李怡成，王元敏

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)，湖南 長沙 410128；2.煙臺市萊陽中心醫(yī)院感染科，山東 煙臺 265200）

肝癌作為臨床常見惡性腫瘤，其主要誘發(fā)因素包括脂肪肝、肥胖、糖尿病、酒精、黃曲霉毒素、乙肝病毒感染等，死亡率較高，對肝癌患者進行早期診斷與治療較為重要[1]。HepG2來源于人體肝癌組織，人VASORIN蛋白（VASN）主要表達于腎臟、血管平滑肌細胞等，正常情況下，VASN僅在機體大動脈的血管平滑肌細胞表面呈高表達，少量表達于胎盤與腎臟，微弱表達于肝臟、胸腺、腦、心等，但肝癌發(fā)生時，HepG2細胞來源的外泌體中也存在VASN蛋白，HepG2細胞株中VASN蛋白表達水平較高，且肝癌組織、肝癌細胞中VASN蛋白呈高表達水平[2]。乙醇的主要代謝器官為肝臟，其在乙醇長期影響下易受到嚴重損傷[3]。為闡明乙醇在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究旨在分析乙醇對HepG2細胞VASN蛋白表達及其分泌情況的影響，以期為生物學(xué)細胞研究等提供有效參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞HepG2為本室保存；VASN標準品與VASN抗體由Abnova公司提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自賽默飛公司；胰酶干粉由科邦興業(yè)提供；超敏發(fā)光液由Thermo Fisher提供；Ploy（A）聚合酶來自BioLabs；細胞培養(yǎng)箱為Thermo Scientific產(chǎn)品，高速冷凍離心機由Hitachi公司提供，蛋白電泳儀購自BioRad，紫外分光光度計由Pharmacia提供，實時熒光定量PCR儀由Stratagene提供。

1.2 方法 使用不同濃度乙醇處理液對HepG2細胞進行刺激，分別在24、48、72 h收集細胞，應(yīng)用熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)（qPCR）檢測HepG2細胞VASN信使核糖核酸（mRNA）水平的變化，取超濾濃縮后的樣品進行分泌水平檢測，分析乙醇對HepG2細胞VASN蛋白表達與分泌水平的影響。細胞培養(yǎng)：在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對HepG2進行培養(yǎng)，保持培養(yǎng)箱5%CO237℃。在細胞密度90%時傳代，棄去原培養(yǎng)基，磷酸緩沖液（PBS）清洗，在離心管中置入細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，將上清液棄去，細胞傳代，DMEM培養(yǎng)基凍存。乙醇刺激：將處于對數(shù)生長期的細胞棄去細胞培養(yǎng)基，清洗2次并加入無血清培養(yǎng)基配置的25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L乙醇處理液，分別處理24、48、72 h。細胞總蛋白提?。阂掖即碳ず髼壢ヒ掖继幚硪海琍BS緩沖液對細胞進行2次漂洗；將預(yù)冷過的PBS緩沖液加入培養(yǎng)板，用細胞刮刀刮下HepG2，在EP管內(nèi)移入細胞懸浮液1 000 r/min離心5min；將上清棄去，PBS緩沖液對細胞進行1次洗滌，1 000 r/min離心5 min，并吸盡上清；將RIPA蛋白裂解液加入細胞裂解，離心，收集上清細胞總蛋白。

2 結(jié)果

2.1 乙醇刺激與HepG2細胞VASNmRNA蛋白表達水平與無乙醇刺激相比，25 mmol/L濃度乙醇刺激、50 mmol/L濃度乙醇刺激、100 mmol/L濃度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2細胞VASNmRNA水平均明顯較高，見表1。

表1 HepG2細胞VASNmRNA蛋白表達水平Table 1 HepG2 Protein expression levels VASNmRNAcells

2.2 乙醇刺激與HepG2細胞VASN蛋白分泌水平 與無乙醇刺激相比，25 mmol/L濃度乙醇刺激、50 mmol/L濃度乙醇刺激、100 mmol/L濃度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2細胞VASN蛋白分泌水平均明顯較高，見表2。

表2 HepG2細胞VASN蛋白分泌水平Table 2 HepG2 Protein secretion levels VASN cells

3 討論

肝癌病死率較高，僅次于肺癌，對其進行早期診斷對臨床治療具有重要意義。在惡性腫瘤的產(chǎn)生與增殖過程中，機體對腫瘤異常反應(yīng)或者腫瘤相關(guān)基因及其產(chǎn)物異常表達促成的異常生成或增長的生物活性物質(zhì)即腫瘤標志物，其對腫瘤的存在與生長具有一定的反映作用。在正常組織中或良性病變中，腫瘤標志物的表達通常較為微弱，但其異常表現(xiàn)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，因此，其對腫瘤的診斷、預(yù)后評估等具有重要作用。HepG2是一種來源于人體肝癌組織的肝癌細胞，乙醇的刺激與肝癌的發(fā)生發(fā)展具有一定的關(guān)聯(lián)，而VASN蛋白是典型的Ⅰ型跨膜蛋白之一，近年來多項研究表明其在多種實體瘤中表達，且其表達水平與腫瘤惡性程度聯(lián)系密切[4-5]。同時，VASN蛋白通常在胎盤、腎臟、肝臟、胸腺、腦等表達水平較低，在肝癌患者的癌細胞、腫瘤組織、血清中的表達均呈較高水平，已被證實為潛在的腫瘤標志物。

本研究結(jié)果顯示，與無乙醇刺激相比，25 mmol/L濃度乙醇刺激、50 mmol/L濃度乙醇刺激、100 mmol/L濃度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2細胞VASNmRNA水平均明顯較高；與無乙醇刺激相比，25 mmol/L濃度乙醇刺激、50 mmol/L濃度乙醇刺激、100 mmol/L濃度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2細胞VASN蛋白分泌水平均明顯較高。結(jié)果提示，乙醇具有誘導(dǎo)HepG2細胞VASN蛋白分泌及表達的作用。分析其原因可能為，不同濃度乙醇可對細胞生命活動產(chǎn)生不同影響，1.5 mmol/L的乙醇可明顯提高胰腺導(dǎo)管腺癌細胞的細胞膜通透性，100 mmol/L乙醇對外泌體的分泌、腫瘤血管生成、肝癌細胞的遷移等具有促進作用，而肝癌腫瘤受無水乙醇直接刺激，引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性與肝癌腫瘤細胞脫水，誘導(dǎo)腫瘤細胞壞死[6-7]。慢性乙醇刺激影響下，HepG2細胞多種基因表達改變，對脂質(zhì)代謝、碳代謝、氨基酸代謝、應(yīng)激反應(yīng)等途徑造成影響。同時VSAN蛋白可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有作用，是一種新型肝癌標志物，可能由于VASN蛋白與機體血管損傷修復(fù)、機體發(fā)育等相關(guān)[8]。因此，乙醇具有誘導(dǎo)HepG2細胞VASN蛋白分泌及表達的作用[9]。另外，作為癌的早期篩查指標，在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，甲胎蛋白（AFP）參與肝癌細胞增殖、血管生成和凋亡等過程，而VASN蛋白對AFP參與的肝癌發(fā)生過程具有協(xié)同作用，具體機制包括：①VASN可能對AFP的調(diào)節(jié)過程進行參與與協(xié)同；②由于肝癌的病情與預(yù)后可經(jīng)過AFP水平反映，而當(dāng)細胞向好的方向轉(zhuǎn)化，同時VASN蛋白水平下降時，AFP水平呈降低趨勢；③可能存在miRNA或轉(zhuǎn)錄因子的影響其他的調(diào)節(jié)機制。孫樂橋等[10]研究中，經(jīng)過Western試驗發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞VASN蛋白表達水平提升，劃痕愈合實驗發(fā)現(xiàn)，在乙醇刺激下，HepG2細胞VASN蛋白的分泌增多，說明乙醇刺激可促進HepG2細胞VASN蛋白表達水平和分泌水平升高。

綜上所述，乙醇可促進HepG2細胞VASN蛋白表達與分泌水平的提高，利于為生物學(xué)細胞研究等提供有效參考。