李哲宏 甘新天 白磊鵬 呂家興 曹海營 徐 瑩金 宇

( 1 承德醫(yī)學院研究生院2019級 ， 河北 承德 067000 ； 2 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科 )

骨肉瘤(Osteosarcoma OS)是20歲以下兒童、青少年好發(fā)的骨原發(fā)性惡性腫瘤，惡性度高、預后差。目前骨肉瘤治療主要以大劑量個體化新輔助化療(在術前化療)和手術治療為主，但治療后仍具有病情進展快、病灶轉移早、腫瘤易復發(fā)、治療困難等特點[1]。對抗骨肉瘤需要新的策略，而基因治療技術為攻克骨肉瘤提供了新的可能。基因治療是指將外源正?；驅氚屑毎约m正或補償缺陷和異?；蛞鸬募膊?，以達到治療目的[2]。20世紀 60 年代美國分子生物學家Lederberg J首次提出基因治療的初步概念，為基因治療的發(fā)展奠定了基礎[3]。近20年來人類基因組學的進展表明，骨肉瘤是由宿主體細胞基因組異常介導而產(chǎn)生的[4]。自1990年開始，數(shù)據(jù)顯示在過去20年時間內全球范圍內進行了近2600個各種基因療法臨床試驗，直到近10年才體現(xiàn)出基因治療顯著的臨床益處，尤其是免疫缺陷病、血液系統(tǒng)疾病以及腫瘤領域[5-6]。目前研究骨肉瘤的基因治療在基礎與臨床均取得了巨大進展，現(xiàn)對骨腫瘤的基因治療最新進展綜述如下。

1自殺基因治療：自殺基因治療又稱為基內導向性酶前體藥物治療，其原理為將腫瘤細胞或其附近的細胞修飾，使其表達自殺基因，通過使用腫瘤特異性調控元件(啟動子)使藥物僅在腫瘤細胞中被激活，使得腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性物質，從而導致攜帶該基因的受體細胞被殺死[7]。自殺基因介導的腫瘤基因治療還具有“旁觀者效應”，即導入有自殺基因的腫瘤細胞對鄰近的未導入自殺基因的腫瘤細胞也有殺傷作用[8]?，F(xiàn)階段，胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶系統(tǒng)(CD/5-FC)、單純皰疹病毒-胸腺曉啶激酶/無環(huán)鳥苷系統(tǒng)(HSV-TK/GCV)已經(jīng)運用到骨肉瘤試驗性治療且取得一定進展[9]。Wang Y等[8]發(fā)現(xiàn)由激素受體酶啟動子驅動的反義血管內皮生長因子表達與缺氧相結合，可以抑制人骨肉瘤細胞中血管內皮生長因子的表達，從而提高HSV-TK / GCV系統(tǒng)的選擇性殺傷作用和旁觀者效應。Zhang D 等[10]發(fā)現(xiàn)泛素相關修飾物拓撲酶Ubc9蛋白(Ubc9)在骨肉瘤中的過表達，通過小干擾RNA(siRNA)沉默Ubc9可以抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移，并顯著提高細胞對HSV-TK的敏感性。NguyenThai QA等[11]檢測發(fā)現(xiàn)表達胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶前藥(CD/5-FC MSCs)的人骨髓間充質干細胞(MSCs)對人骨肉瘤細胞系Cal72的靶向性。隨著更轉染技術的提高、有效自殺基因的發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤的自殺基因治療有著更加廣闊的前景。

2基因沉默治療：基因沉默是特定基因的表達量下調或表達受到抑制，指的是在腫瘤治療中由雙鏈RNA誘導的識別和清除細胞非正常RNA，誘導腫瘤細胞凋亡、降低其侵襲能力的一種手段。目前研究表明，基因沉默主要有2種，轉錄水平上的基因沉默和轉錄后基因沉默。前者主要通過基因甲基化、位置效應、同源基因的反式失活、后成修飾作用以及重復序列使得腫瘤細胞基因沉默；后者主要通過共抑制和RNA干擾使得腫瘤細胞基因沉默。目前基因沉默在骨肉瘤治療中有著長足的進展，Han Y等[12]研究發(fā)現(xiàn)，沉默F(xiàn)OS樣抗原-1基因、Xi LC 等[13]研究發(fā)現(xiàn)皮膚橋蛋白(DPT)均可抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，F(xiàn)OS樣抗原-1基因同時可以下調ERK / AP-1信號通路而下調了骨肉瘤相關基因的表達。Jin PY[14]等研究57例骨肉瘤患者的骨肉瘤細胞，發(fā)現(xiàn)DNA依賴性蛋白激酶復合催化亞基(DNA-PKcs)對骨肉瘤MG-63細胞凋亡，增殖，遷移和侵襲起抑制作用。Chen D 等[15]人研究發(fā)現(xiàn)SOx4基因沉默后，骨肉瘤細胞中Bax，Caspase-3和P53的蛋白表達水平明顯升高，而Bcl-2，MMP2和MMP9的蛋白表達水平明顯降低。實驗裸鼠體內分析進一步證實，敲除SOx4可抑制骨肉瘤的生長。Liu J等[16]實驗發(fā)現(xiàn)，抑制泛素特異性蛋白酶1可下調多種蛋白的表達，尤其是SIK2，緊接著SIK2的RNAi顯著降低SIK2蛋白的表達，抑制集落形成能力，誘導凋亡，降低骨肉瘤細胞的侵襲力。目前基因沉默技術具有特異性、高效性、靶點的多樣性與選擇性等特點，有望給腫瘤的治療帶來革命性的進展。

3抑癌基因治療：抑癌基因是一類存在于正常細胞內可抑制細胞生長并具有潛在抑癌作用的基因。抑癌基因在控制細胞生長、增殖及分化過程中起著十分重要的負調節(jié)作用，它與原癌基因相互制約，維持正負調節(jié)信號的相對穩(wěn)定。而骨肉瘤最常見的特征是基因組紊亂，染色體改變的非整倍體，腫瘤抑制基因和細胞周期的放松調控，以及缺乏DNA修復[17]。骨肉瘤的發(fā)生與成骨過程中參與抑癌基因甲基化失活導致監(jiān)視失敗、缺乏DNA修復或抑制凋亡有關[18]。p53基因全長約20kb，定位于人染色體17p13，轉錄成2.5kb mRNA，編碼393個氨基酸組成的蛋白，相對分子質量約為53KD。p53基因由11個外顯子和10個內含子組成，外顯子2、4、5、7、8分別編碼5個進化上高度保守的結構域。p53基因自發(fā)現(xiàn)以來，一直都是備受關注的熱點抑癌基因，作為對各種細胞信號的響應，腫瘤抑制蛋白p53激活了一系列基因，這些下游的microRNAs促進了基因組完整性的維持、細胞周期停滯、細胞衰老和凋亡[19]。有報道稱[18]，在骨肉瘤來源的細胞系中，p53靶基因以及活性受p53調控的基因，由于其啟動子的高甲基化而被沉默，而導致的基因組紊亂，誘導骨肉瘤的發(fā)生。最新研究發(fā)現(xiàn),Jun激活結構域結合蛋白1(Jun1)在體內的過表達，以p53依賴的方式加速自發(fā)腫瘤的形成，故Jun1可以成為治療骨肉瘤的靶點之一[20]。Yang J等[21]實驗證明熱休克蛋白90(HSP90)被烯丙基氨基17-去甲氧基格爾德霉素(17-AAG)抑制，其可通過β-catenin/ runt相關轉錄因子2(Runx2)信號傳導抑制骨肉瘤細胞生長。Lin JT等[22]利用殼聚糖接枝聚修飾人類免疫缺陷病毒-1轉錄反式激活因子，可同時將p53和阿霉素共轉導入細胞核，從而在體內外有效地消除癌細胞，發(fā)揮其抗腫瘤作用。Rb基因全長約200kb，定位于人染色體13q14，轉錄成4757bpm RNA，編碼928個氨基酸組成的蛋白，相對分子質量約為110KD。Rb基因由有27個外顯子和26個內含子組成，外顯子與內含子交界處是保守的GT-AT序列。RB基因是人類癌癥中最常見的突變基因之一。經(jīng)典途徑：RB通過調節(jié)E2F轉錄因子的活性，通過調節(jié)細胞周期進程中的G1 / S期過渡發(fā)揮其腫瘤抑制活性。然而，當腫瘤發(fā)生轉移、增殖、耐藥時，最容易檢測到的就屬RB基因的畸變[23]。Kashuba E等[24]實驗發(fā)現(xiàn)RB結合蛋白MRPS18-2(S18-2)在原代成纖維細胞中的過表達導致其永生化，并伴隨著胚胎干細胞標志物的誘導和最終的惡性轉化，抑制S18-2可以達到抑制骨肉瘤細胞增殖生長。同時臨床研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜母細胞瘤(RB)-E2F通路的激活與否與臨床預后較差的分子亞型之間存在顯著的關聯(lián)，即該通路定義了骨肉瘤的分子表型，為臨床篩選敏感藥物、治療提供了靶向支持[25]。Wang TX等[26]用RNA22程序預測，構建蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網(wǎng)絡，并用Cytoscape軟件進行可視化。鑒定出47個下調的高甲基化基因和3個上調的低甲基化基因，這些基因可能參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移，為潛在的預后生物標志物和治療靶點。Kreahling JM等[27]臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，MK1775作為單一治療藥物時，所有被測試的骨肉瘤中都會進入有絲分裂和啟動凋亡細胞死亡。MK1775可以抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶導致顯著的骨肉瘤細胞的凋亡。

4免疫基因治療：免疫基因治療是通過增強免疫系統(tǒng)的識別能力、增強免疫系統(tǒng)的機能，從而達到抑制腫瘤的增長、侵襲轉移及復發(fā)。先天性和適應性免疫在抑制腫瘤生長中起著至關重要的作用，先天性免疫細胞通過直接識別和殺死或通過自我激活觸發(fā)強烈的適應性免疫反應2種機制來實行腫瘤抑制[28]。針對骨肉瘤的免疫基因治療，Tellez-Gabriel M等[29]認為，骨肉瘤的特征之一為免疫細胞浸潤，包括T和B淋巴細胞，NK細胞，多核細胞和巨噬細胞。Lussier DM 等[30]發(fā)現(xiàn)，a-CTLA-4和ax-PD-L1抗體在轉移性骨肉瘤的K7M2小鼠模型中具有阻斷作用，阻斷可以通過增強機體對腫瘤的清除率而改善K7M2小鼠的生存率。血管內皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(VEGFR-TKI)是小分子抗腫瘤血管生成的藥物，免疫檢查點則是防止免疫系統(tǒng)過度激活的一致性通路，能夠在免疫反應過度時對信號通路進行關閉。Duan XL等[31]發(fā)現(xiàn)，使用VEGFR-TKI和免疫檢查點抑制劑的聯(lián)合治療骨肉瘤荷瘤小鼠，其聯(lián)合療法抑制信號傳導及轉錄激活因子3的活化來降低PD-L1的表達，并抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲，減少了荷瘤小鼠的肺轉移，腫瘤生長，改善了生存率并逆轉了腫瘤微環(huán)境。免疫基因理想的治療方式應具備安全、價廉、性質穩(wěn)定等特點。免疫基因治療通過影響基因表達改變了體內腫瘤微環(huán)境，激活自身的免疫功能殺傷腫瘤細胞，有著廣闊的臨床前景。

5抗血管生成基因治療：在周圍血管的支持下，細胞毒性藥物雖然可以殺死腫瘤細胞，但殘存腫瘤細胞仍可獲得血供而得以繼續(xù)生長。同時，異常的腫瘤血管使藥物向腫瘤組織內部遞送減少，最終導致治療效果受限?？寡苌芍委熞阅[瘤新生血管為作用靶點，切斷腫瘤生長轉移所需要的“營養(yǎng)供應”從而達到“餓死”腫瘤的目的。與僅作用于腫瘤細胞增殖的化療藥物不同，通過與血管內皮生長因子特異性結合，阻止其與受體相互作用，發(fā)揮對腫瘤血管的多種作用：使現(xiàn)有的腫瘤血管退化，從而切斷腫瘤細胞生長所需氧氣及其他營養(yǎng)物質；抑制腫瘤新生血管生成，從而持續(xù)抑制腫瘤細胞的生長和轉移[32]。Li YS等[33]在研究中發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤中，金屬蛋白酶MMPs過度表達，其過度表達導致肉瘤細胞在遠處(主要是在肺部)存活，生長并產(chǎn)生轉移灶的關鍵性要素。Hadjimichael AC等[34]發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素通過抑制MMP功能阻止細胞外基質和基本膜降解，使得骨肉瘤細胞喪失了侵襲和轉移能力。此外研究還發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素消除分泌血管內皮生長因子的抗血管生成作用，使得腫瘤缺乏營養(yǎng)供給?？寡苌苫蛲ㄟ^抑制骨肉瘤滋養(yǎng)血管，阻斷骨肉瘤營養(yǎng)供給，有效阻斷了腫瘤的生長轉移。

問題與展望：基因治療作為一嶄新的治療手段，為腫瘤患者帶來希望，但其運用從基礎實驗到臨床應用仍有很長的一段路需要走，回順基因治療骨肉瘤的進展，其誕生以來所走過的道路，基因治療還面臨很多問題與挑戰(zhàn)，包括基因組編輯發(fā)生脫靶效應,從而導致不同程度的副作用、毒性或動力學改變，如何提高基因遞送和編輯效率以精確治療骨肉瘤，基因轉移效率高導致的嚴重毒性等。雖然基因治療目前存在一定的問題，但隨著科技發(fā)展，基因治療的關鍵技術將會不斷得到突破和解決。未來幾年是全球腫瘤基因治療技術突破重點時，基因治療或將成為骨肉瘤治療不可或缺的一部分。