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        白茅苷對(duì)去卵巢大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能和骨量的影響

        2021-11-30 08:04:28趙王林畢衡孔俊博馬菲許劍王清李智奎
        中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志 2021年11期
        關(guān)鍵詞:小梁成骨成骨細(xì)胞

        趙王林 畢衡 孔俊博 馬菲 許劍 王清 李智奎

        云南省中醫(yī)醫(yī)院骨科,云南 昆明 650021

        絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMO)是由雌激素缺乏引起的以絕經(jīng)后婦女骨密度和骨質(zhì)量受損為特征的代謝性骨質(zhì)疏松癥[1-2]。骨質(zhì)疏松癥的重要臨床特征是骨量、骨微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能受損引起的慢性骨痛和骨折。這些癥狀會(huì)顯著降低PMO患者的生活質(zhì)量和功能能力。PMO現(xiàn)在已經(jīng)成為一個(gè)涉及醫(yī)學(xué)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前對(duì)PMO治療最有效的方案是使用抗骨質(zhì)疏松藥物進(jìn)行干預(yù),但是臨床上常用二磷酸鹽、雌激素等。

        藥物具有一些局限性和不良反應(yīng),包括血栓栓塞和胃腸道刺激[3],因此需要開(kāi)發(fā)新的藥物用于治療這類疾病。白茅苷(BMG)是一種線性的呋喃香豆素化合物,是從當(dāng)歸和其他中藥成分中分離出來(lái)的。BMG是一種植物提取物,廣泛可得且便宜,并且具有抗氧化和抗凋亡作用[4-5]。有研究表明BMG能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖和分化[6]。鑒于BMG對(duì)成骨細(xì)胞的影響,因此其可用于治療骨質(zhì)疏松;但是,BMG是否能發(fā)揮骨保護(hù)作用仍不確定。因此本研究通過(guò)BMG干預(yù)觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化及觀察去卵巢大鼠骨量、骨密度以及骨強(qiáng)度影響,初步探索BMG預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)P徒⒑椭委?/h3>

        本研究選用30只體重220~260 g,3月齡雌性SD大鼠,購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(中國(guó)上海)。每組5只大鼠飼養(yǎng)在一只籠子里,光照時(shí)間為12 h/d,溫度為25 ℃,通風(fēng)干燥;可以自由飲食。適應(yīng)1周后,10只大鼠接受假手術(shù)(Sham),其余大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)(OVX)。常規(guī)麻醉消毒后,腰3椎體周圍1.5 cm處切開(kāi)一條縱向切口,露出腹腔,OVX組大鼠切除雙側(cè)卵巢,Sham組打開(kāi)腹腔后縫合腹腔。

        手術(shù)3 d后進(jìn)一步將大鼠分為3組(n=10只/組):Sham組、OVX組、BMG組:去卵巢大鼠術(shù)后給予白茅苷[20 mg/(kg·d),Sigma-Aldrich]灌胃治療,而OVX組和Sham組的大鼠則給予相同體積的生理鹽水;12周治療結(jié)束時(shí)過(guò)量水合氯醛麻醉處死大鼠,獲取雙側(cè)股骨進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。

        1.2 體外細(xì)胞研究

        三組大鼠在手術(shù)12周后進(jìn)行安樂(lè)死。通過(guò)用α-MEM沖洗從股骨中分離出BMSCs,并用紅細(xì)胞裂解緩沖液去除紅細(xì)胞。洗滌后,將細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液(含有10% FBS,100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的α-MEM)中于75 cm培養(yǎng)瓶中于37 ℃,5% CO2。用0.25%胰蛋白酶-EDTA對(duì)大鼠原代BMSCs進(jìn)行胰酶消化,然后重新鋪板。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用的所有細(xì)胞均為第2代。為了進(jìn)行成骨分化,將各組大鼠的BMSCs在10個(gè)12孔板中以1×104細(xì)胞/cm2的密度培養(yǎng)。達(dá)到80%匯合后,將細(xì)胞在成骨培養(yǎng)基(含有10%FBS,10 mmol/Lβ-甘油磷酸酯,100 nmol/L地塞米松和50 g/mL L-抗壞血酸的DMEM)中培養(yǎng)21 d。每3 d更換成骨培養(yǎng)基;在成骨分化2周和3周后分別使用堿性磷酸酶(ALP)和茜素紅(ARS)染色。將BMSCs固定在4%多聚甲醛(pH=7.4)中,并在0.1%ARS或者ALP溶液(pH=4.2)中于室溫孵育15 min。使用Olympus IX51顯微鏡捕獲數(shù)字圖像。使用分光光度計(jì)在420 nm處測(cè)定吸光度。

        1.3 蛋白質(zhì)印跡(WB)檢測(cè)

        收集BMSCs并在放射免疫沉淀測(cè)定緩沖液(RIPA,Beyotime,中國(guó)上海)中裂解。離心后,使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)量上清液中的蛋白質(zhì)水平。將蛋白質(zhì)樣品上樣進(jìn)行電泳,然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore,Billerica,MA,美國(guó))。將膜在5%脫脂奶中封閉2 h,然后與BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP、Col1和GAPDH一抗和二抗一起孵育。通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)對(duì)條帶進(jìn)行曝光,并通過(guò)Image Software(版本X;Media Cybernetics,Silver Springs,MD,美國(guó))進(jìn)行分析。

        1.4 Micro-CT和骨生物力學(xué)檢測(cè)

        使用Micro-CT系統(tǒng)(Skyscan 1176,Kontich,Belgium)檢查股骨遠(yuǎn)端的微結(jié)構(gòu)特性。骨掃描分辨率高(18 μm),能量65 kV,385 A。采用NRecon v1.6和CTAn v1.13.8.1軟件進(jìn)行三維重建。感興趣區(qū)(ROI)定義為股骨遠(yuǎn)端的松質(zhì)骨。計(jì)算骨密度(BMD,g/cm3)和骨微觀結(jié)構(gòu)參數(shù):骨體積比(BV/TV,%)、骨小梁數(shù)目(Tb.N,mm-1)、骨小梁厚度(Tb.Th,mm)和骨小梁間距(Tb.Sp,mm)。

        Micro-CT檢測(cè)后對(duì)大鼠股骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn),將左側(cè)股骨放在Instron 萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)力學(xué)測(cè)試裝置上。將股骨放在支架的中間位置,以10 mm/min的持續(xù)測(cè)試速度加載直到股骨骨折。記錄數(shù)據(jù),最后通過(guò)Instron軟件分析以獲得最大載荷(N)和彈性模量(mm2)。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        使用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差;組間差異通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析;P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 BMG對(duì)BMSCs誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化的作用

        ALP和ARS染色如圖1所示,OVX組大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化后ALP和ARS染色陽(yáng)性面積較Sham組明顯降低(P<0.05);而經(jīng)過(guò)BMG治療,BMG組大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化后ALP和ARS染色陽(yáng)性面積較OVX組明顯增加(P<0.05)。

        2.2 BMG對(duì)各組細(xì)胞蛋白表達(dá)影響

        和Sham組比較,OVX組BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1表達(dá)水平明顯下調(diào),比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。和OVX組比較,BMG組BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1表達(dá)水平上調(diào),比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

        圖2 使用WB檢測(cè)BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1的相對(duì)表達(dá)Fig.2 Relative expression of BMP-2, Runx2, OPN, OCN, ALP, and Col1 using Western blotting注:和Sham組比較,*P<0.05;和OVX組比較,#P<0.05。

        2.3 Micro-CT分析

        股骨干骺端骨小梁三維重建圖像如圖3A所示。股骨干骺端的微觀參數(shù)如圖3B~3F所示。OVX組股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低,而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)。BMG組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05),而Tb.Sp明顯低于OVX組(P<0.05)。

        圖3 各組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of each groups of rats注:A:各組大鼠骨小梁三維重建結(jié)果;B:Tb.Th;C:Tb.Sp;D:Tb.N;E:BV/TV;F:BMD;a:Sham組,b:OVX組,c:BMG組。和Sham組比較,*P<0.05;和OVX組比較,#P<0.05。

        2.4 生物力學(xué)分析

        股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)如圖 4所示,OVX組的最大載荷和彈性模量均顯著低于Sham組,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),BMG組的最大載荷和彈性模量較OVX組明顯升高(P<0.05)。

        圖4 股骨的三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Three-point bending test results of the femur of rats注:和Sham組比較,*P<0.05;和OVX組比較,#P<0.05。

        3 討論

        由于具有分化為多種組織的能力,因此將BMSCs視為理想的干細(xì)胞[7]。在不同環(huán)境的刺激下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)成不同的細(xì)胞類型,包括成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[8]。通常,BMSCs的成脂和成骨分化在正常的骨穩(wěn)態(tài)下保持動(dòng)態(tài)平衡。一旦打破平衡,將遭受一系列疾病的困擾,例如骨質(zhì)疏松癥,這是由于成骨能力和骨質(zhì)量的下降所致[9]。因此,研究成骨分化的潛在機(jī)制對(duì)預(yù)防骨丟失疾病具有重要意義。

        在本研究中檢測(cè)了不同治療組大鼠BMSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)OVX組大鼠BMSCs成骨分化能顯著降低,表現(xiàn)為ALP和ARS染色陽(yáng)性面積較Sham組明顯降低。而B(niǎo)MG組ALP和ARS染色陽(yáng)性較OVX組明顯升高;這表明BMG治療能提高OVX大鼠BMSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的能力。本研究還進(jìn)一步測(cè)量了各組細(xì)胞中BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1蛋白表達(dá)情況,這些蛋白是成骨相關(guān)的標(biāo)記蛋白[10]。結(jié)果表明,這6個(gè)標(biāo)志蛋白的表達(dá)均升高,表明由BMG組BMSCs的成骨分化較OVX組得到明顯促進(jìn)。這些數(shù)據(jù)表明BMG與BMSCs的成骨分化密切相關(guān)。

        本研究大部分集中在與雌激素流失相關(guān)的骨骼變化上。骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性疾病,其特征是骨骼質(zhì)量和強(qiáng)度下降,導(dǎo)致脆性骨折[11]。尤其是骨小梁結(jié)構(gòu)的破壞與骨強(qiáng)度降低和骨折患病率增加有關(guān)[12]。因此,本研究選擇了BMD、骨小梁結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)參數(shù)改變作為骨質(zhì)疏松治療效果評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究使用了一系列的研究方法來(lái)檢查骨骼對(duì)BMG治療的反應(yīng)。骨密度測(cè)定數(shù)據(jù)證實(shí),BMG在OVX大鼠模型中表現(xiàn)出骨保護(hù)作用。BMG治療可防治骨小梁丟失。骨小梁變化與生物力學(xué)特性的改善(包括最大載荷和彈性模量)相吻合。此類生物力學(xué)和結(jié)構(gòu)方面的改進(jìn)表明,BMG治療可增強(qiáng)骨骼質(zhì)量。

        在本研究中,通過(guò)BMG治療可預(yù)防由OVX引起的骨量損失。BMG治療顯著改善OVX引起的骨小梁微結(jié)構(gòu)性退化,表現(xiàn)為BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp改變。BMG對(duì)骨骼的保護(hù)作用包括促進(jìn)成骨作用,增加骨小梁數(shù)量和厚度及骨小梁連接性。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了先前在補(bǔ)充BMG在OVX大鼠骨骼有益作用[13]。骨骼的生物力學(xué)分析可以提供有關(guān)骨骼強(qiáng)度特性[14]。骨骼的機(jī)械特性是骨折風(fēng)險(xiǎn)的最重要預(yù)測(cè)指標(biāo),而骨骼的強(qiáng)度則取決于骨骼質(zhì)量和骨骼材料的固有特性[15]。在本研究結(jié)果中,BMG治療有效增加股骨的最大載荷和彈性模量,表明BMG治療對(duì)生物力學(xué)性能有很大影響,并保持了骨強(qiáng)度以防止卵巢切除術(shù)的有害作用??偟膩?lái)說(shuō),骨小梁微觀參數(shù)分析(Micro-CT)與骨密度和骨強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果相一致。

        總之,本研究表明BMG治療可以阻止去卵巢大鼠骨密度、骨量及骨強(qiáng)度降低;同時(shí)可以促進(jìn)去卵巢大鼠BMSCs成骨分化。但是沒(méi)有從破骨細(xì)胞角度和骨代謝方面探討B(tài)MG治療效果,后續(xù)會(huì)進(jìn)一步研究這方面變化。

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