夏 露,顏林志,黃 敏,梅 潔,屈王蕾

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦科，浙江 溫州，325000)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的腫瘤之一。盡管近年來宮頸癌的早期篩查以及HPV疫苗的應(yīng)用降低了其發(fā)病率，但目前宮頸癌仍出現(xiàn)了發(fā)病群體逐漸年輕化且預(yù)后差的趨勢。在宮頸癌的眾多病理類型中，鱗癌約占80%～85%，因此，針對子宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中相關(guān)分子標(biāo)志物的研究成為了目前的熱門領(lǐng)域[1]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是機體內(nèi)多種惡性腫瘤細胞增殖、分化的重要信號通路中心樞紐，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)以及p70核糖體蛋白S6激酶(p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K)是mTOR信號通路中上游和下游的重要調(diào)控因子，當(dāng)其出現(xiàn)不同程度的改變后，均會引發(fā)mTOR信號通路的改變，導(dǎo)致機體內(nèi)多種腫瘤的發(fā)生[2]。目前對于上述通路中相關(guān)蛋白在子宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展中所起到的作用尚不清楚[3]。因此，本研究旨在于探討子宮頸鱗癌組織中mTOR、PI3K以及p70S6K的表達與正常組織的差異，以及三者之間的相關(guān)性，為子宮頸鱗癌的診斷以及靶向性治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月1日至2021年1月1日于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦科住院手術(shù)治療并經(jīng)病理學(xué)診斷證實為子宮頸鱗癌的組織標(biāo)本80例作為觀察組，另隨機選取同期在本院進行陰道鏡活檢并經(jīng)病理學(xué)診斷證實為正常子宮頸的組織標(biāo)本80例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)治療前未進行放化療治療；②臨床資料信息完善。觀察組年齡為27～73歲，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)對子宮頸鱗的組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)[4]，含高分化(G1)及中分化(G2)共54例，低分化(G3)26例；根據(jù)按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(the International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[5]，含Ⅰ期62例，Ⅱ期18例；含間質(zhì)浸潤深度≥1/2者36例，間質(zhì)浸潤深度<1/2者44例；含淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者50例。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2 研究方法

1.2.1主要試劑

本研究采用的檢測試劑盒包括兔抗人mTOR單克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人p70S6K單克隆抗體、DAB顯色試劑盒以及免疫組化試劑盒，上述試劑盒均購自北京博奧森公司。

1.2.2檢測方法

所有相關(guān)抗體檢測均按照試劑盒中的使用說明書嚴格操作。將患者的組織標(biāo)本采用4%的中性甲醛進行相關(guān)固定，常規(guī)脫水后用石蠟進行包埋，切片厚度為4μm。將所得切片緊貼于涂有防脫膠的載玻片上，然后進行脫蠟水化，PBS浸泡，時間為5min，再進行高壓抗原修復(fù)。采用過氧化氫去離子水孵育15min后滴入山羊血清15min。將三種抗體所使用工作液濃度均調(diào)整為1∶250，采用PBS進行沖洗，再加入生物素化二抗15min后PBS沖洗，再加入辣根酶進行鏈酶卵白素標(biāo)記，置于室溫15min后PBS沖洗。立即加入DAB顯色劑，在顯微鏡下對時間、脫水以及封片操作進行掌握。

1.2.3結(jié)果判定

所有切片結(jié)果的閱讀及判定均由2名資深的病理科醫(yī)生獨立進行。mTOR、PI3K以及p70S6K在細胞質(zhì)內(nèi)均呈現(xiàn)出黃色或棕黃色信號表示為陽性。選擇5個以上高倍視野中計數(shù)>1000個細胞中的腫瘤細胞，根據(jù)染色程度和染色范圍進行評分[6]：染色強度為未著色或淡染記1分，中度染色記2分，強染色記3分；染色范圍根據(jù)陽性細胞所占比例計算，<10%記1分，10%～25%記2分，26%～50%記3分，51%～75%記4分，>75%記5分。將染色強度以及染色范圍評分進行相加，≤3分者為陰性，>3分者為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)[n(%)]表示，兩組間比較采用χ2檢驗，兩變量間的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)性分析法，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mTOR、PI3K及p70S6K在子宮頸鱗癌組織中的表達

正常宮頸組織中mTOR、PI3K及p70S6K的表達率極低，分別為10.00%、1.25%和1.25%。子宮頸鱗癌組織中mTOR、PI3K及p70S6K的表達率較高，分別為72.50%、66.25%和53.75%。經(jīng)對比，子宮頸鱗癌組織中mTOR、PI3K及p70S6K的表達率均顯著高于對照組(χ2值分別為64.475、75.584、55.298，P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者mTOR、PI3K以及 p70S6K在組織中的陽性表達率[n(%)]Table 1 Positive expression rates of mTOR,PI3K and p70S6K in the tissues of two groups[n(%)]

2.2 mTOR、PI3K及p70S6K的陽性表達與宮頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

經(jīng)對比，子宮頸鱗癌組織中mTOR的表達與間質(zhì)浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(χ2值分別為15.810、7.373，P<0.05)；PI3K的表達與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(χ2值分別為12.626、4.747，P<0.05)；p70S6K的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=11.241，P<0.05)，見表2。

表2 不同病理特征間mTOR、PI3K及p70S6K的陽性表達情況比較[n(%)]Table 2 Comparison of positive expression status of mTOR,PI3K and p70S6K among different pathological features[n(%)]

2.3 子宮頸鱗癌組織中mTOR、PI3K及p70S6K表達的相關(guān)性

Spearman秩相關(guān)分析顯示，子宮頸鱗癌組織中mTOR的表達與PI3K、p70S6K均呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.522、0.323，P<0.05)，見表3。

表3 mTOR、PI3K以及p70S6K表達的相關(guān)性分析(n)Table 3 Correlation analysis of expression of mTOR,PI3K and p70S6K(n)

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)高發(fā)的惡性腫瘤類型，其中鱗癌占比約為80%～85%，其整個病理發(fā)生發(fā)展過程較為復(fù)雜。針對宮頸癌生物分子機制的探索，有助于進一步了解期病理發(fā)生發(fā)展的過程和機制，為宮頸癌的基因治療提供科學(xué)的理論依據(jù)。

3.1 子宮頸鱗癌組織中mTOR的表達及其臨床價值

mTOR是機體內(nèi)廣泛分布的一種蛋白激酶，其對于生物體細胞的生長、分化以及存活起到了至關(guān)重要的作用，同時也是多條信號通路的中心樞紐。既往研究發(fā)現(xiàn)[7]，mTOR信號通路中主要由2條上游通路以及2條下游通路組成。其中上游通路中最為重要的為PI3K/Akt/mTOR通路，當(dāng)PI3K被磷酸化后，能夠激活A(yù)kt，激活后的Akt能夠使mTOR產(chǎn)生應(yīng)答，進一步調(diào)節(jié)下游靶點p70S6K的活性，促使腫瘤細胞達到快速增值，腫瘤細胞G1期顯著縮短，腫瘤迅速生長。同時研究還指出，mTOR通路在人體中多種腫瘤的發(fā)生中起到一定的作用，如乳腺癌、結(jié)腸癌等[8]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，mTOR在子宮頸鱗癌患者中的表達率顯著高于正常人，且與間質(zhì)浸潤深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，部分研究還指出mTOR的表達還與預(yù)后相關(guān)，mTOR表達陽性是影響患者預(yù)后的獨立危險因素[9]。

3.2 子宮頸鱗癌組織中PI3K的表達及其臨床價值

PI3K是mTOR通路中重要的上游信號分子，當(dāng)腫瘤細胞受到生長因子的刺激時，細胞內(nèi)的PI3K會進行磷酸化形式的激活，形成磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3-phosphate，PIP3)，其能夠與細胞內(nèi)的Akt以及磷酸肌醇依賴激酶(3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1，PDK1)結(jié)合，從而改變細胞內(nèi)Akt的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Akt的活化，當(dāng)活化的Akt與PI3K將信號傳導(dǎo)至mTOR時，會進一步促進細胞周期蛋白的上調(diào)，細胞有絲分裂加速，腫瘤生長較快[10]。既往研究已證實PI3K是一種癌基因，與人體內(nèi)多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，且其表達會隨組織分化程度及臨床分期的不同而不同，當(dāng)組織分化越低，其表達則出現(xiàn)上調(diào)，同時在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中顯著增高[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，PI3K在子宮頸鱗癌患者中的表達顯著高于正常人，且與組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

3.3 子宮頸鱗癌組織中p70S6K的表達及其臨床價值

p70S6K是絲/蘇氨酸蛋白激酶中的一類，同時也是mTOR信號通路中下游的重要靶點之一，當(dāng)活化的mTOR與其相關(guān)蛋白結(jié)合后，進一步促進下游的p70S6K磷酸化后活化，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成增加，細胞有絲分裂隨之增加[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮頸鱗癌患者組織中p70S6K的表達顯著高于正常人，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切關(guān)相關(guān)，提示p70S6K是子宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要調(diào)節(jié)分子，且可能參與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移過程。此外，本研究結(jié)果還顯示mTOR與PI3K、mTOR與p70S6K的表達均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，提示三者間在子宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了一定的協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)了腫瘤細胞的增殖與分化，但是對于三者間協(xié)同作用的具體機制尚不清楚[13]。

綜上所述，mTOR、PI3K以及p70S6K在子宮頸鱗癌患者中的表達均顯著高于正常人，同時mTOR與PI3K、mTOR與p70S6K的表達均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，有望成為未來靶向治療的新方向。