孫國(guó)磊，王一民

(1.天津市津南醫(yī)院急診科，天津300052； 2.中日友好醫(yī)院呼吸中心呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科二部，北京100029)

肺炎支原體是社區(qū)獲得性肺炎的常見(jiàn)病原體，我國(guó)肺炎支原體肺炎發(fā)病率較高，全國(guó)性多中心社區(qū)獲得性肺炎流行病學(xué)調(diào)查顯示，肺炎支原體肺炎占20%～30%，且兒童及青年人群的發(fā)病率可能更高[1-2]。肺炎支原體肺炎缺乏特異性臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)復(fù)雜多樣，早期快速診斷困難，導(dǎo)致肺炎支原體肺炎初始治療失敗風(fēng)險(xiǎn)及后續(xù)治療難度的增加。因此，了解肺炎支原體檢測(cè)的進(jìn)展對(duì)提高肺炎支原體肺炎的診治水平十分重要。

肺炎支原體是一種非典型病原體，無(wú)細(xì)胞壁，大小(0.1～0.3 nm)介于細(xì)菌及病毒之間，多可獨(dú)立存活，經(jīng)呼吸道飛沫傳播。肺炎支原體感染引起的感染性疾病可發(fā)生于任何年齡人群，兒童感染率高于成人，且患病率逐年增加。有研究報(bào)道，約50%的肺炎支原體感染患者的臨床表現(xiàn)明顯，大多數(shù)成人感染者僅出現(xiàn)上呼吸道感染癥狀[3]。但隨著疾病進(jìn)展，肺炎支原體感染不僅引起成人肺部嚴(yán)重疾病，還常導(dǎo)致心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等肺外并發(fā)癥。近年來(lái)，難治性肺炎以及耐藥性肺炎支原體感染病例逐年增加，每隔3～7年肺炎支原體感染會(huì)發(fā)生一次地方性流行或大流行，嚴(yán)重威脅居民身體健康[4]。肺炎支原體感染缺乏特異性臨床表現(xiàn)和影像學(xué)表現(xiàn)，且缺少微生物確診檢測(cè)方法，臨床診斷困難，易錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，因此提高肺炎支原體檢測(cè)的準(zhǔn)確性對(duì)減輕患者疾病負(fù)擔(dān)尤為重要。

病原體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的肺炎支原體診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，但存在檢測(cè)方法局限、靈敏度低等缺點(diǎn)，其對(duì)臨床診斷和治療的幫助有限?，F(xiàn)就肺炎支原體感染診斷方法的研究進(jìn)展予以綜述，以期提高肺炎支原體感染的診療水平。

1 臨床表現(xiàn)

人群對(duì)肺炎支原體普遍易感，尤其是兒童。由于小兒呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，故臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，且易出現(xiàn)肺內(nèi)外并發(fā)癥。肺炎支原體的常見(jiàn)臨床表現(xiàn)為干咳、胸悶氣促、發(fā)熱、頭痛、肌痛和胃腸道癥狀。大多數(shù)單純肺炎支原體感染者無(wú)明顯肺部體征，若感染波及其他系統(tǒng)可引發(fā)腦梗死、腦炎、腦膜炎、心動(dòng)過(guò)緩、急性腎小球腎炎、多形性紅斑或溶血性貧血等疾病[5-6]。此外，肺炎支原體感染者體溫變化較大，可出現(xiàn)低熱或超高熱，發(fā)熱前常出現(xiàn)畏寒癥狀?？傊窝字гw感染者缺乏特異臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者發(fā)病初期可表現(xiàn)類(lèi)似于普通上呼吸道感染的癥狀，故單純依據(jù)臨床癥狀診斷較困難，需借助其他輔助檢查加以鑒別。

2 影像學(xué)表現(xiàn)

近年來(lái)，影像學(xué)檢查在肺部感染診治中發(fā)揮著不可忽視的作用，以X線和CT檢查最常見(jiàn)，CT檢查的分辨率和定性診斷準(zhǔn)確率均高于X線，在肺部感染早期診斷中具有重要意義[7]。趙志勇等[8]比較細(xì)菌性、病毒性和支原體肺炎患者的CT影像學(xué)資料發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體肺炎主要以雙下肺居多(62.0%)；肺炎支原體肺炎與病毒性肺炎均存在間質(zhì)增厚、磨玻璃影等征象，但支氣管壁增厚是肺炎支原體肺炎區(qū)別于細(xì)菌性肺炎、病毒性肺炎的典型影像學(xué)。肺炎支原體肺炎的影像學(xué)表現(xiàn)復(fù)雜多樣，除上述特點(diǎn)外，還可見(jiàn)小葉中心結(jié)節(jié)(伴或不伴樹(shù)芽征)，肺泡腔內(nèi)滲出改變等，上述表現(xiàn)可先后出現(xiàn)或同時(shí)出現(xiàn)。另有研究顯示，重癥肺炎支原體肺炎病例CT影像常表現(xiàn)為葉段實(shí)變，類(lèi)似于細(xì)菌性肺炎[9]。日本一項(xiàng)回顧性研究顯示，39%的重癥暴發(fā)性肺炎支原體肺炎患者肺部存在葉段實(shí)變，其中25%以葉段實(shí)變?yōu)槲ㄒ挥跋駥W(xué)表現(xiàn)[10]。此外，影像學(xué)檢查可及時(shí)觀察肺內(nèi)病灶范圍及形態(tài)變化。因此，可通過(guò)CT聯(lián)合流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查等，對(duì)肺炎支原體感染進(jìn)行早期診斷和治療。

3 病原學(xué)檢測(cè)

3.1肺炎支原體分離培養(yǎng) 肺炎支原體繁殖速度緩慢，1～6 h分裂一代。肺炎支原體分離培養(yǎng)以鼻咽拭子、痰標(biāo)本、口咽分泌物、肺泡灌洗液和胸腔積液等作為培養(yǎng)標(biāo)本，以SP4作為培養(yǎng)基，一般在37 ℃、濕度60%～80%環(huán)境下，在瓊脂內(nèi)加入5%的CO2進(jìn)行培養(yǎng)[11]，這是肺炎支原體應(yīng)用最廣泛、最成功的培養(yǎng)手段。不同標(biāo)本的培養(yǎng)陽(yáng)性率不同，培養(yǎng)過(guò)程中需每天觀察培養(yǎng)基菌落的顏色和形態(tài)改變。劉金榮等[12]對(duì)比分析咽拭子和支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本肺炎支原體培養(yǎng)的差異發(fā)現(xiàn)，兩者熒光聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)的陽(yáng)性率均為86.2%(25/29)，結(jié)果一致率為93.1%(27/29)；其中，肺泡灌洗液培養(yǎng)陽(yáng)性率為65.5%(19/29)，標(biāo)本污染率為6.9%(2/29)，咽拭子標(biāo)本陽(yáng)性率為51.7%(15/29)，污染率51.7%(15/29)；故認(rèn)為咽拭子可作為熒光PCR定性檢測(cè)標(biāo)本，但不適合用于病原體定量研究，而肺泡灌洗液更適合用于肺炎支原體分離培養(yǎng)研究。因此，可根據(jù)患者耐受程度、標(biāo)本獲取難度、臨床表現(xiàn)等具體情況選擇標(biāo)本種類(lèi)，并在留取標(biāo)本后及時(shí)保存運(yùn)輸，以免影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。隨著耐藥性及難治性肺炎支原體感染的增多，分離培養(yǎng)法的應(yīng)用率明顯升高，但尚缺乏統(tǒng)一的肺炎支原體分離培養(yǎng)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。分離培養(yǎng)法可有效確定肺炎支原體的致病性及藥物敏感性，被稱(chēng)為診斷肺炎支原體的金標(biāo)準(zhǔn)之一，但存在培養(yǎng)長(zhǎng)、培養(yǎng)基昂貴、培養(yǎng)陽(yáng)性率較低等缺點(diǎn)，臨床應(yīng)用受限。分離培養(yǎng)與鑒定技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，臨床難以開(kāi)展，且無(wú)法滿足臨床極危重癥病例的需要。

3.2抗原檢測(cè) 肺炎支原體抗原檢測(cè)方法包括直接免疫熒光法、蛋白印跡法、對(duì)流免疫電泳等，但靈敏度低，易與呼吸道其他病原出現(xiàn)交叉反應(yīng)，診斷準(zhǔn)確率較低，臨床應(yīng)用受阻，故通常該檢測(cè)結(jié)果不作為診斷依據(jù)[13]。

3.3抗體檢測(cè) 人體感染肺炎支原體后產(chǎn)生特異性抗體，包括免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M、IgG和IgA，臨床常采用IgM和IgG抗體進(jìn)行檢測(cè)。血清IgM抗體出現(xiàn)較早，臨床癥狀出現(xiàn)1周后可被檢出，10～30 d達(dá)高峰，12～26周消失；IgG在IgM之后產(chǎn)生，1個(gè)月左右達(dá)高峰，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。抗體檢測(cè)方法有冷凝集試驗(yàn)(cold agglutination test，CAT)、免疫熒光試驗(yàn)(immunofluorescence assay，IFA)、間接血凝試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等。

冷凝集是機(jī)體對(duì)肺炎支原體感染產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)，其冷凝集素為IgM抗體，可在0～5 ℃內(nèi)凝集紅細(xì)胞，但CAT不能直接用于肺炎支原體檢測(cè)。研究表明，約75%的患者在肺炎支原體感染后7～10 d冷凝集素滴度≥1∶32，并常于6～8周后逐漸恢復(fù)正常，因此冷凝集素滴度越高，提示肺炎支原體感染的可能性越大[14]。由于支原體感染抗體與巨細(xì)胞病毒感染、自身免疫性疾病等存在交叉，故CAT的特異性較低。李觀穎[15]比較CAT和ELISA早期檢測(cè)肺炎支原體的價(jià)值顯示，CAT檢測(cè)的陽(yáng)性率明顯低于ELISA，但兩種方法的檢測(cè)陽(yáng)性率均隨發(fā)熱時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。

IFA基于抗原-抗體反應(yīng)，包括直接IFA和間接IFA，目前間接IFA較常用。于艷紅等[16]通過(guò)間接IFA、被動(dòng)凝集法、化學(xué)發(fā)光法對(duì)沈陽(yáng)兒童醫(yī)院162例呼吸道感染患兒進(jìn)行肺炎支原體IgM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，間接IFA和被動(dòng)凝集法的檢測(cè)靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度高于化學(xué)發(fā)光法，且間接IFA的檢測(cè)特異度高于被動(dòng)凝集法、化學(xué)發(fā)光法。梅方超等[17]的研究提示，培養(yǎng)法檢測(cè)肺炎支原體感染的特異度高，但靈敏度較低，對(duì)操作者技術(shù)要求較高，同時(shí)IFA檢測(cè)靈敏度和特異度均較高，可作為早期篩查的方法。

顆粒凝集法是使用肺炎支原體體細(xì)胞膜成分致敏乳膠或明膠顆粒，在室溫下共同培養(yǎng)待檢血清和致敏顆粒，若血清內(nèi)存在特異性抗體，易發(fā)生顆粒凝集，肉眼可見(jiàn)抗體反應(yīng)，主要是共同檢測(cè)抗體IgG及IgM。該方法操作方便、快捷，但不同抗體滴度條件下的診斷靈敏度及特異度存在差異，抗體滴度≥1:160時(shí)，診斷效力最強(qiáng)。嚴(yán)華杰等[18]發(fā)現(xiàn)，被動(dòng)顆粒凝集法檢測(cè)肺炎支原體IgM的陽(yáng)性率高于間接IFA。李勝兵[19]報(bào)道，被動(dòng)顆粒凝集法、間接IFA檢測(cè)肺炎支原體的陽(yáng)性率分別為33.06(81/245)和28.98%(71/245)，兩種方法檢測(cè)一致性Kappa值為0.733，具有中等程度的診斷一致性，故兩者聯(lián)合檢測(cè)可為肺炎支原體感染提供全面診斷依據(jù)。因此，顆粒凝集法可用于肺炎支原體感染診斷，但其與間接IFA聯(lián)合應(yīng)用仍需進(jìn)一步探討。

ELISA是將酶標(biāo)記抗人IgM及IgG單克隆抗體，可分別檢測(cè)血清抗體IgM、IgG，并進(jìn)行定量分析，可與PCR技術(shù)相比擬，不需要特殊設(shè)備，但個(gè)別患者需采集雙份血清。黃象維等[20]研究顯示，ELISA檢測(cè)肺炎支原體的陽(yáng)性率高于CAT，且發(fā)熱1～3 d、4～7 d、8～14 d、≥15 d采用ELISA檢測(cè)肺炎支原體的陽(yáng)性率均明顯高于CAT。岳曉紅等[21]報(bào)道稱(chēng)，實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)、膠體金法及ELISA可用于發(fā)病初期肺炎支原體檢測(cè)，膠體金法和ELISA可用于疾病痊愈期肺炎支原體的檢測(cè)。由此可見(jiàn)，ELISA可用于疾病早期及疾病痊愈期的肺炎支原體檢測(cè)。另外，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)主要檢測(cè)抗體IgM，但容易與生殖道支原體、人體組織等產(chǎn)生交叉反應(yīng)，且操作繁雜，不適宜在臨床應(yīng)用。

在肺炎支原體感染急性期和恢復(fù)期，肺炎支原體抗體滴度升高4倍以上，是臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)病1周左右IgM陽(yáng)性率約為80%，且血清IgM抗體滴度隨癥狀的持續(xù)而增高，其診斷靈敏度隨之增高[22]，IgM陽(yáng)性提示近期感染；因此，IFA和(或)顆粒凝集法、ELISA可用于肺炎支原體感染的早期診斷。IgG抗體陽(yáng)性并不提示肺炎支原體的現(xiàn)癥感染，可用于回顧性診斷及流行病學(xué)調(diào)查。目前我國(guó)肺炎支原體抗體試劑盒的靈敏度及特異度參差不齊，有學(xué)者曾經(jīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR的檢測(cè)結(jié)果對(duì)臨床普遍使用的12種商用肺炎支原體IgM試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肺炎支原體肺炎發(fā)病6 d內(nèi)，多數(shù)肺炎支原體IgM試劑盒的陽(yáng)性率低于10%，陽(yáng)性率最高者低于30%[23]?？梢?jiàn)，絕大多數(shù)醫(yī)院僅通過(guò)血清學(xué)抗體檢測(cè)不能實(shí)現(xiàn)肺炎支原體肺炎的及時(shí)確診。

3.4分子診斷技術(shù) 分子診斷技術(shù)自20世紀(jì)60年代出現(xiàn)以來(lái)，大致經(jīng)歷了基于分子雜交的分子技術(shù)、核酸測(cè)序技術(shù)、基于分子構(gòu)象的分子診斷技術(shù)、定量PCR技術(shù)等階段。目前，分子診斷技術(shù)檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度、特異度得到了快速提升。

3.4.1核酸雜交 通過(guò)檢測(cè)使用生物素、酶等標(biāo)記的探針和核酸片段得到的特異雜交信號(hào)確定病原體是最先出現(xiàn)的核酸雜交技術(shù)。探針是核酸雜交的關(guān)鍵，1987年Hyman[24]用載體構(gòu)建支原體基因文庫(kù)，并從中篩選制備出特異性DNA探針，通過(guò)斑點(diǎn)雜交，可檢測(cè)僅含0.1 ng的特異性支原體DNA，其檢測(cè)的特異度和靈敏度接近100%，尤其是隨后的熒光原位雜交，在分子診斷技術(shù)早期發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，但該技術(shù)主要應(yīng)用于生殖道支原體(如人型支原體)感染的診斷。

3.4.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了臨床肺炎支原體等非典型病原體病原分離培養(yǎng)困難的缺陷。Morozumi等[25]采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)429例成人和兒童肺炎臨床標(biāo)本中的肺炎支原體16S核糖體RNA，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅耗時(shí)2 h，且較傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法的靈敏度和特異度大大提高，PCR技術(shù)檢測(cè)快、靈敏度和特異度高，可用于肺炎支原體感染的早期診斷。劉君麗[26]研究顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)可作為診斷前期肺炎支原體感染的可靠、有效方法。馮志山等[27]報(bào)道，熒光定量PCR與多重PCR檢測(cè)肺炎支原體的一致性高于被動(dòng)凝集法，且熒光定量PCR的肺炎支原體陽(yáng)性檢出率與患者病程相關(guān)。此外，肺炎支原體感染易合并病毒和細(xì)菌混合感染，難以區(qū)分?jǐn)y帶者或感染者，因此PCR陽(yáng)性結(jié)果仍需進(jìn)一步分析才能確診。

在病原耐藥性檢測(cè)中，PCR也起到了重要作用。近年來(lái)，全球范圍內(nèi)肺炎支原體大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的耐藥率呈上升趨勢(shì)，調(diào)查顯示，北美地區(qū)肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的耐藥率已經(jīng)超過(guò)10%，東亞地區(qū)是全球肺炎支原體大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物耐藥情況最嚴(yán)重的地區(qū)，其中日本和中國(guó)肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的耐藥率均已接近90%，我國(guó)肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的耐藥水平普遍為高水平耐藥[28]。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物治療失敗不僅導(dǎo)致支原體肺炎退熱時(shí)間和抗感染療程延長(zhǎng)，少數(shù)患者也因未得到及時(shí)有效治療而進(jìn)展為重癥肺炎，甚至危及生命[29]。研究發(fā)現(xiàn)，1/3經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素治療支原體感染者23S核糖體RNA基因出現(xiàn)了點(diǎn)突變[30]，其核糖體蛋白質(zhì)L4和L22沒(méi)有變化，核糖體RNA基因選擇性突變，造成了對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的耐藥。Stakenborg等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體對(duì)應(yīng)的16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素敏感菌株的最低抑菌濃度只有0.03～0.125 μg/mL，耐藥菌株的最低抑菌濃度為8～16 μg/mL；對(duì)應(yīng)的15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素敏感菌株僅0.06～0.5 μg/mL，耐藥菌株的最低抑菌濃度>64 μg/mL。應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行耐藥檢測(cè)，減少了培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)等復(fù)雜的檢驗(yàn)步驟。

3.5其他指標(biāo) 為進(jìn)一步提高肺炎支原體感染的診斷準(zhǔn)確性，吳素麗等[32]對(duì)328例疑似肺炎支原體感染患者進(jìn)行分析，根據(jù)DNA結(jié)果分為肺炎支原體陽(yáng)性組和肺炎支原體陰性組，并選取健康兒童作為對(duì)照發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體感染患者外周血白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、D-二聚體水平升高，各指標(biāo)對(duì)肺炎支原體感染具有一定的診斷價(jià)值，聯(lián)合運(yùn)用有助于肺炎支原體的臨床篩查及早期診斷。張玲玲等[33]利用ELISA檢測(cè)對(duì)比肺炎支原體肺炎、非肺炎支原體肺炎患兒和健康兒童的血清標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，血清七肽TVNFKLY和LPQRLRT可作為診斷兒童肺炎支原體肺炎的潛在標(biāo)志物，兩者聯(lián)合診斷兒童肺炎支原體肺炎的靈敏度為92.5%(111/120)，特異度為90.83%(218/240)，準(zhǔn)確度為91.39%(329/360)。另有研究發(fā)現(xiàn)，重癥暴發(fā)性支原體肺炎患兒血清C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8及腫瘤壞死因子-α表達(dá)水平均顯著升高，提示上述細(xì)胞因子參與了重癥肺炎的發(fā)生、發(fā)展[34]，但缺乏診斷特異性。

4 小 結(jié)

近年來(lái)，肺炎支原體感染的患病率處于較高水平，缺乏特異性臨床特征，無(wú)法快速診斷且存在病原菌耐藥給肺炎支原體肺炎的臨床治療帶來(lái)很大困難，嚴(yán)重威脅患者健康，甚至威脅重癥患者生命安全。深入研究肺炎支原體檢測(cè)方法和診斷標(biāo)志物對(duì)肺炎支原體肺炎的及時(shí)診斷具有重要的臨床意義。與分離培養(yǎng)、血清抗原抗體檢測(cè)相比，分子診斷技術(shù)具有檢測(cè)快、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于肺炎支原體感染的早期診斷，也可用于耐藥性檢測(cè)以及肺炎支原體感染者與攜帶者的鑒別。