張銀海，關永暉，羅 成

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆烏魯木齊 835000)

間質性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征(interstitial cystitis/bladder painful syndrome，IC/BPS)是一種慢性炎癥性疾病，會導致尿急、夜尿增多和骨盆區(qū)域疼痛[1]，嚴重影響了患者的生存質量及生活質量。有研究表明IC/BPS的發(fā)病率為0.06%～30.00%[2]，男女比例為1∶9[3]，其發(fā)病因素與種族、地區(qū)、性別等多種因素相關[4]。目前，IC/BPS的發(fā)病機制、病理生理過程尚不明確。雖已提出幾種理論，包括糖胺聚糖缺失、隱匿性感染、肥大細胞的活化和神經(jīng)源性炎癥理論[5]，但是都缺乏明確的證據(jù)。有研究表明自身免疫是IC/BPS發(fā)病過程中一個有效的理論[6]。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是迄今為止研究最多、最集中的侵襲性病原體免疫傳感器，主要分布于免疫細胞，如肥大細胞、巨噬細胞等[7]。TLR4作為TLRs家族里的明星分子，受到了廣泛關注[8]。該研究首先通過膀胱內途徑建立雌性SD大鼠IC/BPS模型[9]，測定實驗組大鼠和對照組大鼠尿液的組胺水平。然后采用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)、甲苯胺藍(tol-uidine blue,TB)染色檢測人和大鼠膀胱組織中炎癥浸潤及肥大細胞浸潤程度，采用免疫組織化學染色、免疫印跡、實時熒光PCR等方法檢測人和大鼠膀胱組織中TLR4蛋白及基因水平的變化，進一步明確TLR4在IC/BPS中的潛在作用，為IC/BPS的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗性IC/BPS大鼠模型的建立及組織準備自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心購入24只、6～8周、體重200～220 g的雌性SD大鼠。將雌性SD大鼠隨機分為實驗組和對照組，各12只。采用腹腔注射100 g/L的水合氯醛(1 mg/kg)對大鼠進行全身麻醉，固定大鼠，用體積分數(shù)為70%的乙醇和碘酊對大鼠尿道開口消毒，隨后使用無菌導管經(jīng)尿道插入大鼠膀胱內。排空大鼠膀胱尿液，向實驗組大鼠的膀胱先灌注1 mL硫酸魚精蛋白(protamine sulfate,PS,10 mg/mL)，保留45 min后使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)溶液沖洗；隨后立即向實驗組大鼠膀胱內灌注1 mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,750 μg/mL)，保留30 min，拔出導管。對照組用同樣的方法灌注2 mL生理鹽水，兩組大鼠每2 d進行1次灌注，為期4周。在最后1次灌注的24 h后，處死各實驗組大鼠。摘除大鼠膀胱，沿著縱軸把膀胱平均分成三個部分。其中一部分固定于40 g/L多聚甲醛內，后續(xù)進行HE、TB染色及免疫組織化學染色；其他2個部分被及時儲存在液氮中，后續(xù)進行逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse trans-cription-polymerase chain reaction，RT-PCR)、免疫印跡試驗。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學動物倫理委員會批準，動物護理和實驗均按照動物研究的生物倫理原理進行。

1.2 臨床患者膀胱組織的活檢研究對象為2018—2020年新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院收治的60例女性患者，平均年齡40～75歲，平均病史6～30個月。采用病例對照研究。選取30例患有間質性膀胱炎的女性患者作為病例組，臨床表現(xiàn)為6個月以上的膀胱區(qū)疼痛、尿急、尿頻≥8次/d、排尿后疼痛減輕及憋尿時加重，膀胱鏡下具有典型的膀胱點狀出血、膀胱壁Hunner潰瘍及相關組織學特征，排除神經(jīng)源性膀胱或膀胱逼尿肌無力、子宮內膜異位癥、反復尿路感染、膀胱癌患者，且均未服影響膀胱功能的藥物。匹配30例性別相同、體重相近(±5 kg)、膀胱鏡下診斷為膀胱癌的患者作為對照組，排除膀胱鏡下表現(xiàn)為典型間質性膀胱炎的患者。在膀胱鏡下采集實驗組患者的膀胱組織和對照組的癌旁健康膀胱組織后，固定于40 g/L多聚甲醛，后續(xù)行HE染色、TB染色及免疫組織化學染色。所有參與者均簽署知情同意書，并經(jīng)新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院委員會批準。

1.3 大鼠尿液中組胺的測定大鼠模型處死前，使用無菌塑料容器分別采集實驗組和對照組大鼠尿液樣本，隨后將尿液于3 000 rpm離心10 min，收集上清并加入生物素抗體工作液50 μL，37 ℃孵育45 min。隨后洗板3次，加入酶結合物工作液，37 ℃孵育30 min。最后加入顯色劑(鹽酸鹽水合物)，37 ℃避光孵育15 min。孵育結束后立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度(optical density,OD)值。

1.4 HE及TB染色將收集的膀胱組織置于40 g/L多聚甲醛，固定、脫水、包埋制備蠟塊，選擇連續(xù)的切片進行染色。HE染色：切片用蘇木精染色10 min，流水下沖洗后，鹽酸分化，伊紅染色2 min，乙醇梯度每組隨機抽取5個切片，在200及400倍放大倍數(shù)下觀察所有切片。TB染色：切片入預熱60 ℃的TB染色液40 min，蒸餾水洗3次，體積分數(shù)為95%乙醇快速分化，脫色。利用Axioplan 2 imaging顯微圖像分析系統(tǒng)(放大倍數(shù)：大鼠模型×200，臨床樣本×400)選擇5個視野的肥大細胞，并記錄脫顆粒數(shù)。

1.5 采用RT-PCR檢測TLR4 mRNA表達RT-PCR檢測實驗組及對照組大鼠膀胱組織內TLR4 mRNA的表達。取大鼠膀胱組織，采用Trizol試劑盒提取總RNA，測定RNA濃度，根據(jù)TaKaRa逆轉錄試劑盒反應條件生成對應cDNA模板。引物由上海生工生物公司設計并合成：大鼠TLR4上游引物序列：5’-TGG TGGCTGTGGAGACAAAAATGAC-3’，下游引物序列：5’-CTGAAA GGCTTGGGCTTGAATGGAG-3’；以GAPDH為內參，其上游引物序列： 5’-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3’，下游引物序列：5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’。每組的引物各加入20 μL反應體系，混勻后放入PCR儀。采用2-△△Ct比較樣本mRNA的相對變化。

1.6 免疫印跡試驗(Western blot)從液氮中取出膀胱組織，在微量天平上稱重，切成小塊(1～2 mm3)。采用PIPA試劑盒(HAT，西安)操作說明書提取組織蛋白，BCA試劑盒(HAT，西安)測量蛋白質濃度，隨后按25 μg/孔行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后250 mA恒流條件下轉膜2 h,洗膜，封閉，進行一抗孵育：anti-TLR4抗體(1∶800，Bioss,中國)、anti-β-actin抗體(1∶3 000，Bioss,中國)，4 ℃搖床過夜，洗膜后于1∶5 000二抗室溫孵育1 h，充分洗膜后，ECL顯色液發(fā)光。

1.7 免疫組織化學染色將石蠟切片在60 ℃溫度下烤片2 h，二甲苯脫蠟、梯度乙醇入水，使用胃蛋白酶37 ℃孵育1 h，體積分數(shù)為0.3%的過氧化氫孵育30 min，使用血清封閉液封閉組織30 min，隨后切片使用TLR4抗體(1∶200，Bioss,中國)4 ℃孵育過夜；次日，切片室溫復溫1 h，滴加酶抗山羊抗兔IgG聚合物孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色，蘇木精染核，鹽酸分化后用中性樹膠封片。陽性細胞鏡下顯示為黃褐色，用400倍放大倍數(shù)觀察膀胱組織中TLR4陽性細胞數(shù)，每個組織隨機選取5個非連續(xù)視野進行計數(shù)后取均值。

2 結 果

2.1 動物模型

2.1.1大鼠尿液中的組胺水平 Elisa法檢測大鼠尿液中組胺表達水平，結果顯示IC/BPS組大鼠尿液中組胺水平較對照組顯著升高(圖1)。

圖1 實驗組與對照組大鼠尿液中組胺含量(＊P<0.05)

2.1.2各組大鼠膀胱組織炎性變化 HE染色顯示，與對照組相比，IC/BPS雌性大鼠膀胱黏膜上皮變薄、充血水腫，固有層浸潤，膀胱組織可見大量炎性細胞浸潤；對照組膀胱上皮完整，未見炎性細胞浸潤(圖2A)。TB染色肥大細胞呈紫色顯示IC/BPS雌性大鼠膀胱壁上皮嚴重損傷，肥大細胞數(shù)目急劇增多，且多分布于黏膜下層，主要呈脫顆粒狀態(tài)肥大細胞存在(圖2A)。對實驗組與對照組大鼠膀胱組織內肥大細胞計數(shù)，發(fā)現(xiàn)IC/BPS組大鼠膀胱組織內肥大細胞數(shù)較對照組顯著增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2B)。

A:HE染色(×200),TB染色(×200);B：IC/BPS組及對照組膀胱組織內肥大細胞計數(shù)，***P<0.05。圖2 兩組大鼠膀胱HE染色及TB染色結果

2.1.3實驗組與對照組大鼠膀胱組織TLR4的表達 本實驗采用RT-PCR、Western blot和免疫組織化學染色檢測TLR4在IC/BPS組大鼠及對照組大鼠膀胱組織內mRNA及蛋白表達水平。RT-PCR分析顯示，IC/BPS大鼠膀胱中TLR4基因表達明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3A)。Western blot檢測結果顯示，IC/BPS組TLR4蛋白表達量顯著高于對照組(P<0.05，圖3B)。針對大鼠膀胱組織標本免疫組織化學染色結果(圖3C)，TLR4陽性細胞被染為棕色，主要表達于膀胱黏膜層，IC/BPS組大鼠膀胱組織內TLR4陽性細胞數(shù)較對照組顯著增高(P<0.05，圖3D)。

A:實驗組和對照組大鼠膀胱組織的TLR4基因水平比較，***P<0.005；B:兩組TLR4蛋白水平比較；C：大鼠膀胱組織標本免疫組織化學染色(×400)；D:實驗組和對照組膀胱組織的TLR4陽性細胞計數(shù)，***P<0.05。圖3 實驗組與對照組大鼠膀胱組織TLR4的表達

2.2 臨床樣本

2.2.1HE染色及TB染色 HE染色所見與大鼠IC/BPS模型相一致，IC/BPS患者膀胱組織可見大量炎性細胞浸潤，膀胱黏膜上皮損傷，剝脫并可見組織充血水腫等；與IC/BPS組相比，正常組膀胱上皮完整，未見炎性細胞浸潤(圖4A)。TB染色發(fā)現(xiàn)，IC/BPS患者膀胱黏膜固有層和逼尿肌中可見肥大細胞浸潤，肥大細胞脫顆粒現(xiàn)象嚴重(圖4A)；與對照組相比，IC/BPS患者膀胱組織中肥大細胞數(shù)目顯著增多，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4B)。

A：HE及TB染色(×400)；B：對照組及IC/BPS組患者膀胱組織內肥大細胞計數(shù)，***P<0.001。圖4 臨床樣本膀胱組織HE染色及TB染色

2.2.2兩組膀胱黏膜組織中TLR4的表達情況 為證實女性IC/BPS患者膀胱組織內TLR4的表達水平，對女性IC/BPS患者膀胱組織和對照組癌旁健康膀胱組織進行免疫組織化學染色。與大鼠模型一致，免疫組織化學染色顯示，間質性膀胱炎組TLR4陽性細胞數(shù)較對照組顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義，***P<0.05，圖5。

A：TLR4陽性染色細胞免疫組化染色呈現(xiàn)黃棕色(×400);B：IC/BPS組患者膀胱組織及對照組癌旁健康膀胱組織中TLR4陽性細胞計數(shù)，***P<0.001。圖5 臨床樣本膀胱組織中TLR4的表達

3 討 論

歐洲間質性膀胱炎研究學會(European Society for Study of interstitial cystitis，ESSIC)指出IC/BPS的臨床診斷為6個月以上的與膀胱相關的骨盆疼痛或不適，并至少伴有一種尿道癥狀，如尿急或尿頻[10]。值得注意的是，近年來，我國IC/BPS的確診率不斷上升，對患者的身心健康造成極為消極的影響。臨床診療中，IC/BPS的治療包括：神經(jīng)調節(jié)、膀胱沖洗、手術及藥物治療等，但均未獲得滿意的臨床療效[11]。因此，研究IC/BPS的發(fā)病機制并尋找新的治療方法具有重要的臨床意義。TLR4已被證實表達于人和鼠的膀胱組織[12]，并在膀胱腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用[13-14]。近年來，TLR4在心肌、肝臟及腦缺血等非生物性炎癥損傷研究較多[15]，而在IC/BPS發(fā)病機制中的作用尚未可知。

有研究表明間質性膀胱炎患者的膀胱活檢標本中可見抗核抗體，這提示IC/BPS可能是一種自身免疫性疾病。IC/BPS與自身免疫性疾病還具有很多相似點，如好發(fā)于中年女性、部分患者有過敏史，患者中罹患類風濕關節(jié)炎、干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等概率明顯高于正常人，免疫抑制劑治療有效[16]。TLR4受體是TLR家族的成員之一，屬于Ⅰ類跨膜受體，參與機體免疫應答啟動環(huán)節(jié)[17]。該受體以病原體相關分子模式(pathogen-associat-ed molecular patterns，PAMP)識別配體，如革蘭陰性菌細胞壁成分的脂多糖、脂寡糖、細菌內毒素和病毒、真菌等，還以危險/損害相關分子模式(danger/damage-associated molecular patterns，DAMP)識別內源性配體，如對感染產生的各種內源性分子，啟動信號轉導途徑，從而參與機體的固有免疫與獲得性免疫造成組織損傷[18-19]。TLR4的激活是機體抵抗外界的第一道防線，但信號的過度活化也會導致高水平炎性細胞因子的分泌，從而加重細胞的損傷，打破機體對自身抗原的免疫耐受，促進自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[20]。在本研究中，通過建立IC/BPS大鼠模型和臨床收集女性IC患者的膀胱組織，證實在IC/BPS發(fā)生發(fā)展過程中TLR4受體表達水平顯著上調，因此推測TLR4在IC/BPS發(fā)病過程中具有一定作用。

迄今為止尚無診斷IC/BPS的金標準[21]。因為缺少特異性表現(xiàn)，IC/BPS的診斷更多傾向于臨床癥狀。美國泌尿外科指南建議采取排除性診斷方法來診斷IC/BPS，必要時可行膀胱鏡檢查和病理活檢。有研究顯示IC/BPS的主要病理變化是肥大細胞在膀胱肌層和黏膜下層活化和聚集[22]，肥大細胞的功能是釋放炎性介質和細胞因子。它的胞質中含有大量的分泌顆粒，當受到刺激應答時，肥大細胞就會脫顆粒釋放多種血管活性物質參與免疫應答，例如組胺、前列腺素、白三烯、血小板活化因子等。這些生物活性物質可導致神經(jīng)元致敏和神經(jīng)遞質的釋放，進一步刺激肥大細胞，這種惡性循環(huán)可能導致了IC/BPS慢性疼痛的癥狀[23]。本研究中IC/BPS建模時先向膀胱內灌注1 mL硫酸魚精蛋白破壞大鼠的膀胱黏膜屏障，再灌注1 mL脂多糖，進一步通過損傷的膀胱黏膜滲透入膀胱基質，從而造成一系列的炎癥反應。有研究表明肥大細胞分布有廣泛的TLR4受體[19]，當膀胱肌層肥大細胞計數(shù)超過20個/mm2，IC/BPS的診斷特異度和敏感度分別為88%和95%[24]。本實驗通過RT-PCR、蛋白免疫印跡、免疫組織化學染色等證實IC/BPS大鼠膀胱組織中TLR4 mRNA及蛋白水平的變化，較對照組顯著增高(P<0.05)。臨床樣本中，IC/BPS患者膀胱組織中TLR4蛋白水平急劇增高(P<0.05)。因此，我們推測靶向TLR4治療可能會為IC/BPS的臨床診療提供新的視角。

TLR4與配體結合后形成TLR4/MD-2復合物并二聚化，與MyD88的TIR結構域結合后激活MyD88，形成有活性的TLR4/MyD88復合物，激活IL-1R相關激酶4(IL-1R-associated kinase4，IRAK4)，使IRAK1和IRAK2磷酸化后與TRAF6結合，活化IκB激酶(inhibitor of nuclear factor-κB kinase，IKK)，促使NF-κB抑制因子(inhibitor of nuclearfactor-κB，IκB)磷酸化后從NF-κB上脫落，使NF-κB進入細胞核并激發(fā)后續(xù)反應[25]，最終導致細胞因子和炎癥介質的釋放，引起免疫應答反應。下一步的研究將通過測定TLR4啟動免疫反應后的下游分子NF-κB、P-NF-κB和MyD88的表達水平，進一步探討TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在間質性膀胱炎的潛在作用。

綜上所述，對TLR4受體在間質性膀胱炎作用機制的進一步研究，將有助于闡明固有免疫的啟動與機體應激反應性損傷之間的聯(lián)系，并指出抑制TLR4的表達水平可能對患者IC/BPS的治療有益。相信隨著對TLR4研究的不斷深入，會為臨床疾病的治療帶來新思路。

本研究局限性在于：①本實驗例數(shù)較少，需更大樣本量進一步驗證；②本研究提示TLR4在IC/BPS發(fā)病過程中具有一定作用。針對其具體的分子機制尚未說明，實驗尚在進行中，后期將會整理并發(fā)表。