趙王林 畢衡 孔俊博 馬菲 許劍 王清 李智奎

云南省中醫(yī)醫(yī)院骨科，云南 昆明 650021

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMO)是由雌激素缺乏引起的以絕經(jīng)后婦女骨密度和骨質(zhì)量受損為特征的代謝性骨質(zhì)疏松癥[1-2]。骨質(zhì)疏松癥的重要臨床特征是骨量、骨微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能受損引起的慢性骨痛和骨折。這些癥狀會(huì)顯著降低PMO患者的生活質(zhì)量和功能能力。PMO現(xiàn)在已經(jīng)成為一個(gè)涉及醫(yī)學(xué)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前對(duì)PMO治療最有效的方案是使用抗骨質(zhì)疏松藥物進(jìn)行干預(yù)，但是臨床上常用二磷酸鹽、雌激素等。

藥物具有一些局限性和不良反應(yīng)，包括血栓栓塞和胃腸道刺激[3]，因此需要開(kāi)發(fā)新的藥物用于治療這類疾病。白茅苷(BMG)是一種線性的呋喃香豆素化合物，是從當(dāng)歸和其他中藥成分中分離出來(lái)的。BMG是一種植物提取物，廣泛可得且便宜，并且具有抗氧化和抗凋亡作用[4-5]。有研究表明BMG能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖和分化[6]。鑒于BMG對(duì)成骨細(xì)胞的影響，因此其可用于治療骨質(zhì)疏松；但是，BMG是否能發(fā)揮骨保護(hù)作用仍不確定。因此本研究通過(guò)BMG干預(yù)觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化及觀察去卵巢大鼠骨量、骨密度以及骨強(qiáng)度影響，初步探索BMG預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒑椭委?/h3>

本研究選用30只體重220～260 g，3月齡雌性SD大鼠，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(中國(guó)上海)。每組5只大鼠飼養(yǎng)在一只籠子里，光照時(shí)間為12 h/d，溫度為25 ℃，通風(fēng)干燥；可以自由飲食。適應(yīng)1周后，10只大鼠接受假手術(shù)(Sham)，其余大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)(OVX)。常規(guī)麻醉消毒后，腰3椎體周圍1.5 cm處切開(kāi)一條縱向切口，露出腹腔，OVX組大鼠切除雙側(cè)卵巢，Sham組打開(kāi)腹腔后縫合腹腔。

手術(shù)3 d后進(jìn)一步將大鼠分為3組(n=10只/組)：Sham組、OVX組、BMG組：去卵巢大鼠術(shù)后給予白茅苷[20 mg/(kg·d)，Sigma-Aldrich]灌胃治療，而OVX組和Sham組的大鼠則給予相同體積的生理鹽水；12周治療結(jié)束時(shí)過(guò)量水合氯醛麻醉處死大鼠，獲取雙側(cè)股骨進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。

1.2 體外細(xì)胞研究

三組大鼠在手術(shù)12周后進(jìn)行安樂(lè)死。通過(guò)用α-MEM沖洗從股骨中分離出BMSCs，并用紅細(xì)胞裂解緩沖液去除紅細(xì)胞。洗滌后，將細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液(含有10% FBS，100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的α-MEM)中于75 cm培養(yǎng)瓶中于37 ℃，5% CO2。用0.25%胰蛋白酶-EDTA對(duì)大鼠原代BMSCs進(jìn)行胰酶消化，然后重新鋪板。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用的所有細(xì)胞均為第2代。為了進(jìn)行成骨分化，將各組大鼠的BMSCs在10個(gè)12孔板中以1×104細(xì)胞/cm2的密度培養(yǎng)。達(dá)到80%匯合后，將細(xì)胞在成骨培養(yǎng)基(含有10%FBS，10 mmol/Lβ-甘油磷酸酯，100 nmol/L地塞米松和50 g/mL L-抗壞血酸的DMEM)中培養(yǎng)21 d。每3 d更換成骨培養(yǎng)基；在成骨分化2周和3周后分別使用堿性磷酸酶(ALP)和茜素紅(ARS)染色。將BMSCs固定在4%多聚甲醛(pH=7.4)中，并在0.1%ARS或者ALP溶液(pH=4.2)中于室溫孵育15 min。使用Olympus IX51顯微鏡捕獲數(shù)字圖像。使用分光光度計(jì)在420 nm處測(cè)定吸光度。

1.3 蛋白質(zhì)印跡(WB)檢測(cè)

收集BMSCs并在放射免疫沉淀測(cè)定緩沖液(RIPA，Beyotime，中國(guó)上海)中裂解。離心后，使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)量上清液中的蛋白質(zhì)水平。將蛋白質(zhì)樣品上樣進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore，Billerica，MA，美國(guó))。將膜在5%脫脂奶中封閉2 h，然后與BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP、Col1和GAPDH一抗和二抗一起孵育。通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)對(duì)條帶進(jìn)行曝光，并通過(guò)Image Software(版本X；Media Cybernetics，Silver Springs，MD，美國(guó))進(jìn)行分析。

1.4 Micro-CT和骨生物力學(xué)檢測(cè)

使用Micro-CT系統(tǒng)(Skyscan 1176，Kontich，Belgium)檢查股骨遠(yuǎn)端的微結(jié)構(gòu)特性。骨掃描分辨率高(18 μm)，能量65 kV，385 A。采用NRecon v1.6和CTAn v1.13.8.1軟件進(jìn)行三維重建。感興趣區(qū)(ROI)定義為股骨遠(yuǎn)端的松質(zhì)骨。計(jì)算骨密度(BMD，g/cm3)和骨微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)：骨體積比(BV/TV，%)、骨小梁數(shù)目(Tb.N，mm-1)、骨小梁厚度(Tb.Th，mm)和骨小梁間距(Tb.Sp，mm)。

Micro-CT檢測(cè)后對(duì)大鼠股骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，將左側(cè)股骨放在Instron 萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)力學(xué)測(cè)試裝置上。將股骨放在支架的中間位置，以10 mm/min的持續(xù)測(cè)試速度加載直到股骨骨折。記錄數(shù)據(jù)，最后通過(guò)Instron軟件分析以獲得最大載荷(N)和彈性模量(mm2)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；組間差異通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMG對(duì)BMSCs誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化的作用

ALP和ARS染色如圖1所示，OVX組大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化后ALP和ARS染色陽(yáng)性面積較Sham組明顯降低(P<0.05)；而經(jīng)過(guò)BMG治療，BMG組大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化后ALP和ARS染色陽(yáng)性面積較OVX組明顯增加(P<0.05)。

2.2 BMG對(duì)各組細(xì)胞蛋白表達(dá)影響

和Sham組比較，OVX組BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1表達(dá)水平明顯下調(diào)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。和OVX組比較，BMG組BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1表達(dá)水平上調(diào)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 使用WB檢測(cè)BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1的相對(duì)表達(dá)Fig.2 Relative expression of BMP-2, Runx2, OPN, OCN, ALP, and Col1 using Western blotting注：和Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

2.3 Micro-CT分析

股骨干骺端骨小梁三維重建圖像如圖3A所示。股骨干骺端的微觀參數(shù)如圖3B～3F所示。OVX組股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)。BMG組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp明顯低于OVX組(P<0.05)。

圖3 各組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of each groups of rats注：A：各組大鼠骨小梁三維重建結(jié)果；B：Tb.Th；C：Tb.Sp；D：Tb.N；E：BV/TV；F：BMD；a：Sham組，b：OVX組，c：BMG組。和Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

2.4 生物力學(xué)分析

股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)如圖 4所示，OVX組的最大載荷和彈性模量均顯著低于Sham組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BMG組的最大載荷和彈性模量較OVX組明顯升高(P<0.05)。

圖4 股骨的三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Three-point bending test results of the femur of rats注：和Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

3 討論

由于具有分化為多種組織的能力，因此將BMSCs視為理想的干細(xì)胞[7]。在不同環(huán)境的刺激下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)成不同的細(xì)胞類型，包括成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[8]。通常，BMSCs的成脂和成骨分化在正常的骨穩(wěn)態(tài)下保持動(dòng)態(tài)平衡。一旦打破平衡，將遭受一系列疾病的困擾，例如骨質(zhì)疏松癥，這是由于成骨能力和骨質(zhì)量的下降所致[9]。因此，研究成骨分化的潛在機(jī)制對(duì)預(yù)防骨丟失疾病具有重要意義。

在本研究中檢測(cè)了不同治療組大鼠BMSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OVX組大鼠BMSCs成骨分化能顯著降低，表現(xiàn)為ALP和ARS染色陽(yáng)性面積較Sham組明顯降低。而B(niǎo)MG組ALP和ARS染色陽(yáng)性較OVX組明顯升高；這表明BMG治療能提高OVX大鼠BMSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的能力。本研究還進(jìn)一步測(cè)量了各組細(xì)胞中BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1蛋白表達(dá)情況，這些蛋白是成骨相關(guān)的標(biāo)記蛋白[10]。結(jié)果表明，這6個(gè)標(biāo)志蛋白的表達(dá)均升高，表明由BMG組BMSCs的成骨分化較OVX組得到明顯促進(jìn)。這些數(shù)據(jù)表明BMG與BMSCs的成骨分化密切相關(guān)。

本研究大部分集中在與雌激素流失相關(guān)的骨骼變化上。骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性疾病，其特征是骨骼質(zhì)量和強(qiáng)度下降，導(dǎo)致脆性骨折[11]。尤其是骨小梁結(jié)構(gòu)的破壞與骨強(qiáng)度降低和骨折患病率增加有關(guān)[12]。因此，本研究選擇了BMD、骨小梁結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)參數(shù)改變作為骨質(zhì)疏松治療效果評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究使用了一系列的研究方法來(lái)檢查骨骼對(duì)BMG治療的反應(yīng)。骨密度測(cè)定數(shù)據(jù)證實(shí)，BMG在OVX大鼠模型中表現(xiàn)出骨保護(hù)作用。BMG治療可防治骨小梁丟失。骨小梁變化與生物力學(xué)特性的改善(包括最大載荷和彈性模量)相吻合。此類生物力學(xué)和結(jié)構(gòu)方面的改進(jìn)表明，BMG治療可增強(qiáng)骨骼質(zhì)量。

在本研究中，通過(guò)BMG治療可預(yù)防由OVX引起的骨量損失。BMG治療顯著改善OVX引起的骨小梁微結(jié)構(gòu)性退化，表現(xiàn)為BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp改變。BMG對(duì)骨骼的保護(hù)作用包括促進(jìn)成骨作用，增加骨小梁數(shù)量和厚度及骨小梁連接性。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了先前在補(bǔ)充BMG在OVX大鼠骨骼有益作用[13]。骨骼的生物力學(xué)分析可以提供有關(guān)骨骼強(qiáng)度特性[14]。骨骼的機(jī)械特性是骨折風(fēng)險(xiǎn)的最重要預(yù)測(cè)指標(biāo)，而骨骼的強(qiáng)度則取決于骨骼質(zhì)量和骨骼材料的固有特性[15]。在本研究結(jié)果中，BMG治療有效增加股骨的最大載荷和彈性模量，表明BMG治療對(duì)生物力學(xué)性能有很大影響，并保持了骨強(qiáng)度以防止卵巢切除術(shù)的有害作用?？偟膩?lái)說(shuō)，骨小梁微觀參數(shù)分析(Micro-CT)與骨密度和骨強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果相一致。

總之，本研究表明BMG治療可以阻止去卵巢大鼠骨密度、骨量及骨強(qiáng)度降低；同時(shí)可以促進(jìn)去卵巢大鼠BMSCs成骨分化。但是沒(méi)有從破骨細(xì)胞角度和骨代謝方面探討B(tài)MG治療效果，后續(xù)會(huì)進(jìn)一步研究這方面變化。