侯少平,侯敏娜,周 蕊
(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院,陜西 西安 712046)
山刺玫(RosadavuricaPall.),又名野玫瑰,是薔薇科薔薇屬的一種落葉小灌木,生長(zhǎng)于樹林邊緣,該植物耐旱,可在瘠薄區(qū)域生長(zhǎng),主要分布在東北地區(qū)(小興安嶺以南)[1-2]。山刺玫果具有健運(yùn)脾氣、調(diào)理月經(jīng)、消食、斂肺止咳的功效,對(duì)胃積食、動(dòng)脈粥樣硬化、腹痛、月經(jīng)不調(diào)、肺咳都有療效[3]。山刺玫果具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,可直接加工成果醬類食品,也是保健品以及功能性飲品的原料[4]。
目前,關(guān)于薔薇屬植物刺玫果的研究較多,而針對(duì)山刺玫果的研究較少。山刺玫果與刺玫果屬同類不同品種的植物果實(shí),其作為鄂倫春族民族用藥,同樣具有較顯著的藥理作用。鑒于此,作者采取Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化山刺玫果總黃酮的超聲輔助提取工藝,為山刺玫果的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
山刺玫干燥成熟果實(shí),由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。
蘆丁標(biāo)椎品(批號(hào):20140331),上海源葉生物科技有限公司;抗壞血酸、甲醇、乙醇、乙酸乙酯,均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。
TU-1810型紫外分光光度計(jì),北京普析儀器有限責(zé)任公司;HH-S4型電熱恒溫水浴鍋,北京科偉永興儀器有限公司;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵,鄭州賽特利斯;RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鞏義瑞力儀器設(shè)備有限公司;5~50 μL移液器,中國(guó)大龍;100~1 000 μL移液器,美國(guó)Thermo Fisher;DZF-6021型真空干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SQP型萬(wàn)分之一天平,北京賽多利斯;800Y型粉碎機(jī),皇代;YP202N型電子天平,上海精科。
精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg,105 ℃下干燥至恒重,加甲醇溶解并定容至50 mL,搖勻,即得濃度為0.1 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液[5-6]。
分別精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,采用NaNO2-Al(NO3)3法測(cè)定510 nm處吸光度,以蘆丁濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),擬合得線性回歸方程為:A=9.9364c+0.0039,R2=0.9996,表明蘆丁濃度在0.01~0.05 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好[5]。
圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線
取山刺玫干果粉50 g,在相應(yīng)條件下提取。提取液經(jīng)過濾后蒸干,取定量干膏用少量一定濃度乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,稀釋至刻度;精密量取1 mL提取液稀釋液,采用NaNO2-Al(NO3)3法測(cè)定510 nm處吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮含量,然后根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算山刺玫果總黃酮得率(mg·g-1)[7]。
1.5.1 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)[8-9]
影響山刺玫果總黃酮的提取因素包括提取功率、提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇濃度、pH值等。通過查閱文獻(xiàn),結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步確定各影響因素的取值范圍,再通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)找到實(shí)驗(yàn)頂點(diǎn)(最大響應(yīng)值)即為因素的+1點(diǎn),根據(jù)1.25倍原則得出-1點(diǎn),即確定各因素的最佳取值范圍。
1.5.2 PB實(shí)驗(yàn)
使用Minitab 16軟件設(shè)計(jì)3個(gè)中心點(diǎn)和12組實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。
1.5.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)
在PB實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取P值<0.05的因素作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)因素,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),確定山刺玫果總黃酮的最佳提取工藝。
采用Design-Expert V8.0.6軟件、Minitab 16軟件和Excel 2010繪制圖表進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。
經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定影響總黃酮得率的7個(gè)影響因素的取值范圍:提取次數(shù)為1~6次、提取液pH值為2.0~5.0、料液比為1∶(6~16)、提取功率為100~200 W、提取溫度為10~80 ℃、乙醇濃度為20%~100%、提取時(shí)間為10~60 min,共設(shè)計(jì)6組實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表1。
表1 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
從表1可以看出,第4組山刺玫果總黃酮得率最高。因此,選擇第4組作為實(shí)驗(yàn)頂點(diǎn)(+1),根據(jù)1.25倍原則得出各因素的另一水平點(diǎn)(-1),PB實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表2,PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3,PB實(shí)驗(yàn)的方差分析見表4。
表2 PB實(shí)驗(yàn)的因素與水平
表3 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
表4 PB實(shí)驗(yàn)的方差分析
對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,在雙因素交互作用不明顯的前提下評(píng)估其主效應(yīng)下的7個(gè)因素,得到其回歸方程為:Y=8.6275-0.1242X1-0.2308X2+ 0.0242X3+ 0.8208X4+ 0.3608X5-0.1908X6+ 0.0858X7。
2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表5,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方差分析見表7。
表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平
表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
表7 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方差分析
響應(yīng)面設(shè)計(jì)采用5個(gè)中心點(diǎn),29組實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行,重點(diǎn)考察各因素及因素之間的交互作用對(duì)山刺玫果總黃酮得率的影響,該模型的回歸方程為:Y=10.26+0.92A+0.36B-0.19C+0.22D+0.060AB+0.20AC+0.065AD-0.60BC+0.25BD-0.26CD-1.16A2-0.81B2-0.71C2-0.81D2。
2.2.2 各因素交互作用對(duì)山刺玫果總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖(圖2)
圖2 各因素交互作用對(duì)山刺玫果總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖
從圖2a可知,從等高線的形狀來看,其橢圓程度不大,說明提取功率與提取溫度的交互作用較弱;從曲面彎曲程度來看,提取功率的響應(yīng)值曲面彎曲程度大,提取溫度的響應(yīng)值曲面則較為平緩,說明提取功率較提取溫度對(duì)響應(yīng)面值影響顯著,隨兩因素?cái)?shù)值的增大,山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢(shì),截取山刺玫果總黃酮得率值最大點(diǎn)兩端的片段數(shù)據(jù),可以初步確定最佳提取功率取值范圍在136~152 W、提取溫度取值范圍在45~55 ℃。
從圖2b可知,從等高線的形狀來看,其橢圓程度不大,說明提取功率與提取液pH值的交互作用較弱;從等高線的疏密程度來看,靠近提取功率的等高線較靠近提取液pH值的等高線密集,則表明提取功率比提取液pH值對(duì)山刺玫果總黃酮得率的影響大;從曲面彎曲程度來看,提取功率的響應(yīng)值曲面圖彎曲程度大,提取液pH值的響應(yīng)值曲面則較為平緩,說明提取功率較提取液pH值對(duì)響應(yīng)面值影響顯著,隨兩因素?cái)?shù)值的增大,山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢(shì),截取距山刺玫果總黃酮得率值最大點(diǎn)較近兩端的片段數(shù)據(jù),可以初步確定最佳提取功率取值范圍在136~152 W、提取液pH值取值范圍在3.40~3.60。
從圖2c可知,從等高線的形狀來看,其橢圓程度不大,說明提取功率與乙醇濃度的交互作用較弱;從等高線的疏密程度來看,靠近提取功率的等高線較靠近乙醇濃度的等高線密集,表明提取功率比乙醇濃度對(duì)山刺玫果總黃酮得率的影響大;從曲面彎曲程度來看,提取功率的響應(yīng)值曲面彎曲程度大,乙醇濃度的響應(yīng)值曲面則較為平緩,說明提取功率較乙醇濃度對(duì)響應(yīng)面值影響顯著,隨兩因素?cái)?shù)值的增大,山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢(shì),截取距離山刺玫果總黃酮得率值最大點(diǎn)最近兩端的片段數(shù)據(jù),可以初步確定最佳提取功率取值范圍在136~152 W、乙醇濃度取值范圍在55%~65%。
從圖2d可知,從等高線的形狀來看,呈橢圓形,說明提取溫度與提取液pH值的交互作用較強(qiáng);從等高線的疏密程度來看,靠近提取溫度的等高線較靠近提取液pH值的等高線密集,表明提取溫度比提取液pH值對(duì)山刺玫果總黃酮得率的影響大;從曲面彎曲程度來看,提取溫度的響應(yīng)值曲面彎曲程度大,提取液pH值的響應(yīng)值曲面則較為平緩,說明提取溫度較提取液pH值對(duì)響應(yīng)面值影響顯著,隨兩因素?cái)?shù)值的增大,山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢(shì),截取山刺玫果總黃酮得率值最大點(diǎn)兩端的片段數(shù)據(jù),可以初步確定最佳提取液pH值取值范圍在3.40~3.80、提取溫度取值范圍在50~60 ℃。
從圖2e可知,從等高線的形狀來看,其橢圓程度不大,說明提取液pH值與乙醇濃度的交互作用較弱;從等高線的疏密程度來看,靠近乙醇濃度的等高線較靠近提取液pH值的等高線密集,則表明乙醇濃度比提取液pH值對(duì)山刺玫果總黃酮得率的影響大;從曲面彎曲程度來看,乙醇濃度的響應(yīng)值曲面彎曲程度大,提取液pH值的響應(yīng)值曲面則較為平緩,說明乙醇濃度較提取液pH值對(duì)響應(yīng)面值影響顯著,隨兩因素?cái)?shù)值的增大,山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢(shì),截取距離山刺玫果總黃酮得率值最大點(diǎn)最近兩端的片段數(shù)據(jù),可以初步確定最佳乙醇濃度取值范圍在55%~65%、提取液pH值取值范圍在3.40~3.60。
從圖2f可知,從等高線的形狀來看,其橢圓程度不大,說明提取溫度與乙醇濃度的交互作用較弱;從等高線的疏密程度來看,靠近提取溫度的等高線較靠近乙醇濃度的等高線密集,則表明提取溫度比乙醇濃度對(duì)山刺玫果總黃酮得率的影響大;從曲面彎曲程度來看,提取溫度的響應(yīng)值曲面彎曲程度大,乙醇濃度的響應(yīng)值曲面表現(xiàn)則較為平緩,說明提取溫度較乙醇濃度對(duì)響應(yīng)面值影響顯著,隨兩因素?cái)?shù)值的增大,山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢(shì),截取山刺玫果總黃酮得率值最大點(diǎn)最近兩端的片段數(shù)據(jù),可以初步確定最佳乙醇濃度取值范圍為55%~65%,提取溫度取值范圍在45~55 ℃。
2.2.3 最佳工藝的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
基于以上分析,確定山刺玫果總黃酮的最佳提取工藝為:提取功率148.09 W、提取溫度52.06 ℃、提取液pH值3.47、乙醇濃度62.38%,在此條件下,預(yù)測(cè)總黃酮得率為10.599 6 mg·g-1。根據(jù)實(shí)際可操作性原則,將最佳提取工藝優(yōu)化為:提取功率150 W、提取溫度55 ℃、提取液pH值3.5、乙醇濃度60%。在最佳提取工藝條件下進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn),得到山刺玫果總黃酮得率分別為10.72 mg·g-1、10.98 mg·g-1、10.20 mg·g-1,平均值為10.63 mg·g-1,與預(yù)測(cè)值相差0.03 mg·g-1,說明工藝數(shù)據(jù)可靠,該模型具有比較好的實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)性。
通過PB實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)山刺玫果總黃酮的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳提取工藝為:提取功率150 W、提取溫度55 ℃、提取液pH值3.5、乙醇濃度60%。在此條件下,山刺玫果總黃酮得率為10.63 mg·g-1。本研究先確定影響山刺玫果總黃酮的各個(gè)因素的最佳取值范圍,然后進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)及PB實(shí)驗(yàn),選取顯著因素再進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),避免因響應(yīng)面法中影響因素選取不當(dāng)而造成交互作用不明顯等現(xiàn)象。