古麗娜·卡里曼江，阿布都艾則孜·艾爾肯，阿麗亞·依拉木，美麗萬·阿不都熱依木，木巴拉克·伊明江

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊830000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性、炎性、進(jìn)行性、侵襲性及系統(tǒng)性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫疾病[1]?？癸L(fēng)濕中草藥傳統(tǒng)劑型存在生物利用度低、劑量大、起效慢、用藥不方便等不足。中藥凝膠劑是近年來的新興劑型,作為中醫(yī)藥內(nèi)病外治法的良好劑型用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

刺山柑(CapparisspinosaL.)為白花菜科山柑屬藤本植物，又名野西瓜、老鼠瓜、槌果藤[2]，具有祛風(fēng)散寒、除濕、鎮(zhèn)痛、消腫的功效[3]。刺山柑化學(xué)成分復(fù)雜，楊麗等[4]以刺山柑果凝膠膏劑的有效成分蘆丁為指標(biāo)物質(zhì)，對(duì)促透劑進(jìn)行了篩選。

作者所在課題組前期確定了刺山柑凝膠劑處方及制備工藝，但未對(duì)促透劑進(jìn)行篩選。而透皮吸收的指標(biāo)參數(shù)豐富并具有模糊特征，不能依據(jù)某單一指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。熵權(quán)法是一種客觀的體系權(quán)重的計(jì)算方法，可有效降低主觀隨意性對(duì)權(quán)重值的干擾，提高權(quán)重的準(zhǔn)確度[5]。模糊綜合評(píng)價(jià)法將指標(biāo)數(shù)值與隸屬度對(duì)應(yīng),用隸屬度來反映指標(biāo)的好壞,能夠有效解決由系統(tǒng)本身狀態(tài)的模糊性和內(nèi)部的復(fù)雜性所帶來的難以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)的問題,具有結(jié)果清晰、系統(tǒng)性強(qiáng)的特點(diǎn)[6]。在前期刺山柑凝膠劑劑型研究的基礎(chǔ)上，作者分別選擇氮酮、薄荷醇、丙二醇、油酸作為促透劑，以穩(wěn)態(tài)流量(Jss)、滲透系數(shù)(Kp)、滯后時(shí)間(Tlag)、增滲倍數(shù)(ER)、皮膚殘留量(Qs)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用熵權(quán)模糊綜合評(píng)判模型研究不同促透劑及其用量對(duì)刺山柑凝膠劑中有效成分蘆丁透皮吸收特征的影響，以期獲得具有最佳促透效果的促透劑，為提高刺山柑凝膠劑的藥效發(fā)揮奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

刺山柑藥材，購(gòu)于百草堂中藥房，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院美麗萬·阿不都熱依木教授鑒定為白花菜科山柑屬。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)111G022，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)，北京索萊寶科技有限公司；氮酮(批號(hào)C11290675)、油酸(批號(hào)C10615044)、丙二醇(批號(hào)C11276571)、薄荷醇(批號(hào)C11169169)，上海麥克林生化科技有限公司；其它試劑均為市售分析純。

高效液相色譜儀，Agilent；TP-6型智能透皮試驗(yàn)儀、改良型Franz立式擴(kuò)散池，天津鑫州科技有限公司；電子分析天平，深圳無限量衡器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠[質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(新)2018-0002]，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 刺山柑凝膠劑的制備

稱取適量卡波姆940，加甘油調(diào)成糊狀，再加入刺山柑果實(shí)濃縮液，攪勻，加適量蒸餾水溶脹，靜置過夜，備用。將無水乙醇、促透劑、增溶劑、防腐劑加入凝膠中，充分?jǐn)嚢韬蟮渭尤掖及罚{(diào)節(jié)pH值至6～7，即得刺山柑凝膠劑[7]。

1.4 體外透皮實(shí)驗(yàn)

1.4.1 動(dòng)物離體皮膚的制備

將大鼠脫臼處死后，刮去腹部的毛，剪下腹部皮膚，仔細(xì)剔除皮下脂肪和粘連物，用生理鹽水清洗干凈，剪成適當(dāng)大小，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用前自然解凍，并檢查大鼠皮膚的完整性，確保無任何破損。

1.4.2 接收液的篩選

分別用生理鹽水、10%乙醇-生理鹽水、20%乙醇-生理鹽水、磷酸緩沖液(pH值7.4，下同)、10%乙醇-磷酸緩沖液、20%乙醇-磷酸緩沖液溶解已知量的蘆丁，進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，采用20%乙醇-磷酸緩沖液溶解蘆丁，溶解度可達(dá)85.2%。故以20%乙醇-磷酸緩沖液作為接收液。

1.4.3 含不同促透劑的刺山柑凝膠劑的制備

分別以氮酮、薄荷醇、丙二醇、油酸為促透劑，制備含不同促透劑的刺山柑凝膠劑，以不含促透劑的刺山柑凝膠劑(F0)作為對(duì)照，處方見表1。

表1 含不同促透劑的刺山柑凝膠劑處方

1.4.4 藥物累積滲透量的測(cè)定

將大鼠皮膚自然固定在改良型Franz立式擴(kuò)散池的供應(yīng)室和接收室(提前加入轉(zhuǎn)子)之間，有效擴(kuò)散面積為1.8 cm2，角質(zhì)層面向供應(yīng)室，上下夾緊后在供應(yīng)室中加入刺山柑凝膠劑1.0 g，均勻涂抹于皮膚表面，向接收室內(nèi)注入預(yù)熱過的20%乙醇-磷酸緩沖液作為接收液，確保液面與皮膚接觸無氣泡，設(shè)置透皮試驗(yàn)儀溫度為(37.0±0.5) ℃，轉(zhuǎn)速為(300±1) r·min-1，分別于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h抽取接收液3.0 mL，同時(shí)補(bǔ)加等溫等體積的新鮮接收液。將接收液用氮?dú)獯蹈珊蠹尤爰状既芙?，取上清液?.45 μm微孔濾膜過濾后采用HPLC法測(cè)定，按式(1)計(jì)算藥物單位面積累積滲透量(Q，μg·cm-2)：

(1)

式中：cn、ci分別為n、i時(shí)間點(diǎn)的藥物質(zhì)量濃度，μg·mL-1；V為接收液體積,mL；Vi為取樣量,mL；S為擴(kuò)散滲透面積,cm2。

1.5 藥物儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

當(dāng)體外透皮實(shí)驗(yàn)完成后，從供應(yīng)室中取出刺山柑凝膠劑,從改良型Franz立式擴(kuò)散池中取出大鼠皮膚，用接收液清洗大鼠皮膚表面，去除殘留藥物，再用濾紙吸干。將大鼠皮膚用手術(shù)剪刀剪成碎片，用研缽進(jìn)一步研磨。將研磨好的皮膚組織放入離心管中，加入3.0 mL接收液，渦旋勻漿5 min，再常溫超聲處理30 min后于3 000 r·min-1離心5 min。收集上清液,氮?dú)獯蹈扇軇?，再用甲醇溶解，采用HPLC法測(cè)定藥物的皮膚殘留量(Qs，μg·cm-2)。

1.6 刺山柑凝膠劑中蘆丁含量的測(cè)定

1.6.1 溶液的制備

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.002 0 g于5 mL棕色容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，即得0.4 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

供試溶液：取各時(shí)間點(diǎn)的透皮接收液，將接收液用氮?dú)獯蹈珊?，加入甲醇溶解，取上清液?.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試溶液。

1.6.2 色譜條件

島津ODS-2 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液-乙腈(80∶20，體積比)；流速1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫25 ℃?？瞻捉邮找骸⑻J丁標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試溶液的HPLC圖譜見圖1。

圖1 空白接收液(a)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(b)、供試溶液(c)的HPLC圖譜

1.7 熵權(quán)模糊綜合評(píng)判模型綜合評(píng)價(jià)

1.7.1 評(píng)價(jià)對(duì)象集、因素集和評(píng)語集的確定

依據(jù)促透劑評(píng)價(jià)指標(biāo)和種類[8-9]，設(shè)置對(duì)象集=(促透劑促透能力)，因素集=(Jss、Kp、ER、Tlag)，評(píng)語集=(優(yōu)、良、中、一般、差)。

1.7.2 模糊評(píng)判矩陣的確定

設(shè)F0組的Jss、Kp、ER、Tlag數(shù)值等級(jí)為一般，按式(2)計(jì)算各指標(biāo)等級(jí)差，其等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 各評(píng)價(jià)指標(biāo)的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

(2)

選擇梯形模型分布隸屬函數(shù),從而確保各組模糊評(píng)判矩陣有合適的隸屬函數(shù)，對(duì)不同促透劑的各指標(biāo)按式(3)計(jì)算評(píng)價(jià)矩陣R：

(3)

1.7.3 熵權(quán)法確定評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)

在具有i個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)、j個(gè)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)中，根據(jù)定性和定量的原則得到矩陣R，根據(jù)熵權(quán)法按式(4)計(jì)算不同促透劑各評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重值：

(4)

式中：Hi為第i個(gè)指標(biāo)的熵；Wi為第i個(gè)指標(biāo)的權(quán)重(0≤Wi≤1,∑Wi=1)。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系

精密吸取12.5 μL、25 μL、125 μL、250 μL、500 μL、1 000 μL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按1.6.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程為y=17.888x-3.0442，R=0.9999。表明，蘆丁濃度在0.5～40 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.6.2色譜條件于同一天重復(fù)進(jìn)樣6次，考察日內(nèi)精密度，計(jì)算蘆丁峰面積的RSD值為1.34%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.6.2色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算蘆丁峰面積的RSD值為1.74%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 加標(biāo)回收率

精密吸取6份已知含量的透皮接收液，分別精密加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.6.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率為98.21%，RSD值為2.09%。

2.2 不同促透劑對(duì)刺山柑凝膠劑透皮吸收的影響

將時(shí)間-藥物累積滲透量進(jìn)行零級(jí)、一級(jí)、Higuchi方程、Ritger-Peppas動(dòng)力學(xué)方程擬合，結(jié)果見表3。

表3 含氮酮刺山柑凝膠劑體外釋藥模型擬合結(jié)果

由表3可知，以各模型擬合方程的R2值接近1的程度來進(jìn)行擬合方程最佳判斷，確定刺山柑凝膠劑體外釋藥規(guī)律均符合Higuchi方程。根據(jù)Higuchi方程分別計(jì)算得到Jss、Kp、ER、Tlag，結(jié)果見表4。含不同促透劑刺山柑凝膠劑的皮膚殘留量見圖2。

表4 不同促透劑對(duì)刺山柑凝膠劑經(jīng)皮吸收參數(shù)的影響

圖2 含不同促透劑刺山柑凝膠劑的皮膚殘留量

由表4、圖2可知，在不含促透劑和含不同促透劑的刺山柑凝膠劑系列處方組中，1%氮酮組(F1)的Jss、Kp、ER最優(yōu)；3%薄荷醇組(F5)的Tlag最優(yōu)；1%油酸組(F8)的Qs最優(yōu)。

2.3 熵權(quán)模糊綜合評(píng)價(jià)分析

按熵權(quán)法得到各評(píng)價(jià)因素的權(quán)重分配W=[w1,w2,w3,…,wn]，不同促透劑各評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)見表5。

表5 不同促透劑各評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)

根據(jù)各評(píng)判指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)通過模糊變換，可得到論域上的一個(gè)模糊子集，即綜合評(píng)判結(jié)果：B=W，R=[b1,b2,b3,…,bm]，不同促透劑對(duì)刺山柑凝膠劑促透作用的歸屬見表6。

表6 不同促透劑對(duì)刺山柑凝膠劑促透作用的歸屬

從表6可知，1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮的評(píng)語分別為良、優(yōu)、一般，其評(píng)語的最大隸屬度分別為0.619 6、0.716 4、1.025；1%薄荷醇、3%薄荷醇、5%薄荷醇的評(píng)語分別為中、優(yōu)、一般，其評(píng)語的最大隸屬度分別為0.667 3、0.669 6、0.745 6；5%丙二醇的評(píng)語為一般，其評(píng)語的最大隸屬度為1.344；1%油酸、3%油酸、5%油酸的評(píng)語分別為良、良、一般，其評(píng)語的最大隸屬度分別為0.925 4、1.305、0.584 4；2%氮酮+2%薄荷醇的評(píng)語為中，其評(píng)語的最大隸屬度為1.058，2%氮酮+2%丙二醇的評(píng)語為中，其評(píng)語的最大隸屬度為0.994 4。表明，3%氮酮對(duì)刺山柑凝膠劑具有最佳的透皮吸收促進(jìn)作用。

2.4 討論

在體外透皮實(shí)驗(yàn)中，接收液的選擇尤為重要。較常使用的接收液主要是磷酸緩沖液、生理鹽水等。對(duì)于水溶性差的藥物則常會(huì)在接收液中添加一些非生理性成分如乙醇、聚乙二醇、丙二醇[10]等，以增大藥物的溶解度。刺山柑凝膠劑中活性成分蘆丁在水中的溶解度較小,本研究以磷酸緩沖液作為接收液并分別加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇，在增大蘆丁溶解度的同時(shí)可使角質(zhì)層膨脹疏松，增加皮膚的通透性,促進(jìn)透皮，從而減少時(shí)滯，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。在考察蘆丁在不同溶液中的溶解度時(shí)發(fā)現(xiàn)，20%乙醇-磷酸緩沖液可增大蘆丁的溶解度，且乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)皮膚正常生理功能的影響較小，故以此為接收液。

刺山柑作為傳統(tǒng)中藥，在民間以果實(shí)、根皮等搗碎敷在患處使用，以治療痛風(fēng)、關(guān)節(jié)腫脹疼痛等病況。作者所在課題組以此為基點(diǎn)進(jìn)行系列研究[7,11]，以促進(jìn)制劑開發(fā)。但經(jīng)皮給藥的局限在于皮膚的屏障作用，角質(zhì)層屏障效應(yīng)最強(qiáng)，易阻滯藥物的經(jīng)皮吸收[12]。本研究為提高刺山柑凝膠劑的生物利用度，分別考察了氮酮、薄荷醇、丙二醇、油酸及其聯(lián)合使用對(duì)經(jīng)皮吸收的影響，結(jié)果顯示不同促透劑對(duì)其均有促進(jìn)作用。但各促透劑的促透指標(biāo)各有優(yōu)劣，并不能就單一指標(biāo)評(píng)價(jià)各促透劑的綜合促透能力，因此采用熵權(quán)模糊綜合評(píng)判模型進(jìn)行評(píng)價(jià)篩選，既能避免主觀意識(shí)對(duì)結(jié)果的干擾，也能將評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行模糊變化再使其定量化，客觀有效得出清晰準(zhǔn)確的結(jié)果。

3 結(jié)論

采用改良型Franz立式擴(kuò)散池進(jìn)行體外透皮實(shí)驗(yàn)，通過HPLC法測(cè)定刺山柑凝膠劑中有效成分蘆丁含量，以穩(wěn)態(tài)流量、滲透系數(shù)、滯后時(shí)間、增滲倍數(shù)、皮膚殘留量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，基于熵權(quán)模糊綜合評(píng)判模型研究不同促透劑及其用量對(duì)刺山柑凝膠劑中蘆丁透皮吸收特征的影響，優(yōu)化刺山柑凝膠劑處方。結(jié)果表明，刺山柑凝膠劑體外釋藥規(guī)律符合Higuchi方程，透皮速率恒定；熵權(quán)模糊綜合評(píng)價(jià)顯示3%氮酮的促透能力最佳，其評(píng)語為優(yōu)的最大隸屬度為0.716 4。3%氮酮能有效促進(jìn)刺山柑凝膠劑中蘆丁的體外透皮吸收，可作為刺山柑凝膠劑的促透劑。