李怡成,王元敏
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué),湖南 長沙 410128;2.煙臺市萊陽中心醫(yī)院感染科,山東 煙臺 265200)
肝癌作為臨床常見惡性腫瘤,其主要誘發(fā)因素包括脂肪肝、肥胖、糖尿病、酒精、黃曲霉毒素、乙肝病毒感染等,死亡率較高,對肝癌患者進行早期診斷與治療較為重要[1]。HepG2來源于人體肝癌組織,人VASORIN蛋白(VASN)主要表達于腎臟、血管平滑肌細胞等,正常情況下,VASN僅在機體大動脈的血管平滑肌細胞表面呈高表達,少量表達于胎盤與腎臟,微弱表達于肝臟、胸腺、腦、心等,但肝癌發(fā)生時,HepG2細胞來源的外泌體中也存在VASN蛋白,HepG2細胞株中VASN蛋白表達水平較高,且肝癌組織、肝癌細胞中VASN蛋白呈高表達水平[2]。乙醇的主要代謝器官為肝臟,其在乙醇長期影響下易受到嚴重損傷[3]。為闡明乙醇在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用,本研究旨在分析乙醇對HepG2細胞VASN蛋白表達及其分泌情況的影響,以期為生物學(xué)細胞研究等提供有效參考,現(xiàn)報道如下。
1.1 材料 人肝癌細胞HepG2為本室保存;VASN標準品與VASN抗體由Abnova公司提供;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自賽默飛公司;胰酶干粉由科邦興業(yè)提供;超敏發(fā)光液由Thermo Fisher提供;Ploy(A)聚合酶來自BioLabs;細胞培養(yǎng)箱為Thermo Scientific產(chǎn)品,高速冷凍離心機由Hitachi公司提供,蛋白電泳儀購自BioRad,紫外分光光度計由Pharmacia提供,實時熒光定量PCR儀由Stratagene提供。
1.2 方法 使用不同濃度乙醇處理液對HepG2細胞進行刺激,分別在24、48、72 h收集細胞,應(yīng)用熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(qPCR)檢測HepG2細胞VASN信使核糖核酸(mRNA)水平的變化,取超濾濃縮后的樣品進行分泌水平檢測,分析乙醇對HepG2細胞VASN蛋白表達與分泌水平的影響。細胞培養(yǎng):在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對HepG2進行培養(yǎng),保持培養(yǎng)箱5%CO237℃。在細胞密度90%時傳代,棄去原培養(yǎng)基,磷酸緩沖液(PBS)清洗,在離心管中置入細胞懸液,1 000 r/min離心5 min,將上清液棄去,細胞傳代,DMEM培養(yǎng)基凍存。乙醇刺激:將處于對數(shù)生長期的細胞棄去細胞培養(yǎng)基,清洗2次并加入無血清培養(yǎng)基配置的25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L乙醇處理液,分別處理24、48、72 h。細胞總蛋白提?。阂掖即碳ず髼壢ヒ掖继幚硪海琍BS緩沖液對細胞進行2次漂洗;將預(yù)冷過的PBS緩沖液加入培養(yǎng)板,用細胞刮刀刮下HepG2,在EP管內(nèi)移入細胞懸浮液1 000 r/min離心5min;將上清棄去,PBS緩沖液對細胞進行1次洗滌,1 000 r/min離心5 min,并吸盡上清;將RIPA蛋白裂解液加入細胞裂解,離心,收集上清細胞總蛋白。
2.1 乙醇刺激與HepG2細胞VASNmRNA蛋白表達水平與無乙醇刺激相比,25 mmol/L濃度乙醇刺激、50 mmol/L濃度乙醇刺激、100 mmol/L濃度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2細胞VASNmRNA水平均明顯較高,見表1。
表1 HepG2細胞VASNmRNA蛋白表達水平Table 1 HepG2 Protein expression levels VASNmRNAcells
2.2 乙醇刺激與HepG2細胞VASN蛋白分泌水平 與無乙醇刺激相比,25 mmol/L濃度乙醇刺激、50 mmol/L濃度乙醇刺激、100 mmol/L濃度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2細胞VASN蛋白分泌水平均明顯較高,見表2。
表2 HepG2細胞VASN蛋白分泌水平Table 2 HepG2 Protein secretion levels VASN cells
肝癌病死率較高,僅次于肺癌,對其進行早期診斷對臨床治療具有重要意義。在惡性腫瘤的產(chǎn)生與增殖過程中,機體對腫瘤異常反應(yīng)或者腫瘤相關(guān)基因及其產(chǎn)物異常表達促成的異常生成或增長的生物活性物質(zhì)即腫瘤標志物,其對腫瘤的存在與生長具有一定的反映作用。在正常組織中或良性病變中,腫瘤標志物的表達通常較為微弱,但其異常表現(xiàn)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,因此,其對腫瘤的診斷、預(yù)后評估等具有重要作用。HepG2是一種來源于人體肝癌組織的肝癌細胞,乙醇的刺激與肝癌的發(fā)生發(fā)展具有一定的關(guān)聯(lián),而VASN蛋白是典型的Ⅰ型跨膜蛋白之一,近年來多項研究表明其在多種實體瘤中表達,且其表達水平與腫瘤惡性程度聯(lián)系密切[4-5]。同時,VASN蛋白通常在胎盤、腎臟、肝臟、胸腺、腦等表達水平較低,在肝癌患者的癌細胞、腫瘤組織、血清中的表達均呈較高水平,已被證實為潛在的腫瘤標志物。
本研究結(jié)果顯示,與無乙醇刺激相比,25 mmol/L濃度乙醇刺激、50 mmol/L濃度乙醇刺激、100 mmol/L濃度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2細胞VASNmRNA水平均明顯較高;與無乙醇刺激相比,25 mmol/L濃度乙醇刺激、50 mmol/L濃度乙醇刺激、100 mmol/L濃度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2細胞VASN蛋白分泌水平均明顯較高。結(jié)果提示,乙醇具有誘導(dǎo)HepG2細胞VASN蛋白分泌及表達的作用。分析其原因可能為,不同濃度乙醇可對細胞生命活動產(chǎn)生不同影響,1.5 mmol/L的乙醇可明顯提高胰腺導(dǎo)管腺癌細胞的細胞膜通透性,100 mmol/L乙醇對外泌體的分泌、腫瘤血管生成、肝癌細胞的遷移等具有促進作用,而肝癌腫瘤受無水乙醇直接刺激,引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性與肝癌腫瘤細胞脫水,誘導(dǎo)腫瘤細胞壞死[6-7]。慢性乙醇刺激影響下,HepG2細胞多種基因表達改變,對脂質(zhì)代謝、碳代謝、氨基酸代謝、應(yīng)激反應(yīng)等途徑造成影響。同時VSAN蛋白可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有作用,是一種新型肝癌標志物,可能由于VASN蛋白與機體血管損傷修復(fù)、機體發(fā)育等相關(guān)[8]。因此,乙醇具有誘導(dǎo)HepG2細胞VASN蛋白分泌及表達的作用[9]。另外,作為癌的早期篩查指標,在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中,甲胎蛋白(AFP)參與肝癌細胞增殖、血管生成和凋亡等過程,而VASN蛋白對AFP參與的肝癌發(fā)生過程具有協(xié)同作用,具體機制包括:①VASN可能對AFP的調(diào)節(jié)過程進行參與與協(xié)同;②由于肝癌的病情與預(yù)后可經(jīng)過AFP水平反映,而當(dāng)細胞向好的方向轉(zhuǎn)化,同時VASN蛋白水平下降時,AFP水平呈降低趨勢;③可能存在miRNA或轉(zhuǎn)錄因子的影響其他的調(diào)節(jié)機制。孫樂橋等[10]研究中,經(jīng)過Western試驗發(fā)現(xiàn),HepG2細胞VASN蛋白表達水平提升,劃痕愈合實驗發(fā)現(xiàn),在乙醇刺激下,HepG2細胞VASN蛋白的分泌增多,說明乙醇刺激可促進HepG2細胞VASN蛋白表達水平和分泌水平升高。
綜上所述,乙醇可促進HepG2細胞VASN蛋白表達與分泌水平的提高,利于為生物學(xué)細胞研究等提供有效參考。