李紀(jì)偉 黎韻詩 劉亞婷 曹譽 賴厚樺 易佩偉 汪艷

近年來，臨床肝病診斷方法進展迅速，但肝組織活檢目前仍是作為診斷標(biāo)準(zhǔn)的檢查方法[1]。不可忽視的是，肝組織活檢是創(chuàng)傷性檢查，不容易被患者接受，終末期肝病患者存在檢查禁忌證，而且這種方法還存在標(biāo)本取樣誤差等缺點。因此，研發(fā)高效且準(zhǔn)確的無創(chuàng)診斷技術(shù)一直是臨床肝病相關(guān)領(lǐng)域關(guān)注的熱點內(nèi)容。

糖脂代謝是肝組織的重要生理功能，在已知的許多常見肝病，尤其是脂肪性肝病中，肝組織的糖脂代謝過程(能力)常常出現(xiàn)顯著改變，這種變化與肝組織損傷的出現(xiàn)與進展存在密切聯(lián)系[2]。核磁共振波譜(MRS)和核磁共振影像(MRI)在肝病診斷和肝組織結(jié)構(gòu)功能分析方面顯示出了重要應(yīng)用價值。建立特異性分析肝組織糖脂代謝的NMR方法，從中獲得MRS和MRI數(shù)據(jù)，由此分辨肝組織病理特征，也許可以取代肝活檢，幫助實現(xiàn)重要臨床肝病的早、中期診斷。

本篇綜述引用的文獻資料主要來自中國知網(wǎng)、ScienceDirect、PubMed，涉及2003年、2007年、2010至2020年的34篇相關(guān)研究，分析了MRS和MRI在肝臟糖、脂代謝方面的主要方法及其優(yōu)缺點。

一、研究現(xiàn)狀

目前，在分析肝組織糖代謝方面，正電子發(fā)射斷層掃描(PET)取得了較好效果，該技術(shù)最常用的代謝底物是葡萄糖類似物2-氟-2-脫氧-d-葡萄糖(18F-FDG)。雖然通過該方法可得到較高分辨率的葡萄糖攝取圖像，但無法獲知葡萄糖代謝的具體過程，而且18F-FDG具有放射性，限制了重復(fù)掃描[3]。與之相比，結(jié)合穩(wěn)定同位素1H、13C和31P的雜核MRS和MRI分析，以及新型的化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移(CEST)成像技術(shù)或許能提供一些新思路。

在肝組織脂代謝方面，雖然傳統(tǒng)的T1WI、T2WI、擴散加權(quán)成像(DWI)等MRI技術(shù)可以從宏觀角度分析肝組織脂肪分布狀態(tài)，得出精確至可應(yīng)用于臨床的結(jié)果[4-7]，但在微觀脂代謝分析方面仍需進一步研究。并且肝臟作為人體最重要的代謝器官之一，擁有復(fù)雜的代謝路徑，各種物質(zhì)相互干擾以及當(dāng)前檢測手段的局限性都阻礙了微觀脂代謝分析的進一步發(fā)展。

二、糖代謝研究進展

(一)雜核MRS與MRI分析

1.超極化13C MRS

相比于MRI常用的1H原子核，13C原子核的旋磁比很小，在自然狀態(tài)下的豐度比較低，因此一般情況下采集的MR信號的靈敏度非常低。應(yīng)用動態(tài)核極化(DNP)技術(shù)(目前被廣泛稱為超極化)，可提高13C原子核自旋極化能級，進而極大提高13C原子核的檢測靈敏度。早在2003年Ardenkjaer-Larsen等的研究就表明，超極化技術(shù)可以將13C原子核的能級暫時重新分配到極不穩(wěn)定的非平衡狀態(tài)，核磁共振信噪比可增加近10 000倍[8]。但是隨著原子核與周圍化學(xué)環(huán)境不斷發(fā)生相互作用，此種非平衡狀態(tài)持續(xù)時間通常不到60 s。Lumata等研發(fā)了溶解性動態(tài)核極化(d-DNP)，通過微波將較高極化的電子自旋轉(zhuǎn)移到原子核自旋，從而在系統(tǒng)的塞曼能級上產(chǎn)生較大的自旋分布差異，增強了磁共振的信號。他們還將這種超極化技術(shù)與靈敏的超低溫探頭相結(jié)合，獲得了目前最高的13C核磁共振靈敏度[9]。

盡管超極化后的13C原子核可以具有很高的檢測靈敏度，但是它的極化壽命非常短。例如[1-13C]丙酮酸鹽在體內(nèi)的極化壽命約為30 s，這意味著實驗人員必須在注射極化物質(zhì)后2～3 min內(nèi)完成成像工作。針對這一問題，Rodrigues等提出降低分子中13C取代度來減小同核偶極馳豫，可以延長其極化壽命[10]。

目前13C MRS已經(jīng)廣泛應(yīng)用于體內(nèi)實驗檢測，能夠?qū)崟r對多種底物及其代謝物進行波譜和影像的定量分析。Khemtong等通過在大鼠心臟中灌注超極化[1-13C]丙酮酸后，原位施加異丙腎上腺素，發(fā)現(xiàn)經(jīng)異丙腎上腺素刺激后，心臟代謝產(chǎn)生了新的超極化[1-13C]乳酸信號，這是由組織中糖原的乳酸含量突然增加引起的[11]。該實驗表明超極化丙酮酸和13C MRS可用于無創(chuàng)檢測體內(nèi)組織中的異常糖原代謝。

2.基于2H MRS的氘核代謝成像(DMI)

DMI技術(shù)可以在機體代謝過程中對2H原子核所標(biāo)記的底物進行掃描，并結(jié)合2H MRS與三維空間相位編碼技術(shù)，創(chuàng)建出包含細胞代謝信息的代謝物圖像。該技術(shù)首次由耶魯大學(xué)De Feyter團隊在2018年提出。他們研究證明，利用DMI技術(shù)可以區(qū)分體內(nèi)正常和異常代謝組織，檢測由于臨床治療引起的葡萄糖代謝變化，該技術(shù)應(yīng)用于肝臟還可以動態(tài)測量糖原轉(zhuǎn)換率[3]。他們還繪制了動物模型和人類受試者的大腦和肝臟組織中2H標(biāo)記的葡萄糖或醋酸鹽的代謝圖，進一步證明了DMI技術(shù)的應(yīng)用潛力[3]。

DMI的臨床應(yīng)用潛力還體現(xiàn)在只需要很小技術(shù)修改以及增設(shè)在2H NMR頻率(19.6MHz)工作的射頻線圈，就能使用3T MRI進行技術(shù)操作。但在肝臟中應(yīng)用時，[6,6'-2H2]葡萄糖和標(biāo)記的糖原在2H MRS中存在著譜峰重疊的問題。因此需要進一步量化譜峰重疊的程度，或探索改變葡萄糖分子中使用2H標(biāo)記的結(jié)構(gòu)位點是否可以避免該問題出現(xiàn)[3]。

3.31P MRS

31P MRS技術(shù)可以在活體條件下無創(chuàng)地檢測出體內(nèi)的ATP濃度。Gallis等實驗證實了，在凈糖原合成期間，ATP和糖原的含量呈線性關(guān)系[12]。因此可以通過計算線粒體ATP的原位轉(zhuǎn)換速率，測定ATP的變化，來間接反映糖原代謝的變化?；瘜W(xué)缺血(氧化磷酸化的抑制)和31P MRS的結(jié)合是目前分辨線粒體供應(yīng)ATP的主要方法。Beauvieux等運用31P MRS技術(shù)研究了酒精對線粒體ATP轉(zhuǎn)換和糖原生成之間關(guān)系的影響；他們發(fā)現(xiàn)與單獨葡萄糖比較，酒精和葡萄糖會導(dǎo)致更少的凈糖原生成[13]。

總體而言，這種基于31P MRS的方法比較復(fù)雜，而且得到的數(shù)據(jù)也只是間接反映糖原的代謝變化，在檢測肝臟糖代謝方面，不如超極化13C MRS和DMI技術(shù)應(yīng)用廣泛。

(二)化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移(CEST)成像技術(shù) CEST MRI技術(shù)可以通過選擇性飽和肝臟組織中特定分子含有的可交換質(zhì)子，例如酰胺質(zhì)子、亞氨基質(zhì)子、氨基質(zhì)子及羥基質(zhì)子，將可交換質(zhì)子的飽和和信號在化學(xué)交換過程中轉(zhuǎn)移到本體水分子信號上，通過檢測水分子信號的降低來間接獲得相應(yīng)化合物的相關(guān)信息[14]。CEST MRI在高特異性顯示體內(nèi)游離的蛋白質(zhì)、黏多糖GAG、糖原、葡萄糖等一些生化分子方面具有極大優(yōu)勢。van Zijl等最早用化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移成像檢測體內(nèi)糖原，即GlycoCEST實驗，他們發(fā)現(xiàn)對水質(zhì)子低場方向0.5～1.5 ppm范圍內(nèi)的羥基質(zhì)子實施選擇性射頻(RF)飽和后，可以通過檢測選擇性飽和后的水信號，來間接獲取體內(nèi)糖原分子的信息[15]，如可以檢測給予胰高血糖素灌注后小鼠肝臟的糖原分解。但值得注意的是，體內(nèi)糖原分子濃度、大小和結(jié)構(gòu)，以及常規(guī)半固態(tài)組織中的磁化轉(zhuǎn)移效應(yīng)的不對稱性，都會影響到GlycoCEST檢測結(jié)果[15]。

GlycoCEST在臨床MRI掃描儀中的信號比在科學(xué)研究專用的超高場MRI掃描儀中的信號要低得多，同時由于臨床常用場強下質(zhì)子的絕對化學(xué)位移較小，水信號的直接飽和效應(yīng)(DS)和羥基共振頻率附近的CEST信號可能會影響糖基化信號[16]，因而在臨床常用的1.5T和3T MRI掃描儀應(yīng)用方面，很少有關(guān)于體內(nèi)肝臟GlycoCEST成像結(jié)果的報道。最近Deng等首次評估了基于3T MRI進行活體肝臟CEST成像的可行性。他們使用連續(xù)矩形脈沖進行預(yù)飽和，快速自旋回波(TSE)讀出信號，在偏移量(n=41，增量=0.25 ppm)為-5至5 ppm時獲取影像，在大鼠進餐前后血糖變化模型測量到了同向變化的GlycoCEST信號[17]。

CEST成像具有空間分辨率較高、無輻射、無需特殊的射頻系統(tǒng)、不受探測深度限制等優(yōu)點，但它也存在一些限制因素，例如CEST成像對磁體場強要求較高，采集信號時間過長導(dǎo)致掃描范圍局限，且成像極易受周圍環(huán)境因素影響，很多活體內(nèi)代謝物質(zhì)的飽和頻率非常接近而容易引起交叉飽和，這些都會影響CEST成像結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確度[18]。

三、脂代謝研究進展

(一)質(zhì)子密度脂肪含量(PDFF)的測定 PDFF能夠?qū)φ麄€肝臟的脂肪進行準(zhǔn)確、無創(chuàng)、可重復(fù)的定量評估。它可通過消除T1和T2*弛豫時間、脂肪的復(fù)雜頻譜特征、MRI信號的噪聲偏差、以及MRI系統(tǒng)的不穩(wěn)定性，計算質(zhì)子密度脂肪分數(shù)。不少研究已證明，其結(jié)果與肝活檢測定的肝組織脂肪變程度具有高度相關(guān)性[19,20]。計算肝臟PDFF關(guān)鍵在于所獲得的MR圖像中的水-脂肪信息。Bannas等研究發(fā)現(xiàn)，可利用溫度校正后的脂肪-水重構(gòu)技術(shù)和MRS波譜校準(zhǔn)，解決水和脂肪之間與溫度相關(guān)的共振頻率偏移問題，第一次進行PDFF成像后，立即使用高分辨率成像技術(shù)重復(fù)采樣，可評估實驗的一致性、可靠性和重復(fù)性[20]。Caussy C等研究證明，通過評估并調(diào)整控制衰減參數(shù)，水-脂肪MRI所得到的PDFF可以達到組織學(xué)量化的精度[21]。以上方法均可校正PDFF數(shù)據(jù)、提升測量精度。

MRS和MRI-PDFF都可以達到組織學(xué)測量、活檢測定的精度[20,22,23]。但是與MRS在單一體素內(nèi)精確測量生化信息相比，MRI-PDFF具有更高的空間分辨率，其測量結(jié)果可以反映脂肪在肝臟的空間分布，它也可以長期測量脂肪沉積代謝，量化肝臟脂肪在臨床試驗中的變化。作為一種方便快捷、價格低廉的肝臟脂肪定量技術(shù)，MRI-PDFF在實驗研究中正逐漸取代MRS技術(shù)。為進一步提升其測量精度，改進脂肪信號分析模型是主要研究方向[24]。

(二)標(biāo)記示蹤

1.超極化磁共振

超極化磁共振可以通過體內(nèi)實時測量化學(xué)位移值進行無創(chuàng)的生化反應(yīng)測量，并通過調(diào)整成像參數(shù)和增強核極化提供足夠的靈敏度，從而獲得高空間、高時間分辨率的數(shù)據(jù)。除了可獲得特定的真實信息，該技術(shù)還具有分辨不同代謝物的能力，這在一定程度上克服了傳統(tǒng)MR成像靈敏度較差的缺點[8,25-27]。在MRI檢測中獲得的超極化標(biāo)記化合物的獨特信號，可以顯示酶的代謝過程、中間產(chǎn)物以及轉(zhuǎn)歸形式[28]。根據(jù)此特性，研究人員可以標(biāo)記感興趣的物質(zhì)，從微觀角度跟蹤肝臟脂肪代謝過程。

在生物體內(nèi)的MRI檢測中，代表性的脂代謝底物長鏈脂肪酸需要與白蛋白結(jié)合才能在水中溶解，而此結(jié)合會使標(biāo)記的13C去極化，對檢測造成負面影響，但水溶性短鏈脂肪酸(如丁酸鹽類)對其影響則相對較小。丁酸鹽快速代謝產(chǎn)生的乙酰乙酸、谷氨酸都適合作為檢測標(biāo)記物[29-30]。乙酰乙酸具有長T1的羰基，結(jié)構(gòu)上適合13C超極化研究，但目前尚未有相關(guān)文獻報道。極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白是肝臟脂肪代謝的重要載體分子，但相關(guān)研究目前較少。脂肪代謝相關(guān)的標(biāo)記底物及其最佳測量技術(shù)參數(shù)應(yīng)作為今后的研發(fā)目標(biāo)。

2.穩(wěn)定同位素通量/同位素標(biāo)記代謝通量分析

通量研究的關(guān)鍵步驟之一是根據(jù)代謝物的同位素分布，準(zhǔn)確地測量代謝物的標(biāo)記模式。MRS和質(zhì)譜(MS)是定量同位素的兩大主要技術(shù)。MRS解析可以提供同位素所富集分子的大小以及在富集分子中的位置等信息。MRS技術(shù)具有樣品制備簡單的優(yōu)勢，但也存在吞吐量小，分析速度較慢，核磁共振信號敏感性低，以及分析通量較低導(dǎo)致成本高等問題，這都阻礙了MRS在生物醫(yī)學(xué)研究中更廣泛的應(yīng)用。相比之下，靈敏度更高和操作更簡單的MS分析，已經(jīng)成為基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的代謝相關(guān)研究的首選技術(shù)。但在許多應(yīng)用場合中，這兩種方法是相輔相成的[31]。

遺憾的是，目前還沒有基于穩(wěn)定同位素通量的方法體系，用于估計線粒體外循環(huán)脂肪酸氧化的作用程度。在脂肪性肝病患者肝組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)中，線粒體外脂肪酸氧化的作用機制尚未清楚。雖然肝細胞中的微粒體和過氧化物酶體脂肪酸氧化可以在體外模型和動物體內(nèi)用放射性同位素測定，但這些方法目前還不適用于人體研究。

四、未來展望

以上所介紹的相關(guān)方法均在發(fā)展進程中，各有優(yōu)勢特點而且個別方法還不夠成熟，需要使用臨床通用的檢測技術(shù)，如組織活檢、CT、PET、組織學(xué)分析等作為參照指標(biāo)加以對比判斷[32-33]。有學(xué)者在動物實驗的通量研究中使用長鏈脂肪酸熒光探針實時定位定量脂肪[34]，這提示對肝組織糖脂代謝的分析方法也許還可以在其代謝通路中尋找突破點?；贛RS與MRI分析肝臟糖、脂代謝過程的技術(shù)發(fā)展未來可期，這可能是通向?qū)崿F(xiàn)無創(chuàng)診斷肝臟疾病的重要技術(shù)方案。更多新型的分析方法或工具以及定量、精細的分析模型的出現(xiàn)，將不斷推動核磁共振方法在測量肝組織糖脂代謝中的應(yīng)用和普及。