王麗君 趙瑜 胡燁 郭君平 張煒

miRNAs是一類廣泛存在于真核生物體的非編碼小RNA分子，其生物學(xué)效應(yīng)廣泛，參與人體的生長發(fā)育、炎癥、免疫和腫瘤發(fā)生、發(fā)展等各個方面，是近年來的研究熱點(diǎn)[1]。miR-30a是miRNAs家族中的一員，在細(xì)胞生長和凋亡等多方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，與自噬關(guān)系尤為密切[2]，但目前miR-30a相關(guān)研究主要集中于腫瘤相關(guān)領(lǐng)域[3]，而對于其在炎癥模型中的作用卻知之甚少。在之前的研究中，筆者發(fā)現(xiàn)自噬在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell,VEC）炎癥模型的炎癥調(diào)控中扮演了重要角色[4]，而關(guān)于miR-30a是否也參與其中以及又是如何調(diào)控的，目前尚不清楚。因此，本研究探究miR-30a對LPS誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）自噬的影響及其可能機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 LPS購自美國Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)基和FBS均購自美國Gibco公司，細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體Lipofectamine 2000和總RNA提取試劑Trizol均購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒均購自大連寶生物有限公司，細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒miR-30a-mimic和miR-30a-NC均購自廣州銳博生物公司，CCK-8試劑盒、BCA試劑盒均購自上海碧云天科技有限公司；兔抗人自噬相關(guān)基因（autophagy related gene 3,Atg3）抗體、泛素結(jié)合蛋白p62抗體、自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）抗體、β-actin抗體和羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司；綠色熒光點(diǎn)-LC3（green fluorescence point-LC3,GFP-LC3）慢病毒質(zhì)粒購自上海漢恒生物科技有限公司，HUVEC細(xì)胞購自上海奧賽爾斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)：使用含10% FBS和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基處理HUVEC細(xì)胞，細(xì)胞置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，每隔24 h至于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：（1）LPS組：HUVEC細(xì)胞給予LPS 20 μg/ml刺激 24 h（模擬炎癥，激活自噬）；（2）NC組：HUVEC細(xì)胞加入miR-30a-NC轉(zhuǎn)染后再給予LPS 20 μg/ml刺激 24 h；（3）mimics 組：HUVEC 細(xì)胞加入miR-30a-mimics轉(zhuǎn)染后再給予LPS 20 μg/ml刺激24 h；（4）正常對照組（Control組）：HUVEC細(xì)胞不予任何處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：HUVEC細(xì)胞以每孔2×105個接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度70%左右，NC組和mimics組應(yīng)用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染miR-30a-NC和miR-30a-mimics，轉(zhuǎn)染方法參考試劑盒說明書，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。取對數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞，按3 000個/孔接種于96孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，更換培養(yǎng)液并按分組處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μl CCK-8工作液，培養(yǎng)1 h后用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的光密度（OD）值，并計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值）/（空白組OD值-空白孔OD值）×100%。

1.4 miR-30a相對表達(dá)量檢測 采用qRT-PCR法。將處理后的各組HUVEC細(xì)胞收集，采用Trizol法提取總RNA，測定總RNA濃度，取等量RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green進(jìn)行 qRT-PCR，參照 qRT-PCR試劑盒配置相應(yīng)的體系進(jìn)行擴(kuò)增，其中引物序列如下：miR-30a上游引物：5'-CACTCTCATGTAAACATCCTCGAC-3'，下游 引 物 ：5'-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3'，內(nèi)參U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，擴(kuò)增條件如下：95℃30 s預(yù)變性（1個循環(huán)），95℃5 s，60℃30 s共40個循環(huán)，實(shí)驗(yàn)完成后用2-ΔΔCt法計算miR-30a的相對表達(dá)量。

1.5 Atg3、p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ等自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。收集實(shí)驗(yàn)處理后的各組細(xì)胞，細(xì)胞充分裂解后提取總蛋白，BCA法測定總蛋白含量，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，TBST充分洗滌后加入一抗（Atg3、p62、LC3、β-actin，1∶1 000）4 ℃搖床過夜，TBST充分洗滌后加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白的表達(dá)情況，再用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

1.6 免疫熒光觀察細(xì)胞自噬小體形成 各組細(xì)胞用GFP-LC3慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h，更換培養(yǎng)液按分組處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS刺激后兩組細(xì)胞存活率和miR-30a相對表達(dá)量比較 LPS組細(xì)胞存活率明顯低于Control組，miR-30a相對表達(dá)量明顯低于Control組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），見表 1。

表1 LPS刺激后兩組細(xì)胞存活率和miR-30a相對表達(dá)量比較

2.2 LPS刺激后兩組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與Control組比較，LPS組細(xì)胞p62蛋白表達(dá)水平降低，Atg3蛋白表達(dá)水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1、表2。

圖1 脂多糖（LPS）刺激后兩組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖（Atg3為自噬相關(guān)基因3；LC3為自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3）

表2 LPS刺激后兩組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

2.3 轉(zhuǎn)染miR-30a后LPS刺激3組細(xì)胞存活率和miR-30a相對表達(dá)量比較 轉(zhuǎn)染miR-30a后，與LPS組比較，mimics組細(xì)胞存活率明顯升高，miR-30a相對表達(dá)量明顯上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表3 轉(zhuǎn)染miR-30a后LPS刺激3組細(xì)胞存活率和miR-30a相對表達(dá)量比較

2.4 轉(zhuǎn)染miR-30a后LPS刺激3組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 轉(zhuǎn)染miR-30a后，與LPS組比較，mimics組細(xì)胞p62表達(dá)水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Atg3表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖 2、表 4。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-30a后3組細(xì)胞p62、自噬相關(guān)基因3（Atg3）、自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)的電泳圖

表4 轉(zhuǎn)染miR-30a后3組細(xì)胞p62、Atg3、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

VEC是覆蓋于血管內(nèi)膜表面的單層細(xì)胞，能通過分泌多種血管活性物質(zhì)對各種信號作出反應(yīng)，對維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)也具有十分重要的意義[5]。當(dāng)VEC受到各種刺激或損傷時，細(xì)胞會產(chǎn)生適應(yīng)性自噬，并通過溶酶體吞噬降解受損細(xì)胞器和異常蛋白質(zhì)，為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，維持血管穩(wěn)態(tài)[6]，這種程度的自噬往往是有益的；但當(dāng)刺激持續(xù)存在或刺激強(qiáng)度過大時，細(xì)胞可能會發(fā)生過度的自噬而導(dǎo)致細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡，血管穩(wěn)態(tài)失衡[7]，這種自噬往往是有害的，因此調(diào)控自噬有可能成為動脈粥樣硬化治療的新靶點(diǎn)。miRNAs廣泛參與基因表達(dá)調(diào)控，可通過調(diào)控自噬過程中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，進(jìn)而參與動脈粥樣硬化的發(fā)病過程，具有重要調(diào)節(jié)作用[7]。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-30a后3組細(xì)胞自噬小體（箭頭所示綠色熒光點(diǎn)）變化的激光共聚焦圖（LPS為脂多糖）

miR-30a是與自噬關(guān)系最為密切的miRNAs之一。在多種腫瘤細(xì)胞模型中，miR-30a能通過靶向調(diào)控自噬相關(guān)基因Beclin1表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞自噬活性，從而影響腫瘤的增殖、侵襲和耐藥等各個方面[8-9]；在哮喘模型中，miR-30a能通過下調(diào)自噬相關(guān)基因5來抑制自噬，在氣道重塑中發(fā)揮抗纖維作用[10]；在急性肺損傷炎癥模型中，miR-30a能通過靶向調(diào)控人類runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2減輕LPS誘導(dǎo)的A549損傷和小鼠肺損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS處理后HUVEC細(xì)胞miR-30a相對表達(dá)水平下降，細(xì)胞活力降低，自噬水平增加（自噬的選擇性底物p62蛋白表達(dá)水平降低），說明LPS誘導(dǎo)HUVEC炎癥模型中存在過度自噬，與之前報道文獻(xiàn)相一致[12]；而進(jìn)一步用miR-30a-mimics過表達(dá)處理上調(diào)miR-30a水平后，發(fā)現(xiàn)這種LPS誘導(dǎo)的過度自噬明顯被抑制，細(xì)胞活力明顯回升，提示miR-30a能通過抑制過度自噬來減輕LPS誘導(dǎo)HUVEC損傷。

細(xì)胞自噬激活后主要受Atg調(diào)控[13]。其中Atg3是一個調(diào)控自噬的類泛素化的蛋白基因，主要參與自噬體延伸過程中的第2個泛素樣通路，促進(jìn)LC3和脂分子磷脂酰乙醇胺的結(jié)合，并在LC3-Ⅱ的形成中發(fā)揮重要作用[14]，LC3-Ⅱ是自噬標(biāo)志性蛋白，其含量與自噬泡數(shù)量呈正相關(guān)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ也是評估自噬水平高低的經(jīng)典指標(biāo)[15]；此外Atg3也參與了自噬蛋白的翻譯后磷酸化、乙酰化等多種修飾過程[16]。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞模型中，沉默Atg3可減輕自噬活性，通過上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤侵襲[17]；而在乳腺癌細(xì)胞模型中，過表達(dá)Atg3能夠通過細(xì)胞自噬抑制鹽霉素誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡[18]；在肝癌細(xì)胞模型中，miR-30a可靶向調(diào)控Atg3介導(dǎo)的自噬抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS作用于HUVEC后，Atg3蛋白表達(dá)水平增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高；而進(jìn)一步用miR-30a-mimics過表達(dá)處理上調(diào)miR-30a水平后，Atg3蛋白表達(dá)下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，GFPLC3單熒光自噬體系也直觀的發(fā)現(xiàn)自噬小體明顯減少，提示miR-30a能抑制自噬來減輕LPS誘導(dǎo)HUVEC損傷。但由于自噬受多種基因和蛋白的調(diào)控，miRNA只是眾多可能的調(diào)節(jié)因素之一，其他如lncRNA和circRNA等諸多因素都可能牽涉其中[20]，具體miR-30a是如何調(diào)控自噬，以及是否還有其它的具體調(diào)控因素和潛在機(jī)制都還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所示，過表達(dá)miR-30a能抑制LPS誘導(dǎo)HUVEC產(chǎn)生的過度自噬，從而減輕細(xì)胞損傷。因此，miR-30a可能是用于調(diào)控血管內(nèi)皮炎癥損傷的新治療靶點(diǎn)。