肖云飛，白云金，王佳豪，尹 山，王 佳

(四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科，泌尿外科研究所，四川成都 610041)

膀胱癌(bladder cancer，BC)是泌尿生殖系最常見的惡性腫瘤之一，70%～80%的膀胱癌局限于黏膜(Ta)或黏膜下層(T1)，即非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscular invasive bladder cancer,NMIBC)，一般通過尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)可完全切除，但由于其有很高的復(fù)發(fā)和進展風(fēng)險，常需要輔助膀胱內(nèi)化療和或卡介苗治療[1]?，F(xiàn)卡介苗(bacille calmette-guerin，BCG)灌注治療依舊是NMIBC患者治療的金標(biāo)準，近5～10年，BCG用于NMIBC的治療進行了大量研究并取得了進展，本文就關(guān)于NMIBC的BCG免疫治療做一綜述。

1 BCG及其機制

BCG是牛分枝桿菌的減毒活菌株，研發(fā)后主要被作為結(jié)核病疫苗而大量應(yīng)用。后期研究發(fā)現(xiàn)BCG可降低TURBT后復(fù)發(fā)和NMIBC進展的風(fēng)險。1990年，美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準BCG膀胱內(nèi)注射可用于中高危NMIBC患者，迄今為止一直被用于臨床。雖然BCG治療NMIBC的機制還不完全清楚，但目前認為很大程度上與細胞免疫機制有關(guān)[2]，主要包括CD4+T細胞刺激和誘導(dǎo)輔助性T細胞(Th)1型免疫反應(yīng)。

BCG抗原直接作用于尿路上皮細胞表面后，尿路上皮細胞通過使MHC Ⅰ類表達增加，將抗原呈遞給BCG特異性的CD4+T細胞，激活局部免疫系統(tǒng)，釋放促炎性細胞因子。其通過誘導(dǎo)已激活的巨噬細胞、CD8+T細胞、自然殺傷細胞和其他效應(yīng)細胞在膀胱壁聚集，增強機體對腫瘤細胞的識別，從而產(chǎn)生了一種以Th1介導(dǎo)為主的細胞誘導(dǎo)免疫，通過各種免疫機制對膀胱腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性，增強抗腫瘤作用。其中包括先天性免疫和獲得性免疫，但哪種免疫起主導(dǎo)作用目前仍存在爭議[3]。一項研究發(fā)現(xiàn)，無論是在膀胱腫瘤內(nèi)還是與正常膀胱壁交界處，CD4+T和CD8+T細胞的數(shù)量都相對較少；而在BCG灌注治療后，該處的CD4+T和CD8+T細胞浸潤數(shù)量明顯增加，抗腫瘤反應(yīng)增強[4]。這也證實了細胞免疫在BCG治療NMIBC中扮演著十分關(guān)鍵的作用。近幾年來已確定了幾種細胞因子參與了這一應(yīng)答，包括白細胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、腫瘤壞死因子-α、干擾素和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor，GM-CSF)。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)BCG對尿路上皮腫瘤細胞還具有重要的抗增殖作用[5]。

2 BCG治療的療效及其影響因素

2.1 BCG治療NMIBC的療效2020年3月，歐洲泌尿外科學(xué)會(European Association of Urology,EAU)發(fā)布的NMIBC診療指南指出，在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)與進展方面，TURBT后BCG治療效果明顯優(yōu)于單純TURBT或TURBT加膀胱內(nèi)化療，同年美國泌尿外科協(xié)會(American Urological Association AUA)與泌尿外科腫瘤協(xié)會(Society of Urologic Oncology，SUO)發(fā)表的NMIBC診療指南也贊同該觀點[6]。許多研究證實，NMIBC患者經(jīng)BCG灌注治療后，復(fù)發(fā)和進展的長期風(fēng)險會明顯降低，然而是否影響癌癥特異性死亡率(cancer-specific mortality,CSM)，現(xiàn)目前仍無定論[7]。其中，在預(yù)防有高復(fù)發(fā)風(fēng)險的NMIBC患者復(fù)發(fā)上，維持至少1年的BCG治療比化療更有效。

2.2 影響B(tài)CG療效的因素用BCG免疫治療NMIBC患者時，其療效受到多種因素的影響。雖然之前認為不同BCG菌株的有效性和毒性沒有差異。但現(xiàn)臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，BCG不同菌株的潛在療效具有差異性，而這種療效差異性在BCG供應(yīng)短缺時BCG的臨床使用選擇上具有很大的潛在價值和指導(dǎo)意義。

2.2.1不同BCG菌株對療效的影響 一項納入142例高危NMIBC患者的前瞻性隨機研究比較了兩種使用最廣泛的BCG菌株：Connaught(加拿大)和Tice(美國)，對比了二者在腫瘤復(fù)發(fā)、進展、癌癥特異性存活率和總體存活率(overall survival，OS)方面的差異。在BCG維持治療時，Tice菌株的復(fù)發(fā)率更低；而無維持治療時，結(jié)果恰恰相反，Connaught菌株的復(fù)發(fā)率更低。但是， D’ANDREA等[8]的實驗表明BCG-Tice和BCG-Moreau(巴西)菌株治療NMIBC時，無復(fù)發(fā)生存率(relapse-free survival,RFS)和無進展生存期(progression-free survival,PFS)沒有差異。另外，不同的BCG菌株對于不同的膀胱腫瘤細胞的療效也有所差異。研究發(fā)現(xiàn)，對于膀胱癌T24/J82細胞，相比于其他BCG菌株而言,Russian(俄羅斯)和Connaught BCG在細胞增殖抑制和細胞因子應(yīng)答方面更有效[9]。但目前沒有一項研究可明確何種菌株最優(yōu)，因為這些實驗研究大多僅使用了誘導(dǎo)治療或研究樣本太小缺乏數(shù)據(jù)證實；此外，這些研究均未采用統(tǒng)一研究標(biāo)準，故沒有絕對的說服力，需后期高質(zhì)量研究證實這一問題。

2.2.2BCG劑量對療效的影響 大量研究表明，對于中、高危NMIBC患者，小劑量BCG和全劑量BCG治療具有相似的腫瘤結(jié)局[10]，其中中危NMIBC患者接受1年全劑量BCG治療，高危患者接受3年全劑量治療會更有效[11]；雖然小劑量BCG毒性最小，且OS略高于全劑量BCG治療組，但需要再次TURBT手術(shù)的可能性較高，這對使用低劑量BCG治療的優(yōu)勢提出了質(zhì)疑[12-13]。隨后有部分研究顯示小劑量BCG組的療效更低[14]?，F(xiàn)目前認為病情惡化和復(fù)發(fā)率是選擇BCG治療最佳劑量的決定性因素，因此關(guān)于劑量大小是否影響療效及BCG最佳劑量的選擇仍未有統(tǒng)一定論。

2.2.3膀胱微生物群對療效的影響 膀胱微生物群對于BCG治療效果也有一定的影響。其可通過抑制IL-6、IL-8和NF-κB等途徑來減輕黏膜炎癥，因此可能會對依賴于局部炎癥反應(yīng)啟動的BCG免疫療法造成影響。但目前由于研究的樣本較少，且使用的尿液中含有來自尿道末端的微生物污染，暫未得到普遍認可，因此需要進行更大規(guī)模的研究，以準確評估膀胱微生物組在膀胱癌進展和免疫治療藥物反應(yīng)中的重要潛在作用。

2.2.4皮下注射BCG對療效的影響 先前的實驗發(fā)現(xiàn)，NMIBC患者BCG皮下與膀胱內(nèi)同時注射后療效不明顯。然而之后的研究表明，在膀胱內(nèi)BCG灌注之前皮下注射BCG，可加速T細胞進入膀胱并改善膀胱組織對BCG的反應(yīng)，從而提高療效；也間接證明患者具有BCG特異性免疫力與RFS的增加有關(guān)[15]。但之后有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，這種治療方法對一些NMIBC患者的免疫功能有抑制作用，因此可見BCG對不同個體的免疫學(xué)反應(yīng)是不同的，具有可變的外顯性[16]，后期應(yīng)該深入研究，明確個體化治療的具體方案。

2.2.5其他因素對療效的影響 任何類型的免疫反應(yīng)強度都會隨著年齡的增長而下降，故在部分老年患者中BCG免疫刺激作用不足，其效果可能不佳，稱免疫衰老[17]。但研究發(fā)現(xiàn)，年齡增長與BCG免疫治療腫瘤的結(jié)果和預(yù)后無關(guān)，與BCG毒副作用也無關(guān)[18]。而膀胱癌患者可以從優(yōu)化的管理中獲益，可能是BCG免疫治療成功的關(guān)鍵：如改變從TURBT到BCG灌注的時間、調(diào)整膀胱內(nèi)灌注時使用的BCG劑量、BCG灌注間隔等，其中影響最大的可能是BCG灌注間隔。模擬實驗表明，采用兩倍于目前常規(guī)使用的7 d間隔時間，其治療結(jié)果將會得到顯著改善[19]。

另外，許多研究顯示，與單獨使用BCG相比，膀胱內(nèi)序貫BCG和絲裂霉素C(EMDA-MMC)灌注治療高危NMIBC可提高無病間隔時間，降低復(fù)發(fā)率和進展率，提高OS和無病生存率(disease-free sur-vival，DFS)。此外，免疫微環(huán)境中許多分子的表達水平也對BCG療效有顯著影響。NMIBC患者腫瘤程序性死亡配體1(programmed death-ligand 1,PD-L1)的表達能抑制抗腫瘤T細胞從而減弱BCG治療的免疫反應(yīng)。因此不難看出PD-L1表達水平越高，影響越大[20-21]。另外，研究發(fā)現(xiàn)在BCG作用下，2型固有淋巴細胞(type-2 innate lymphoid cell,ILC2)產(chǎn)生2型細胞因子IL-13，從而介導(dǎo)單核細胞的募集和免疫抑制功能，所以通過刺激ILC2/IL-13軸提高療效可能是增強BCG治療NMIBC吸引力的一大靶點。

3 BCG聯(lián)合免疫治療

盡管BCG現(xiàn)已被多個指南推薦為NMIBC患者的首選免疫治療方法，且可通過調(diào)控多種影響因素提高其療效，但BCG在治療過程中仍然出現(xiàn)了較多的不良反應(yīng)。隨著這些副作用的不斷發(fā)現(xiàn)，我們開始認識到在正確的時間有針對性地給予適宜的聯(lián)合免疫治療很重要。而這將需要采用合理的組合方法，從而提高機體抗腫瘤能力。

基于已知局部固有免疫刺激和全身特異性免疫刺激具有協(xié)同潛力，因此嘗試將局部免疫治療與T細胞疫苗組合是可能有益的。實驗證明，癌癥疫苗(包括強佐劑)可以與BCG膀胱灌注治療安全的結(jié)合，以增加膀胱T細胞和疫苗特異性T細胞，從而改善NMIBC患者預(yù)后。另一種聯(lián)合方法則是通過局部應(yīng)用選擇性趨化因子或Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)激動劑來增加誘導(dǎo)T細胞的能力。先前有研究表明，在用佐劑多肽疫苗免疫的小鼠中，在陰道內(nèi)或膀胱內(nèi)單次注射不同的免疫刺激劑(CpG寡核苷酸、聚肌苷酸、聚胞苷酸，或減毒細菌，如沙門氏菌或BCG)可增強局部疫苗特異性CD8+T細胞免疫反應(yīng)和腫瘤消退[22]。因此，在BCG中加入其他免疫刺激劑可以增加免疫反應(yīng)，從而提高抗腫瘤效能。GM-CSF是BCG在促炎途徑中的共刺激細胞因子，并且是刺激樹突狀細胞提呈抗原的有效因子。因此，NMIBC患者在接受以BCG為基礎(chǔ)的膀胱灌注聯(lián)合外源性GM-CSF時可增強促炎反應(yīng)，對免疫應(yīng)答和抗腫瘤能力也具有促進作用，從而提高抗腫瘤效果[23]。另外，色氨酸和胸腺嘧啶通過減少細胞增殖和激活TLRs，不僅可以抑制尿路上皮癌變還可增強BCG對于NMIBC患者的療效[24]。

雖然BCG能誘導(dǎo)T細胞募集到膀胱，但T細胞表型并沒有明顯改變。研究發(fā)現(xiàn)，在BCG治療后CD4+T細胞、CD8+T細胞或FoxP3+Treg的表達在應(yīng)答者和非應(yīng)答者之間無明顯差異[25]，證實了這一觀點。因此提示我們可以將T細胞激動劑與BCG聯(lián)合應(yīng)用，來增強T細胞活化并改變腫瘤組織內(nèi)T細胞表型，從而提高BCG在NMIBC治療的臨床療效。另有研究證明，4-1BB(CD137,TNFRSF9)是在T細胞上表達的一種共刺激分子，不僅可使淋巴細胞上抗凋亡分子的增殖增加，還可促進BCG與TLR激動劑結(jié)合，在NMIBC患者中提高抗腫瘤效果[26]。

目前有多種免疫治療與靶向藥物聯(lián)合應(yīng)用方案，研究較多的則是免疫檢查點抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，在BCG無應(yīng)答的NMIBC患者中，PD-L1+患者CD4+T細胞數(shù)量較少，相反PD-L1-患者CD4+T細胞數(shù)量較多，而CD8+T細胞在兩者中無明顯差異。因此PD-L1免疫檢查點抑制劑可能會改善NMIBC治療效果[27]。在VANDEVEER等[28]在研究中也證實了上述觀點，通過聯(lián)合PD-L1抑制劑Avelumab和BCG治療NMIBC小鼠發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)CD4+和CD8+細胞數(shù)量增加，治療效果顯著提高。另外，BCG治療過程中募集的Tregs細胞占較大比例，雖然高比例的Tregs細胞與BCG治療后的快速復(fù)發(fā)相關(guān)，但這對BCG與PD-1/PD-L1檢查點抑制劑的聯(lián)合使用療效具有一定的增強作用，對NMIBC患者來說也是一種較有潛力的治療方向[29-30]。最近發(fā)現(xiàn)一種IL-15超激動劑，具有強大激活NK細胞和T細胞的能力，表現(xiàn)出較強的抗腫瘤活性。IL-15激動劑ALT-803與BCG聯(lián)合治療后，抗腫瘤能力明顯增加，腫瘤負荷減少46%[單獨使用BCG為15%，單獨使用Altor BioScience Corporation-803(ALT-803)為15%],而這與誘導(dǎo)NK細胞增殖和活化的IL-1α、IL-1β和CCL5的生成和分泌增加有關(guān)。

4 預(yù)測BCG及聯(lián)合免疫治療療效與預(yù)后

BCG膀胱內(nèi)免疫治療已被廣泛應(yīng)用于NMIBC的治療，但治療后膀胱腫瘤復(fù)發(fā)率仍高達40%。因此，通過預(yù)測因子對有可能復(fù)發(fā)或進展的NMIBC患者進行預(yù)測，有助于臨床醫(yī)生制定治療策略和隨訪計劃。傳統(tǒng)的臨床因素已被臨床用于預(yù)測NMIBC患者的預(yù)后結(jié)果，例如腫瘤分期、分級、數(shù)量和組織病理學(xué)特征。之前普遍認為BCG療效的預(yù)測因子主要集中在腫瘤標(biāo)志物上，但現(xiàn)在廣大學(xué)者認為預(yù)測因子主要是NMIBC患者產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力，故免疫細胞種類或比例、細胞因子等對于預(yù)測BCG治療NMIBC患者預(yù)后是近些年的研究熱點。

一項前瞻性研究發(fā)現(xiàn)人趨化因子配體27(human chemokine ligand 27,CCL27)是預(yù)測BCG療效的首選生物標(biāo)記物，可促進Tregs向腫瘤微環(huán)境(tumor environment,TME)募集，并且血清CCL27水平升高與NMIBC TME中Tregs密度呈正相關(guān)，從而提高了BCG治療后的DFS[31]。另外，在膀胱、膀胱腫瘤及不同階段膀胱腫瘤中，E2F4基因表達(E2F轉(zhuǎn)錄家族成員，一種癌基因)評分有顯著差異。研究發(fā)現(xiàn)，E2F4評分可用于預(yù)測NMIBC的進展、復(fù)發(fā)和患者對BCG膀胱灌注治療的反應(yīng)性或敏感性[32]。

在一項對于T細胞反應(yīng)的功能測試中發(fā)現(xiàn)，50%復(fù)發(fā)患者經(jīng)結(jié)核菌素誘導(dǎo)后分泌的IL2低于120 pg/mL，而無復(fù)發(fā)患者均高于此值，表明體外結(jié)核菌素刺激分泌的IL2作為BCG免疫治療成功的預(yù)測因子來說具有很大的潛力[33]。另研究發(fā)現(xiàn)，T細胞與單核細胞樣-髓源抑制性細胞(monocytic-myeloid-derived suppressor cells,M-MDSCs)之比(已知可抑制抗腫瘤免疫)與無復(fù)發(fā)生存結(jié)局密切相關(guān)，對預(yù)后也有一定的潛在價值[27]。

單個細胞因子的變化與NMIBC復(fù)發(fā)有一定關(guān)系，但主流觀點認為多細胞因子組合是最佳預(yù)測方式。一項對于BCG治療后尿細胞因子變化的臨床實驗發(fā)現(xiàn)，根據(jù)尿中9種可誘導(dǎo)細胞因子(IL-2、IL-8、IL-6、IL-1ra、IL-10、IL-12[p70]、IL-12[p40]、TRAIL和TNF-α)含量構(gòu)建的列線圖(CyPRIT)可預(yù)測NMIBC復(fù)發(fā)的風(fēng)險，從而指導(dǎo)臨床BCG治療劑量和持續(xù)時間[34]。但該實驗涵蓋患者數(shù)量較少，具有一定的局限性，有待進一步外部驗證。另外，NMIBC患者經(jīng)BCG治療后，PD-L1表達水平顯著提高，故其可能在對于BCG無反應(yīng)患者的潛在選擇上具有重要作用，以便于早期識別NMIBC患者是否能從BCG治療中獲益。而現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)腫瘤周圍的免疫細胞肉芽腫中PD-L1高水平表達，且肉芽腫中PD-L1的累積可降低機體對BCG的免疫應(yīng)答[35]。因此PD-L1抗體和BCG聯(lián)合治療對于BCG無反應(yīng)患者來說可能是一種新的治療方向。

5 問題與展望

綜上所述，BCG膀胱灌注治療可有效降低NMIBC患者的復(fù)發(fā)率、進展率及死亡率，但由于其較為明顯的副作用、高昂的治療成本及療效受多種因素的影響等，一定程度上限制了BCG在臨床的應(yīng)用。隨著科技水平及科研技術(shù)的進步，BCG治療NMIBC機制的不斷探索，涌現(xiàn)出很多新的治療方式，例如BCG聯(lián)合免疫治療(免疫檢查點抑制劑、細胞因子、腫瘤疫苗等)及BCG序貫治療時間、用量和給藥途徑的改變等。通過利用預(yù)測因子對有可能復(fù)發(fā)或進展的NMIBC患者進行預(yù)測，從而有助于臨床醫(yī)生制定治療策略和隨訪計劃。盡管上述方法提供了NMIBC治療的新思路，且顯現(xiàn)較好的應(yīng)用前景，但還缺乏大量的臨床數(shù)據(jù)驗證，需后續(xù)高質(zhì)量研究進一步推動BCG治療NMIBC的迅速發(fā)展。