稀釋及吸光度的測定等，對(duì)不確定度影響最大的分量為實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。重復(fù)性試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線、培養(yǎng)時(shí)間等均為可準(zhǔn)確把控的因素，菌株活性沒有可控制的指標(biāo)，對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響較大。在不同時(shí)間進(jìn)行生物素測定，菌株的接種量、工作菌株代數(shù)都要保持相同的條件，最大程度上維持實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，使不確定評(píng)定結(jié)果可用，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。