陳柳汛 劉旭東 張楊宇博 鄭輝 梅浙川

肝細胞癌(HCC)是常見的消化系統(tǒng)疾病,是我國第五大常見腫瘤,第二大癌癥致死病因。在全球范圍內(nèi),肝細胞癌已成為第六大最常見腫瘤和第四位致死原因。近年來,隨著精準醫(yī)學的發(fā)展,肝細胞癌的免疫治療越來越受到關(guān)注。當機體發(fā)生腫瘤時,免疫系統(tǒng)可以識別并清除微環(huán)境中的腫瘤細胞,但在病理條件下,腫瘤細胞通過抑制人體免疫系統(tǒng),使 T 細胞無法識別和殺傷腫瘤細胞,從而逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除。近年來,越來越多的研究證實,免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint blockade,ICB)可以通過解除免疫檢查點的免疫抑制功能,去除肝癌細胞免疫逃逸作用,將免疫檢查點抑制劑應(yīng)用于臨床,已成為抗腫瘤治療最新手段。細胞毒性 T 淋巴細胞相關(guān)蛋白(CTLA-4)、程序性死亡蛋白-1(PD-1)、淋巴細胞活化基因-3(LAG-3)和 T 細胞免疫蛋白-3(TIM-3)是腫瘤免疫治療最常靶向的免疫檢查點,本文就近年來免疫檢查點在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的機制及其臨床應(yīng)用的最新研究進行綜述。

一、肝癌腫瘤免疫

T 淋巴細胞是抗腫瘤免疫應(yīng)答主要效應(yīng)細胞。在正常情況下,初始 T 細胞能夠識別由抗原提呈細胞(APC)結(jié)合的腫瘤抗原,并在共刺激信號分子作用下,激活 T 細胞表面受體胞內(nèi)段免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM),然后激活MAPK或 NF/κB 信號通路[1],初始 T 細胞活化為效應(yīng) T 細胞,從而參與抗腫瘤免疫應(yīng)答。近期研究表明,T 細胞在腫瘤組織內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)前,在淋巴結(jié)外能通過與新的APC 或其他淋巴細胞相互作用而受到二次調(diào)節(jié),從而決定被激活的 T 細胞是否繼續(xù)發(fā)揮腫瘤殺傷效應(yīng)[2]。已有研究證實,腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment ，TME)含有大量免疫抑制細胞和分子,能誘導(dǎo) T細胞上調(diào)免疫檢查點受體的表達,導(dǎo)致 T 細胞喪失抗腫瘤功能,引發(fā)腫瘤細胞免疫逃逸[3]。免疫抑制分子中,CTLA-4、PD-1、LAG-3 及TIM-3是近年來的研究熱點。此外,免疫抑制性細胞在腫瘤細胞免疫逃逸中扮演了重要角色,其中調(diào)節(jié)性 T 細胞(Treg)和髓源抑制性細胞(MDSCs)是免疫抑制性細胞中最重要的成分。臨床研究提示,腫瘤組織中的 Treg 含量越高,則肝癌患者預(yù)后越差[4]。因此 Treg 在肝癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。骨髓源性抑制細胞(MDSCs)在腫瘤微環(huán)境(TME)中能促進血管生成和免疫抑制[5]。臨床研究在 HCC 患者外周血與對照組相比,MDSCs 的相對數(shù)量與平均數(shù)量在 HCC 患者組中均高于對照組,靶向 MDSC 能夠顯著提高索拉非尼及免疫檢查點抑制劑的抗腫瘤效應(yīng)[6]。MDSCs 同樣在肝癌發(fā)生發(fā)展中可能起著重要免疫抑制作用。學者們認為,在腫瘤微環(huán)境中,各種抑制性細胞或分子組成了一個復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),最終導(dǎo)致 T 細胞失能,腫瘤細胞不能得到殺傷或抑制,導(dǎo)致肝癌的發(fā)生及進展。

二、免疫檢查點在肝癌免疫逃逸中的作用及臨床價值

(一)CTLA-4 與肝癌免疫應(yīng)答 CTLA-4、CD152是表達在多種免疫細胞的細胞膜上的表面蛋白,可以通過多種機制抑制 T 細胞的活化。CTLA-4 與 CD28 具有高度同源性,因此它可以通過與 CD28 競爭 APC 表面 B7 分子的結(jié)合位點,從而來發(fā)揮抑制 T 細胞的功能。此外,CTLA-4 也在 Treg 細胞膜上表達,通過增強 Treg 活性與分化來抑制 T 細胞活化,肝癌衍生 Treg可以干擾樹突狀細胞(DC)的功能,并在體外以細胞接觸依賴的方式下調(diào)樹突狀細胞上的 CD80/CD86。此外 CTLA-4 還可以直接干擾樹突狀細胞從而促進腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制[7]。研究發(fā)現(xiàn),Fascin-1蛋白在DC細胞與APC細胞相結(jié)合形成免疫突觸時發(fā)揮重要作用,Fascin-1是一種機動蛋白成束蛋白,而 CTLA-4 能誘導(dǎo)APC中Fascin-1依賴肌動蛋白移動至 Treg 結(jié)合區(qū)從而隔離Fascin-1 蛋白,使DC 細胞沉寂,但是具體的調(diào)節(jié)機制還尚不清楚。CTLA-4 在肝癌的發(fā)生發(fā)展也具有重要作用。有報道研究了 80 例 HCC 患者與 78 例正常對照者,采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法進行 CTLA-4 rs231775 多態(tài)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn) CTLA-4 基因型分布符合Hardy-Weinbery平衡,另外更為重要的是,研究組與對照組相比,HCC 組的 CTLA-4 的表達率明顯高于對照組,關(guān)聯(lián)分析同樣表明基因型 AA 攜帶者 CTLA-4 水平最高(P<0.01)[8]。單克隆抗體Tremelimumab (CP-675206)可以針對人類細胞毒性 T 淋巴細胞相關(guān)抗原 4(CTLA-4 ),通過使用抗體 Tremelimumab可以阻斷 CTLA-4 抑制性共刺激受體的信號通路,從而阻止 T 細胞失能,避免誘發(fā)腫瘤免疫逃逸,目前在臨床應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的治療中取得較好的效果。對于治療肝細胞癌這樣的實體腫瘤,在臨床研究中證實了利用 Tremelimumab 治療的 HCC 患者較對照組的患者明顯激活了 T 細胞的活性,發(fā)揮抗肝癌的效應(yīng)[9]。CTLA-4 阻斷劑的療效與腫瘤的大小以及其免疫原性有重要的關(guān)系[9]。在一項臨床研究中,David等對 39 例成年肝細胞癌患者連續(xù)實施 3 個月 Tremelimumab治療,并按照Recist標準(1.1)對患者進行療效評價,研究結(jié)果提示。通過計算,Tremelimumab 臨床試驗的反應(yīng)率達到了 54.3%[9]。另一方面,該藥物主要副作用為腎損害，包括急性(肉芽腫)腎小管間質(zhì)性腎炎和免疫復(fù)合物腎小球腎炎,在給予全身性皮質(zhì)類固醇治療后腎功能可以恢復(fù)正常[10]。

(二)PD-1 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用 程序性細胞死亡-1(PD-1)是 CD28 超家族的成員,并由 pdcd1基因編碼，其與兩個配體 PD-L1 或 PD-L2 相互作用時可以傳遞抑制性信號。作為一種抑制性受體，它通常表達在 CTL 細胞膜上,可被T 細胞相關(guān)性抗原和相關(guān)細胞因子誘導(dǎo)。最初 PD-1 是在凋亡細胞被發(fā)現(xiàn),但隨后發(fā)現(xiàn)，PD-1 可在效應(yīng) T 細胞上表達,甚至可在胸腺中的雙陰性(CD4-、CD8-)T 細胞、自然殺傷 T 細胞(NKT)以及未成熟的朗格漢斯細胞中低表達。而 PD-1 的表達可受到 NFATc1 的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn),PD-1 基因調(diào)節(jié)可以通過將 NFATc1 募集至 pdcd1 基因座上的調(diào)節(jié)元件而發(fā)生。在腫瘤進展過程中,腫瘤細胞可以增加PD-L1 的表達從而導(dǎo)致 T 細胞失能,最終實現(xiàn)腫瘤免疫逃逸。在 PD-1 細胞膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域中具有兩個酪氨酸殘基,其余近膜端由免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)組成,而另一部分主要由基于免疫受體酪氨酸開關(guān)基序(ITSM)構(gòu)成。當 PD-1 與其受體結(jié)合后,其下游酪氨酸殘基被磷酸化,并招募蛋白酪氨酸磷酸(PTPs),如SHP2,從而使下游各通路關(guān)鍵的激酶去磷酸化,比如 SHP2 可以抑制ZAP70、P13K-AKT 和RAS-ERK等，從而對抗由 TCR-CD28 誘導(dǎo)的活化信號,最終引起效應(yīng)T 細胞失能。

根據(jù) PD-1 的抑制作用,在肝癌治療中它可以作為治療的重要靶點。研究發(fā)現(xiàn)肝細胞癌患者中,82%的 HCC 患者表達 PD-L1,對抗PD-1 治療的反應(yīng)率約為 19%,并且包括約 5%的完全緩解以及一些患者的持久獲益[11]。將抗 PD-1 和 PD-L1 藥物與索拉非尼聯(lián)合治療進展期肝癌的臨床試驗現(xiàn)在正在進行中。雖然在各項臨床試驗中結(jié)果顯示了抗PD-1 與抗PD-L1 的有效性,但是總體的有效性約為20%,現(xiàn)在有超過 30 余項關(guān)于PD-1/PD-L1抑制劑與肝動脈插管栓塞化療(TACE)、放療和靶向藥物等聯(lián)合應(yīng)用的臨床應(yīng)用的臨床研究還在進行中[12],有望在治療上取得更好的療效。

(三)LAG-3 與肝癌免疫逃逸 淋巴細胞活化基因-3(LAG-3 )最初在活化的 T 細胞與NK細胞表面被發(fā)現(xiàn),是 Ig 超家族的一員,后逐漸在 CD4+T 細胞、CD8+T細胞、樹突狀細胞(DC)、Treg 及 NK 細胞上發(fā)現(xiàn) LAG-3 的表達[16]。在不同的 TIL 上檢測到 LAG-3的過度表達，并有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。作為一種免疫檢查點控制蛋白,主要功能是負調(diào)節(jié) T 細胞免疫。早期研究表明其抑制作用的配體,MHC-II被認為是通過其在胞外的氨基酸基與 LAG-3 結(jié)合[13]。此后的文獻報道LAG-3 能夠抑制CD4+T細胞與NK細胞的功能,但其并沒有與MHC-II 發(fā)生結(jié)合[14],這些證據(jù)說明LAG-3不是通過 MHC-II發(fā)揮抑制作用的。最近有研究報道單克隆抗體可以 阻斷肝纖維蛋白原(Fibrinogen-like protein，F(xiàn)GL-1)與LAG-3 的相互作用從而刺激腫瘤免疫[15],提示FGL-1是一種與MHC-II無關(guān)的LAG-3功能性配體,LAG-3 正是與FGL-1 相結(jié)合才發(fā)揮相應(yīng)的生物學效應(yīng)[14]。因此 LAG-3 抑制 T 細胞的功能主要是通過與腫瘤細胞上表達的FGL-1 相結(jié)合發(fā)揮抑制T 細胞功能的效應(yīng)。肝癌細胞中 FGL-1 的表達明顯增高,提示了 FGL-1 分子表達可能對肝癌發(fā)生發(fā)展有重要意義，Yarchaon等報道以 29 例肝癌切除術(shù)后患者為研究對象,對分別浸潤在肝癌組織與正常中CD8+T細胞以及PD-1(+),T細胞和 LAG-3(+)T 細胞以及 PD-1(+)T 細胞進行免疫組化染色,結(jié)果顯示 29 例患者中有 19 例(65%)發(fā)現(xiàn) LAG-3 有陽性表達,腫瘤組織中的 LAG-3 表達顯著高于正常肝組織[16]。提示 LAG-3 在肝癌的發(fā)生及發(fā)展可能存在重要作用。動物實驗研究中證實抗 LAG-3 抗體不僅能促進效應(yīng) T 細胞的活性,而且能抑制 Treg 誘導(dǎo)的 TME抑制功能[17]。目前關(guān)于抗 LAG-3 的臨床試驗正在進行中?？?PD-1 治療無效的黑色素瘤患者在接受抗 PD-1 及 LAG-3 聯(lián)合治療后,表現(xiàn)了較好的臨床療效[18]。使用抗 LAG-3 治療肝癌,可能會有一定治療效果。

(四)TIM-3 與肝癌免疫及肝癌治療 T 細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)可表達在 CTL、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞以及NK細胞上。在免疫反應(yīng)中,TIM-3在 Th1 細胞表面作為起抑制作用的分子。TIM-3在黑色素瘤、非小細胞肺癌、腎透明細胞癌、膀胱上皮細胞癌等多種腫瘤中都有表達。除了上述惡性腫瘤以外,TIM-3對于肝癌的發(fā)生發(fā)展可能具有重要作用。Li Z等研究171 例乙型肝炎(HBV)相關(guān)性 HCC 與 34 例 HBV 相關(guān)性肝硬化,通過免疫組化檢測肝組織中PD-1 與 TIM-3的表達,結(jié)果顯示 TIM-3在腫瘤組織中的免疫組化評分(5.06 ± 1.11 )顯著高于癌旁組織(3.07± 1.25，P<0.01),及肝硬化組織(1.35±1.18，P<0.01)。此外TIM-3表達還與肝細胞癌的臨床分級有顯著關(guān)系,在 HBV 相關(guān)性 HCC 患者中,Ⅲ+Ⅳ級的 HBV 相關(guān) HCC免疫組化染色評分(5.97±0.63)顯著高于Ⅰ+Ⅱ級 HBV相關(guān)性 HCC患者的免疫組化評分(4.88± 1.18,P<0.01)[19],這些結(jié)果提示,TIM-3 對于肝癌發(fā)生發(fā)展過程中也有重要作用。此外,患者預(yù)后與 TIM-3表達程度的顯著相關(guān),肝癌細胞高表達TIM-3時,往往提示較差的預(yù)后[20]。其可能機制為腫瘤細胞固有的TIM-3能夠激活靶細胞 IL-6 的自分泌,然后通過 STAT3 信號通路促進腫瘤生長,從而促進肝癌的進展。研究人員通過在 SMMC-7721 細胞系中引入慢病毒表達顆粒,發(fā)現(xiàn) TIM-3過表達促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換,從而促進肝癌細胞遷移和侵襲[21]。除此之外,抗TIM-3單克隆抗體對小鼠結(jié)腸癌和纖維肉瘤模型也有較好的治療作用。此外,Dardalhon的研究顯示了 TIM-3 5D12 在抗 EL4 淋巴瘤治療中也有較好的療效[22]。研究還發(fā)現(xiàn)阻斷TIM-3可以顯著增強TIL的增殖以及IFN -γ的分泌,提高殺傷腫瘤效應(yīng)[23]。在聯(lián)合抗PD-1與 TIM-3 的臨床試驗中,其效果優(yōu)于單獨抗 PD-1或 TIM-3[24]。由于制備 TIM-3抗體價格昂貴,學者們重點研究TIM-3的適體,它可以結(jié)合在特定分子結(jié)構(gòu)的單鏈分子 或者是肽鏈分子上,目前已經(jīng)獲得了具有高親和力和特異性的TIM-3 核酸酶抗性適體[25]。最新的進展發(fā)現(xiàn)其三聚體適體阻斷TIM-3和Gal-9的相互作用,從而有效阻斷下游信號對腫瘤免疫逃逸的生物學效應(yīng)。這可能也是腫瘤免疫治療未來的研究方向之一。

三、展望

綜上所述,由于腫瘤微環(huán)境免疫調(diào)控十分復(fù)雜,需要進一步深入研究肝癌發(fā)生發(fā)展過程中免疫細胞如何有效識別肝癌腫瘤抗原,如何解除肝癌免疫逃逸,增強 T 細胞功能,從而開發(fā)出新型免疫治療的靶向治療藥物,進一步提高肝癌的治療效果。另一方面，免疫檢查點是免疫微環(huán)境中重要的效應(yīng)分子,在腫瘤微環(huán)境免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,可能直接參與肝癌的發(fā)生發(fā)展,并且可能與肝癌轉(zhuǎn)移過程緊密相關(guān)。臨床試驗也初步表明免疫檢查點抑制劑在肝癌治療中具有一定效果。特別是 PD -1，但其有效率只達到 20%,因此現(xiàn)仍亟須揭示有關(guān) PD-1 甚至其他的免疫檢查點更深層的機制,從而開發(fā)出了針對肝癌的新的免疫治療藥物,進一步提高肝癌的臨床治療效果。另外將抗 PD-1 抗體聯(lián)合傳統(tǒng)治療(如化療，TACE、靶向治療),或者與針對其他免疫檢查點抗體相聯(lián)合應(yīng)用,可能將顯著提高肝癌患者的治療效果及生存率，值得深入研究。