許梓萌 李德瑤 席婧媛 魯鳳民

乙型肝炎病毒(HBV)屬嗜肝DNA病毒，由其引起的慢性HBV感染是慢性乙型肝炎(CHB)的重要病因。據(jù)統(tǒng)計2015年全球仍有約2.57億慢性HBV 感染者，每年約88.7萬人死于慢性HBV感染所致的肝硬化、肝功能衰竭和肝細(xì)胞癌(HCC)[1]。CHB的臨床治愈面臨巨大挑戰(zhàn)。CHB難以治愈與其獨(dú)特的病毒復(fù)制過程及感染肝細(xì)胞廣泛存在HBV基因組DNA片段整合有關(guān)[2-3]。HBV基因組有兩種不同形式，其一為長約3.2 kb的松弛環(huán)狀不完全雙鏈DNA(rcDNA)，主要存在于具有感染性的、帶有包膜的完整病毒顆粒(Dane顆粒)和裸核衣殼內(nèi)；其二為以游離的微小染色體形式存在于感染肝細(xì)胞核內(nèi)的共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。除此之外，HBV DNA還以亞基因組片段廣泛整合到肝細(xì)胞染色體DNA上。這種整合與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，但其對HBV復(fù)制的生物學(xué)意義尚不清楚。近期的研究顯示，對于長期接受核苷(酸)類藥物(NAs)抗病毒治療的CHB患者及HBeAg陰性患者，整合HBV DNA片段可能是其血清HBsAg的主要來源[4]。以微小染色體形式存在于感染肝細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA是產(chǎn)生和維持病毒慢性感染主要原因[5]。由于NAs 僅通過抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄和子代病毒DNA產(chǎn)生，其對cccDNA并無直接作用，在血清HBV DNA檢測不到的情況下，NAs治療的患者肝組織內(nèi)cccDNA可能仍在轉(zhuǎn)錄和表達(dá)病毒蛋白，并導(dǎo)致停藥后復(fù)發(fā)[6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，作為病毒共轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，HBx在cccDNA的轉(zhuǎn)錄激活和維持以及HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7-8]。因此，以靶向HBx蛋白的CHB治療成為新的研究熱點(diǎn)[9-10]。本文主要介紹HBx在HBV復(fù)制中的作用，并簡述靶向HBx藥物的研究進(jìn)展。

一、HBx的結(jié)構(gòu)及來源

已知的嗜肝DNA病毒屬由人HBV，鴨乙型肝炎病毒(DHBV)、土撥鼠肝炎病毒(WHV)等組成。上述病毒的基因組構(gòu)成在不同種屬間高度保守，DHBV缺乏表達(dá)HBx的開放閱讀框架，也不表達(dá)HBx蛋白。人HBx蛋白含154個氨基酸，由具有負(fù)調(diào)控作用的氨基末端結(jié)構(gòu)域和反式激活或共激活作用的羧基末端結(jié)構(gòu)域組成，存在于感染肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中[11]。由于既往對HBV病毒學(xué)特征的了解多來自于DHBV模型，因此在很長一段時間內(nèi)，人們對HBx的功能知之甚少。直到2009年Belloni等[12]發(fā)現(xiàn)HBx可結(jié)合并調(diào)節(jié)cccDNA微染色體的表觀遺傳修飾，進(jìn)而調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄，人們才重新開始關(guān)注HBx蛋白。2011年，Lucifora等[7]對人HBV感染早期事件的細(xì)致分析揭示，盡管帶有HBx表達(dá)缺失突變的rcDNA能入核并形成cccDNA，但該cccDNA往往缺乏轉(zhuǎn)錄活性，不能建立有效感染。該研究還證實，對于已建立感染的cccDNA，其轉(zhuǎn)錄活性的維持仍然需要HBx蛋白存在。除此之外，HBx還可激活肝細(xì)胞內(nèi)的多種信號通路，分別對HBV復(fù)制產(chǎn)生不同影響[13-14]。以上研究充分說明HBx蛋白在HBV有效感染建立和感染病毒持續(xù)復(fù)制的維持中都發(fā)揮重要作用。

傳統(tǒng)認(rèn)為，HBx蛋白由0.7 kb的X轉(zhuǎn)錄本翻譯而來。但后期的研究發(fā)現(xiàn)，除了經(jīng)典的5種HBV RNA外，在感染肝細(xì)胞內(nèi)還存在3.9 kb的超長轉(zhuǎn)錄本，我們實驗室近期的一項對HBV 轉(zhuǎn)錄本的長測序結(jié)果也證實了這一點(diǎn)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，在HBV感染早期，0.7 kb HBx mRNA雖然存在，但隨著感染的建立很快消失，而3.9 kb mRNA在感染過程中持續(xù)存在[16]。我們近期的體外轉(zhuǎn)錄組學(xué)全長測序證實，3.9 kb 轉(zhuǎn)錄本在豐度上遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于0.7 kb HBx mRNA[15]。由于3.9 kb mRNA上存在完整的HBx編碼讀框，人們推測該3.9 kb的超長轉(zhuǎn)錄本可能翻譯HBx。通過轉(zhuǎn)染3.9 kb mRNA表達(dá)質(zhì)粒檢測HBx的表達(dá)，Gilad Doitsh等[16]發(fā)現(xiàn)3.9 kb mRNA的確能夠表達(dá)HBx，但其自身出核相對較慢。

二、HBx促進(jìn)和維持HBV cccDNA活躍轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制

HBV基因組較小，攜帶的遺傳信息有限，需通過與宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用以促進(jìn)其復(fù)制。HBx是HBV產(chǎn)生的主要調(diào)節(jié)蛋白，可與多種細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄相關(guān)酶相互作用，促進(jìn)cccDNA轉(zhuǎn)錄或解除宿主因子對cccDNA轉(zhuǎn)錄的抑制[17]。

(一)HBx調(diào)節(jié)cccDNA結(jié)合組蛋白的化學(xué)修飾 HBV cccDNA與組蛋白、非組蛋白結(jié)合形成微小染色體，以附加體(episome)的形式存在于細(xì)胞核中。并且與宿主細(xì)胞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，cccDNA也可以被宿主表觀遺傳相關(guān)蛋白修飾，其轉(zhuǎn)錄活性和宿主染色質(zhì)一樣受染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和修飾的影響。在感染肝細(xì)胞核內(nèi)，與HBV cccDNA啟動子結(jié)合的組蛋白H3被低乙?；图谆惾旧|(zhì)蛋白募集，從而使cccDNA轉(zhuǎn)錄被抑制。而HBx則可將CREB結(jié)合蛋白(CBP)、p300和p300/CBP相關(guān)因子等組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶募集到cccDNA上，促進(jìn)組蛋白乙酰化以維持cccDNA的活躍轉(zhuǎn)錄[12]。HBx還能夠?qū)①嚢彼崽禺愋匀ゼ谆?1(Lysine-specific demethylase-1，LSD1)和賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶Set1A招募到病毒啟動子上，兩者分別通過抑制H3K9me2去甲基化和積聚激活H3K4me3來激活病毒轉(zhuǎn)錄[18]。除此之外，HBx還能夠抑制SETDB1介導(dǎo)的H3K9me3修飾和異染色質(zhì)蛋白HP1在染色質(zhì)上的蓄積，從而消除H3K9me3和HP1導(dǎo)致的cccDNA轉(zhuǎn)錄沉默，使致密超螺旋的非活性染色質(zhì)轉(zhuǎn)換為活性狀態(tài)[19]。

(二)HBx促進(jìn)SMC5/6的降解 真核細(xì)胞內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)維持復(fù)合物5/6(SMC5/6)對鏈狀DNA具有親和力，并以ATP依賴方式的使其固縮，降低DNA的轉(zhuǎn)錄活性。由于cccDNA與宿主雙鏈DNA結(jié)構(gòu)相似，SMC5/6作為宿主限制因子也能夠抑制cccDNA的轉(zhuǎn)錄[20-21]。HBx蛋白通過與宿主DNA損傷結(jié)合蛋白1(Damage specific DNA binding protein 1，DDB1)，并通過后者招募SMC5/6并使之泛素化降解，從而解除SMC5/6對cccDNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用[22-23]。

(三)HBx與 YY1等的空間互作介導(dǎo)cccDNA轉(zhuǎn)錄激活 細(xì)胞核作為一個空間，同一染色體內(nèi)和不同染色體間的遠(yuǎn)距離相互作用已被證明能使廣泛分離的功能性DNA元件在空間上緊密接近，并在這些元件之間產(chǎn)生相互作用。染色體元件之間的相互作用往往需要一種或多種細(xì)胞蛋白質(zhì)參與，如轉(zhuǎn)錄因子CTCF、黏連蛋白和陰陽1(YY1)。YY1是一種細(xì)胞內(nèi)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，通過其鋅指基序識別特定的DNA序列并與之結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡中起作用。人染色體19p13.11區(qū)域包含一個強(qiáng)活性的增強(qiáng)子元件(http://genome.ucsc.edu)，我們近期的一項研究發(fā)現(xiàn)，YY1蛋白介導(dǎo)了19p13.11增強(qiáng)子與HBV cccDNA之間的空間相互作用，并在病毒蛋白HBx的協(xié)調(diào)作用下使cccDNA轉(zhuǎn)錄激活[24]。這與我國張鵬遠(yuǎn)等[25]有關(guān)HBV cccDNA與宿主染色體上的高活性轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的報道相契合。近期，來自李文輝實驗室的另外一項研究對HBx缺失的cccDNA肝細(xì)胞核染色質(zhì)定位，也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄靜默的cccDNA在空間上存在于19號染色體上與19p13.11增強(qiáng)子區(qū)域相毗鄰的轉(zhuǎn)錄靜默區(qū)域[26]。總而言之，這些研究為cccDNA微染色體通過與細(xì)胞染色體的空間相互作用調(diào)控其自身轉(zhuǎn)錄和HBV復(fù)制提供了實驗證據(jù)。

三、整合來源的HBx截短體及其在HBV相關(guān)疾病中的作用

關(guān)于HBV整合的研究發(fā)現(xiàn)，除cccDNA外，整合的HBV基因組也可能表達(dá)羧基端截短的、融合未知氨基酸序列的HBx蛋白[27]。整合的HBV基因組通常具有HBx啟動子(XP)，能夠起始HBx mRNA的轉(zhuǎn)錄，但不具有polyA信號位點(diǎn)，因此轉(zhuǎn)錄本可以越過HBV-宿主基因連接部分，借由宿主基因上的polyA信號終止。融合轉(zhuǎn)錄本上的融合HBx ORF終止密碼子往往并非HBx本身的終止密碼子，而是宿主序列上的終止密碼子[28]。HBx的羧基端區(qū)域?qū)τ贖Bx蛋白的線粒體定位不可或缺，該結(jié)構(gòu)域參與了多種細(xì)胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，因此，羧基端截短的HBx蛋白調(diào)控細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)錄活性的能力可能有所改變[28-29]。有研究發(fā)現(xiàn)與全長HBx相比，羧基端截短的HBx在HBV相關(guān)的HCC中表達(dá)更高，提示截短的HBx在HCC發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮更重要的作用[30]。HBx截短蛋白與p53結(jié)合并阻斷p53介導(dǎo)凋亡[31]。從肝癌細(xì)胞中分離出的HBx變體仍有維持cccDNA活躍轉(zhuǎn)錄的功能[32]，整合的HBV DNA表達(dá)羧基端缺失的HBx是否保有維持cccDNA轉(zhuǎn)錄的能力還有待進(jìn)一步研究[27]。已有研究發(fā)現(xiàn)，保留完整DDB1結(jié)合域(aa88-100)的HBx截斷蛋白仍有可能結(jié)合DDB1并保護(hù)其自身免受蛋白酶體介導(dǎo)的降解[33-34]。HBx通過結(jié)合DDB1使SMC5/6被泛素化降解從而解除其對cccDNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用[23]，來自整合表達(dá)的羧基端截短的HBx蛋白可能也參與了慢性HBV感染長期過程中cccDNA轉(zhuǎn)錄活性的維持和病毒復(fù)制。

四、靶向HBx的慢性乙肝抗病毒治療研究進(jìn)展

聚乙二醇干擾素-α或正在開發(fā)的小干擾RNA(siRNA)可以通過清除包括HBx轉(zhuǎn)錄本在內(nèi)的HBV mRNA促進(jìn)SMC5/6重新出現(xiàn)，進(jìn)而使cccDNA轉(zhuǎn)錄沉默[23]。干擾素誘導(dǎo)基因TRIM5γ可以促進(jìn)K48連接的HBx蛋白K95泛素位點(diǎn)的泛素化降解，進(jìn)而抑制HBV復(fù)制[35]。噻唑胺類抗感染藥物硝唑胺(NTZ)可有效抑制HBx-DDB1蛋白相互作用，顯著恢復(fù)SMC5蛋白水平，并抑制HBV轉(zhuǎn)錄和病毒蛋白的產(chǎn)生[36]。而RNA干擾可以整體降低由cccDNA產(chǎn)生的HBV RNA水平，進(jìn)而全面抑制病毒復(fù)制，但設(shè)計時還需考慮到整合來源的HBV RNA，使之作用更為全面[37-38]。

黃愛龍團(tuán)隊[9]報道了NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NQO1)的抑制劑雙香豆素可劑量依賴性地降低HBx蛋白的表達(dá)。內(nèi)源性NQO1能結(jié)合并保護(hù)HBx蛋白免受20S蛋白酶體介導(dǎo)的非泛素化途徑降解，當(dāng)敲減NQO1或使用雙香豆素治療可以顯著減少HBx向cccDNA募集，使轉(zhuǎn)錄抑制因子SMC5/6蛋白再次出現(xiàn)，從而抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄活性，阻斷HBV蛋白，HBx的致癌作用也被阻斷[9-10]。

直接抗病毒藥物(DAAs)帶來的丙型肝炎治愈為CHB治愈帶來了希望。但兩者維持慢性感染的機(jī)制截然不同，丙型肝炎病毒(HCV)主要通過持續(xù)的不間斷的復(fù)制來維持感染；對于HBV而言，由于其cccDNA相對較長的半衰期，再加上其有效的內(nèi)補(bǔ)充機(jī)制，僅憑借現(xiàn)有藥物很難有效地實現(xiàn)CHB治愈。清除或沉默肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA可能是未來更有效的策略。而HBx具有多種生物學(xué)功能，無論是在cccDNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以維持病毒的活躍復(fù)制、還是在HBV相關(guān)HCC的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮重要作用，因此以HBx為治療靶點(diǎn)的抗病毒策略可能是有前景的臨床治療策略。