梁秀萍 黎艷紅 周 雨 胡娣萍 劉 毅

間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)是一組具有共同的放射學(xué)、病理學(xué)和臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性肺實質(zhì)疾病[1]。而肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)以肺泡結(jié)構(gòu)進行性破壞、細胞外基質(zhì)大量沉積和肺瘢痕形成為特點，臨床表現(xiàn)為肺功能受損，肺泡氣體交換受阻，從而導(dǎo)致低氧血癥，呼吸困難，甚至呼吸衰竭及死亡，是許多ILD的共同結(jié)局[2]。多種因素可導(dǎo)致肺纖維化，如自身免疫性疾病、病毒感染、二氧化硅吸入、長期吸煙、輻射、化療、放療、基因改變等[3]。肺纖維化的高發(fā)生率和病死率已成為一個主要的公共問題[4]。

目前臨床上針對ILD的治療藥物以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及抗纖維化藥物即吡非尼酮和尼達尼布為主，但存在費用高、部分患者治療效果不佳等情況[1,3]。因此研究安全且性價比高的ILD治療新方法迫在眉睫。近年來干細胞治療方面的研究給肺纖維化等很多疾病的治療帶來了希望。研究發(fā)現(xiàn)，干細胞發(fā)揮治療作用的途徑除了細胞直接接觸，更重要的是其旁分泌途徑[5]。干細胞能分泌胞外囊泡 (extracellular vesicles，EVs)，特異性識別靶細胞和傳遞信號，繼而調(diào)控靶細胞的功能，達到與干細胞相應(yīng)的治療效果[6]。目前有多項臨床前研究表明干細胞來源EVs能有效緩解PF動物模型的病理結(jié)局[7, 8]。本文將從間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源EVs治療PF以及相關(guān)的作用機制進行綜述。

一、MSCs及MSC-EVs

MSCs是一種來自中胚層且廣泛存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)的非造血多能干細胞，具有自我更新和向中胚層組織分化的能力，如分化成軟骨細胞和成骨細胞，且具有抗炎、免疫抑制、抗凋亡、抗纖維化、促血管生成等功能，亦是目前細胞治療研究中最常用的一種細胞類型[5]?，F(xiàn)在MSCs作為一種自身免疫和炎性疾病的免疫抑制治療，已廣泛應(yīng)用于許多疾病的臨床試驗，包括移植物抗宿主病、系統(tǒng)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性腎臟疾病等[9]。同時有不少有關(guān)MSCs治療肺纖維化的臨床前研究和臨床試驗探索性研究，關(guān)于短期安全性和有效性的研究結(jié)果都提示干細胞治療的可行性[8, 10]。但是，目前間充質(zhì)干細胞存在移植后易死亡、移植率低、易堵塞、長期易成瘤等缺點，這讓很多醫(yī)生和患者望而生畏，在很大程度上限制了它的臨床應(yīng)用[11]。而EVs的發(fā)現(xiàn)能讓研究很好地規(guī)避這些缺點。

間充質(zhì)干細胞來源的胞外囊泡(MSC-EVs)根據(jù)其被干細胞泌出方式及大小不同，主要分為3種類型：①外泌體(exosomes，EXOs)：直徑30～150nm，通過干細胞內(nèi)多泡體與細胞膜融合分泌到細胞外環(huán)境而產(chǎn)生；②微囊泡/微粒(microvesicles，MVs)：直徑50～1000nm，通過質(zhì)膜向外出芽、分裂以及隨后向細胞外空間釋放小泡而產(chǎn)生；③凋亡小體：直徑1000～5000nm，是干細胞凋亡時釋放的異質(zhì)性囊泡[12]。MSC-EVs是一種天然、高效的運輸載體，可以保持與母體細胞相似的功能特征，具有促血管生成、抗凋亡、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)和一定的增殖再生功能[12,13]。而且作為一種膜結(jié)構(gòu)，MSC-EVs具有免疫原性低、半衰期長、體內(nèi)穩(wěn)定性好、傳遞效率高等優(yōu)點，是一種比干細胞治療更安全、更有效的新型非細胞生物治療方法[9]。

二、MSC-EVs治療肺纖維化的機制

肺纖維化的發(fā)病機制復(fù)雜，很多機制尚不明確。目前研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化的發(fā)生主要是因為外源性或內(nèi)源性因素引起內(nèi)皮細胞和(或)肺泡上皮反復(fù)損傷，激活凝血級聯(lián)反應(yīng)，釋放各種細胞因子和生長因子，募集免疫細胞并浸潤組織，最終激活成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞并分泌過多的膠原纖維，從而導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的大量沉積[14]。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，目前暫無關(guān)于MSC-EVs治療纖維化的臨床研究發(fā)表，但是有部分國內(nèi)外文獻報道了這方面的基礎(chǔ)研究。目前研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs在肺纖維化模型中具有保護肺泡上皮細胞，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制單核-吞噬細胞募集分化和炎性細胞因子釋放，抑制成纖維細胞增殖分化，減少膠原的生成等作用，繼而改善纖維化模型的纖維化程度，從而達到治療效果[7,8,15]。

1.保護肺泡上皮細胞，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化：越來越多的研究表明，肺泡上皮細胞在肺纖維化過程中起著重要作用，其異常的生理病理過程包括增殖、凋亡、細胞衰老及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)，都會引起或加重肺纖維化[16]。MSC-EVs在這方面的研究也最豐富。Yang等[15]將人臍帶間充質(zhì)干細胞來源外泌體(human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes，HUCMSC-EXOs)經(jīng)尾靜脈單次注射給博來霉素誘導(dǎo)的C57/6小鼠肺纖維化模型，第21天處死小鼠發(fā)現(xiàn)HUCMSC-EXOs可顯著降低肺纖維化小鼠的肺系數(shù)(肺濕重/體重×100%)，改善肺組織切片膠原沉積和肺組織病理變化，同時降低小鼠TGF-β1、p-smad2/3和波形蛋白(vimentin)的表達，增加E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達。而vimentin和E-cadherin正是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標志性蛋白。該研究還發(fā)現(xiàn)，與造模后第11天給予HUCMSC-EXOs比，第2天給藥治療效果更加明顯。進一步的體外研究中，他們將HUCMSC-EXOs與TGF-β1刺激的A549細胞(肺部上皮樣細胞)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)TGF-β1促進下游smad2/3蛋白磷酸化，使vimentin 下調(diào)，E-cadherin上調(diào)，而這一作用可被HUCMSC-EXOs反轉(zhuǎn)。該研究認為，HUCMSC-EXOs可以通過抑制TGF-β1/smad2/3信號通路激活的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而緩解小鼠肺纖維化程度，且早期給藥效果更加明顯。此外，Xiao等[17]將骨髓間充質(zhì)干細胞來源的EXOs(bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes，BMSC-EXOs)經(jīng)尾靜脈給予LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷模型和LPS刺激的小鼠肺上皮細胞MLE-1，發(fā)現(xiàn)BMSC-EXOs 可通過沉默Ikbkb和破壞IKKβ的穩(wěn)定性，抑制NF-κB和hedgehog通路，進而下調(diào)vimentin，上調(diào)E-cadherin，從而反轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的EMT過程。而Chen等[18]研究表明,人臍帶間充質(zhì)干細胞來源微粒(HUCMSC-MVs)傳遞的miR-100通過靶向mTOR增強自噬，抑制博來霉素誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型的肺細胞凋亡、炎性反應(yīng)和纖維化，同時在體外研究中減輕博來霉素誘導(dǎo)的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡和炎性反應(yīng)。以上研究表明MSC-EVs可通過調(diào)節(jié)多種信號通路調(diào)控肺泡上皮細胞，進而改善肺纖維化。

2.抑制單核-吞噬細胞細胞募集分化和炎性細胞因子釋放：肺組織中的巨噬細胞有兩種來源，一種為組織定居巨噬細胞，分布在肺泡和肺間質(zhì)中，另一種是在炎癥等刺激下的被募集到受損肺組織的骨髓來源單核細胞[19]。骨髓單核細胞遷移到組織內(nèi)后成為組織巨噬細胞，其處于休眠的狀態(tài)稱為M0，M0在不同炎性細胞因子刺激下分化為：①經(jīng)典活化巨噬細胞M1，可促炎殺菌，終止損傷修復(fù)過程，防止過度修復(fù)；②選擇性活化巨噬細胞M2，可抗炎和促進組織修復(fù)[20]。目前,大部分研究提示M1和M2可促進肺纖維化進程，但是個別研究出現(xiàn)相反的結(jié)果，所以M1和M2與肺纖維化的關(guān)系尚不確定[21]。近年來，在MSC-EVs治療心血管、消化、泌尿和中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病時關(guān)于巨噬細胞極化的研究中，均發(fā)現(xiàn)MSC-EVs通過抑制M1型細胞，提高M2型細胞的表達來達到治療作用[22]。在肺纖維化中，MSC-EVs如何使調(diào)節(jié)巨噬細胞極化，又能否通過調(diào)控巨噬細胞極化達到治療效果呢？Willis等[23]將新生小鼠暴露于高氧 (75%O2)，誘導(dǎo)支氣管肺發(fā)育不良模型，且在出生后第4天使用HUCMSC-EXOs治療，在出生后第7天返回室內(nèi)空氣。分別在出生后第7、14、42天處理動物進行分析。研究發(fā)現(xiàn)，高氧暴露的小鼠表現(xiàn)出明顯的肺泡簡化、纖維化和肺血管重構(gòu)，而這些表現(xiàn)在HUCMSC-EXOs治療后得到有效改善。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)外，HUCMSC-EXOs可調(diào)節(jié)巨噬細胞表型，抑制促炎M1狀態(tài)(CCL2、CCL7、IL-6)和增強抗炎M2狀態(tài)(arginase-1、CD206、CCL17)，進而得出HUCMSC-EXOs可通過調(diào)節(jié)肺巨噬細胞表型緩解高氧誘導(dǎo)的支氣管肺發(fā)育不良模型，改善肺功能，減少纖維化和肺血管重塑，以及改善肺動脈高壓的結(jié)論。同樣的，Mansouri等[8]研究發(fā)現(xiàn)，給博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠模型注射BMSC-EXOs可以減少經(jīng)典促炎單核細胞(CD45+CD11b+MHCⅡ-CD64lo/intCCR2+Ly6chi)的數(shù)量，增加非經(jīng)典單核細胞(CD45+CD11b+MHCⅡ-CD64lo/intCCR2-Ly6clo)和肺泡巨噬細胞(CD45+CD11b-CD11c+CD64+)的水平從而減少肺泡變形，降低膠原水平，以及改善Ashcroft評分。然而這種巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)和肺纖維化的緩解是否同樣能在其他肺纖維化模型中達到，還有待于進一步研究。

3.制成纖維細胞增殖分化，減少膠原的生成：肺成纖維細胞在TGF-β等促纖維化因子的刺激下活化并分化為肌成纖維細胞，分泌大量膠原并沉積在肺組織，直接導(dǎo)致了肺纖維化，是肺纖維化的最終階段[24]。目前，Shentu等[25]將MSC-EVs分別作用于TGF-β1刺激的正常肺成纖維細胞和特發(fā)性肺纖維化患者的肺成纖維細胞。研究發(fā)現(xiàn)，與未使用MSC-EVs的對照組比較，MSC-EVs組的α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N) 、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達均顯著下調(diào)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs中的miR-630可以阻斷正常肺成纖維細胞和IPF成纖維細胞中TGF-β1對N-鈣黏蛋白2(N-cadherin，CDH2)的誘導(dǎo)。Wan等[7]在特發(fā)性肺纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs可通過miR-29b-3p下調(diào)肺成纖維細胞中卷曲蛋白6(frizzled 6，F(xiàn)ZD6)的表達，從而抑制肺成纖維細胞的增殖、遷移、侵襲和分化，同時降低α-SMA和Ⅰ型膠原的表達。同時，在皮膚纖維化的研究中，Hu等[26]通過體外研究發(fā)現(xiàn)，HUMSC-EXOs能夠通過抑制成纖維細胞的經(jīng)典信號通路以及TGF-β1/smad 2/3信號通路來抑制真皮成纖維細胞-肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，這為肺纖維化的研究提供了思路。

三、microRNAs的作用

MSC-EVs通過攜帶的多種物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸(包括microRNAs，mRNA和DNA等)等來實現(xiàn)其生物效應(yīng)[12]。其中，microRNAs是一類系統(tǒng)發(fā)育上保守的非編碼RNA，其長度為19～22個堿基的單鏈核糖核酸，參與細胞增殖、分化、凋亡等[27]。MSC-EVs可以使靶細胞通過內(nèi)吞或融合將microRNAs和其他生物活性分子轉(zhuǎn)移到靶細胞，從而與鄰近或遠處的細胞通信。MSC-EVs能通過轉(zhuǎn)移不同或相同的microRNAs治療疾病，這在腎臟、肝臟、心臟、腦等疾病的研究中均已被證明[28]。在肺纖維化的研究中也發(fā)現(xiàn)EVs中microRNAs的作用。 Xiao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC-EXOs通過miR-23a-3p和miR-182-5p協(xié)作來調(diào)控NF-κB和hedgehog通路，進而反轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的EMT過程，緩解肺纖維化的發(fā)展。同樣的，Chen等[18]研究表明，HUCMSC-MVs是通過傳遞miR-100部分改善ALI模型大鼠的肺細胞凋亡、炎性反應(yīng)和纖維化。Shentu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs通過傳遞miR-630來阻止成纖維細胞向肌纖維細胞的分化。Sun等[29]將經(jīng)血中子宮內(nèi)膜干細胞來源的EXOs分別作用于博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型和TGF-β1處理的肺泡上皮細胞MLE-12細胞，發(fā)現(xiàn)EXOs通過將miRNA-Let-7轉(zhuǎn)運到肺泡上皮細胞中，進而下調(diào)ROS的水平和LOX1的表達、改善線粒體DNA的損傷以及抑制炎癥體NLRP3的激活，從而緩解肺纖維化。

四、展 望

MSC-EVs具有促血管生成、抗凋亡、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)和一定的增殖再生功能，可以通過轉(zhuǎn)移microRNA保護肺泡上皮細胞從而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制單核-吞噬細胞募集分化和炎性細胞因子釋放，以及抑制成纖維細胞增殖分化，減少膠原的生成等，改善各種肺疾病模型的纖維化程度，具有很好的應(yīng)用前景。然而還有問題需要進一步解決，MSC-EVs制備和保存等技術(shù)并不成熟，這在很大程度上限制了MSC-EVs的應(yīng)用。同時，MSC-EVs的給藥方式、頻次、劑量等在各研究中均有不同，還需要大量的臨床前研究和大規(guī)模的臨床研究來統(tǒng)一確定。MSC-EVs在肺纖維化中的作用機制仍處于探索階段，尤其是MSC-EVs可能會促進M2型巨噬細胞極化，這是否會促進肺纖維化的進展，需要筆者更加深入的研究。筆者研究距使用MSC-EVs進行安全、有效、規(guī)范的肺纖維化治療還有很大一段的距離，需要開展進一步的研究予以證實。