劉振平，聶青玉，龐鈳靖，張艷，姜容

1(重慶安全技術(shù)職業(yè)學(xué)院，重慶，404020) 2(重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶，404155)

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)。由于具有較高的營(yíng)養(yǎng)、保健和藥用價(jià)值，蜂蜜在經(jīng)濟(jì)文化社會(huì)快速發(fā)展的今天越來(lái)越受到人們的青睞。蜂蜜主要成分包括水分、葡萄糖、果糖，還含有少量的蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、類胡蘿卜素、維生素、礦物質(zhì)、芳香物質(zhì)等[1]，其中含有的黃酮類化合物、維生素C、過(guò)氧化氫酶等成分具有廣泛的生物學(xué)活性[2-5]。由于蜜蜂品種、植物來(lái)源、地理位置、氣候條件、成熟程度以及加工和貯藏條件的差異，蜂蜜可能表現(xiàn)出不同的稠度、顏色、風(fēng)味和香氣[6-7]。蜂蜜可由單一花種花蜜釀造而來(lái)，也可由多花種的混合花蜜釀造而來(lái)[8]，植物來(lái)源不同的蜂蜜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能也有差別[9]。由于具有特定的香味和口感，單花蜂蜜尤其受到消費(fèi)者的青睞[10]，但由于利益驅(qū)使，不法分子以劣質(zhì)蜂蜜冒充優(yōu)質(zhì)花種蜂蜜、將劣質(zhì)蜂蜜混入優(yōu)質(zhì)花種蜂蜜中或在蜂蜜中摻雜、摻假后高價(jià)出售，以次充好，擾亂蜂蜜市場(chǎng)損害消費(fèi)者利益[11]。因此，從蜂蜜的植物來(lái)源角度評(píng)價(jià)蜂蜜的質(zhì)量、鑒別蜂蜜的真實(shí)性具有重要意義。

近年來(lái)，多種方法被用于蜂蜜植物來(lái)源鑒別，包括不同花源蜂蜜蛋白質(zhì)組分差異[12]、高效液相色譜法[13-15]、頂空固相微萃取-質(zhì)譜聯(lián)用法[16-17]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[1]、超高壓液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜法[18]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和紅外光譜技術(shù)法等[19-20]。單花種蜂蜜芳香揮發(fā)性成分具有高度的特異性[21]，這是對(duì)其進(jìn)行風(fēng)味分析的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，通過(guò)芳香揮發(fā)性物質(zhì)的定性分析對(duì)于鑒別不同植物來(lái)源蜂蜜具有可行性。

氣相離子遷移譜(gas chromatography-Ion mobility spectrometry, GC-IMS)融合了氣相色譜和離子遷移譜二者的優(yōu)勢(shì)，具有分離性能好、響應(yīng)速度快、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，其工作原理如圖1所示。樣品隨載氣進(jìn)入儀器，按照紅色虛線方向，首先經(jīng)過(guò)氣相色譜柱的初次分離，隨后進(jìn)入離子遷移管，待測(cè)分子在電離區(qū)電離后，在電場(chǎng)和逆向漂移氣的作用下遷移實(shí)現(xiàn)2次分離，到達(dá)法拉第盤進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需任何特殊的樣品前處理即可快速檢測(cè)樣品中的痕量揮發(fā)性有機(jī)化合物?；趽]發(fā)性有機(jī)化合物的痕量檢測(cè)，GC-IMS已在疾病檢測(cè)、環(huán)境保護(hù)和食品安全及風(fēng)味分析等領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注和應(yīng)用[22-27]。

圖1 GC-IMS原理示意圖

重慶三峽庫(kù)區(qū)獨(dú)特的自然地理?xiàng)l件、良好的生態(tài)環(huán)境和豐富的植物資源利于中華蜜蜂(中蜂)的生存繁衍，飼養(yǎng)中蜂是當(dāng)?shù)厣絽^(qū)農(nóng)民延續(xù)千年的傳統(tǒng)?；诙鄻拥拿墼粗参锖透采w全年的采蜜花期，重慶三峽庫(kù)區(qū)也被稱為“三峽蜜庫(kù)”。近年來(lái)，重慶三峽庫(kù)區(qū)中蜂產(chǎn)業(yè)在脫貧攻堅(jiān)領(lǐng)域做出了重要貢獻(xiàn)，隨著規(guī)模的不斷擴(kuò)大，中蜂蜜的質(zhì)量控制成為亟待解決的問(wèn)題。不同植物來(lái)源的蜂蜜風(fēng)味、口感、功效和價(jià)格均有差異，為防止以假亂真、以次充好，本研究采用GC-IMS技術(shù)對(duì)重慶三峽庫(kù)區(qū)特色油菜花、柑橘花、五倍子花和枇杷花中蜂蜜的揮發(fā)性有機(jī)化合物進(jìn)行測(cè)定，并結(jié)合主成分分析(principal component analysis, PCA)和線性判別(linear discriminante analysis, LDA)方法建立不同植物來(lái)源中蜂蜜的判別模型，為重慶長(zhǎng)江三峽庫(kù)區(qū)特色中蜂蜜質(zhì)量控制提供新策略，助推蜜蜂產(chǎn)業(yè)在為全面脫貧建成小康社會(huì)做出重要貢獻(xiàn)的基礎(chǔ)上繼續(xù)為促進(jìn)實(shí)施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油菜花中蜂蜜樣品14個(gè)、五倍子花中蜂蜜樣品9個(gè)、枇杷花中蜂蜜樣品13個(gè)、柑橘花中蜂蜜樣品11個(gè)、多花種6個(gè)、洋槐花5個(gè)、苕子花6個(gè)，以上樣品采自重慶市萬(wàn)州區(qū)七和中蜂養(yǎng)殖合作社、重慶市萬(wàn)州區(qū)馬槽寨農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社、重慶蜂谷美地生態(tài)養(yǎng)蜂有限公司及養(yǎng)蜂個(gè)體戶，均能確保樣品真實(shí)性。

1.2 儀器與設(shè)備

FlavourSpec 1H1-00053型GC-IMS，德國(guó)G.A.S 公司；CTC-PAL 自動(dòng)進(jìn)樣裝置，瑞士CTC Analytics AG公司；FS-SE-54-CB-1,15 m,ID，0.53 mm毛細(xì)管柱，美國(guó)Restek公司。

1.3 GC-IMS 檢測(cè)條件

頂空進(jìn)樣條件：取2 g樣品，置于20 mL頂空瓶中，60 ℃孵育15 min后進(jìn)樣400 μL，進(jìn)樣針溫度65 ℃， 載氣為高純N2(純度≥99.999%)；氣相色譜條件：色譜柱：FS-SE-54-CB-1，15 m，ID：0.53 mm；色譜柱溫：60 ℃；運(yùn)行時(shí)間：20 min；載氣為高純N2，載氣流速為起始2 mL/min，2～20 min 線性上升至100 mL/min； 離子遷移譜條件：離子源為Tritium(6.5 keV)， 正離子模式，漂移管長(zhǎng)度為9.8 cm，漂移氣流速為150 mL/min；漂移管溫度為45 ℃；平均次數(shù)為12；電場(chǎng)強(qiáng)度：350 V/cm，網(wǎng)格脈沖寬度為100 μs， 觸發(fā)延遲時(shí)間為100 ms，采樣頻率為150 kHz，重復(fù)率為30 ms。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用GC-IMS Library Search V2.2.1 分析軟件(G.A.S Inc.)對(duì)樣品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析。采用SIMCA-13.0對(duì)所測(cè)多維數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析處理，通過(guò)SPSS進(jìn)行LDA并建立判別模型。GC-IMS 三維譜中每一個(gè)特征峰代表一種揮發(fā)性有機(jī)成分，以不同樣品中特征峰的有無(wú)或強(qiáng)弱為依據(jù)，使用LAV 軟件選擇標(biāo)記，并以該特征區(qū)域離子強(qiáng)度的最大值作為特征變量，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-IMS譜圖分析

從GC-IMS譜圖中可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣品所含的揮發(fā)性物質(zhì)組成進(jìn)行直觀比較和初步判斷，尤其在圖譜二維俯視圖中，不同樣品中的揮發(fā)性成分種類及濃度差異清晰可見(jiàn)，當(dāng)以油菜花中蜂蜜樣品(圖2-a)為參照進(jìn)行差異對(duì)比時(shí)，其他3組樣品中對(duì)應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)的濃度高低一目了然，紅色越深，說(shuō)明對(duì)應(yīng)成分濃度比油菜花中蜂蜜樣品中濃度高的越多；藍(lán)色越深則低的越多。

由于原始圖譜對(duì)應(yīng)的矩陣數(shù)量較大(3 073×4 500)， 為便于數(shù)據(jù)運(yùn)算和增強(qiáng)可視化效果，在保留有效信息的基礎(chǔ)上，截取保留時(shí)間和遷移時(shí)間分別在73.710～620.100 s和7.799～15.385 ms內(nèi)的矩陣數(shù)據(jù)(1 400×1 000)用于分析。從油菜花中蜂蜜、五倍子花中蜂蜜、枇杷花中蜂蜜及柑橘花中蜂蜜樣品的圖譜中各選1個(gè)，如圖2所示，從左到右樣品依次為油菜花中蜂蜜、五倍子花中蜂蜜、枇杷花中蜂蜜和柑橘花中蜂蜜的GC-IMS三維彩色譜圖，通過(guò)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)油菜花中蜂蜜和五倍子花中蜂蜜中的揮發(fā)性有機(jī)成分種類明顯多于其他2種蜂蜜，枇杷花中蜂蜜最少。

a-油菜花中蜂蜜; b-五倍子花中蜂蜜; c-枇杷花中蜂蜜; d-柑橘花中蜂蜜

依據(jù)差譜原則每種蜂蜜均選取同樣的58個(gè)揮發(fā)性有機(jī)成分對(duì)應(yīng)的特征峰進(jìn)行排序?qū)Ρ萚28-29]，每種蜂蜜各取3個(gè)樣品以示意，如圖3所示，橫軸為標(biāo)記的特征成分對(duì)應(yīng)的特征點(diǎn)，縱軸為樣品編號(hào)。從圖中可以看出，同一花種蜂蜜的不同樣品因含有共有的揮發(fā)性有機(jī)成分在特征峰對(duì)比圖庫(kù)中表現(xiàn)出明顯的相似性，不同花種蜂蜜則存在明顯的差異。油菜花中蜂蜜在編號(hào)為1～12的特征成分濃度明顯高于其他3種花種蜂蜜，編號(hào)為35～42的特征成分主要存在于五倍子花蜂蜜中，枇杷花中蜂蜜含量較高的成分編號(hào)為46、48～51，編號(hào)為52～55、57、58的特征成分更多地存在于柑橘花中蜂蜜中；另外，編號(hào)為13～20的特征成分同時(shí)存在于油菜花中蜂蜜和五倍子花中蜂蜜中，柑橘花中蜂蜜中編號(hào)21、22、24、26、27、29、34、47的特征成分明顯低于其他3種花種蜂蜜，編號(hào)43～45 的成分是五倍子花中蜂蜜和枇杷花中蜂蜜區(qū)別另外2種蜂蜜的特征成分。對(duì)標(biāo)記的特征峰通過(guò)GC-IMS Library Search軟件檢索，部分對(duì)應(yīng)的揮發(fā)性成分化學(xué)信息如表1所示。

表1 部分特征峰對(duì)應(yīng)的揮發(fā)性成分名稱

圖3 不同花種蜂蜜的揮發(fā)性有機(jī)成分對(duì)應(yīng)的特征峰對(duì)比庫(kù)

2.2 PCA

PCA是一種有效的多維數(shù)據(jù)降維分析方法，利用PCA可將原始特征變量線性變換為低維新特征變量，保留了原有特征的主要信息，有利于數(shù)據(jù)的直觀分析[30]。本研究中特征變量為所選取的58種揮發(fā)性成分表現(xiàn)出的特征峰強(qiáng)度，與47個(gè)樣品組成47×58的矩陣，運(yùn)用SIMCA-13.0對(duì)其進(jìn)行主成分分析，前3個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為81.35%。如圖4-a所示為PCA分析的二維得分圖，4個(gè)不同植物來(lái)源的中蜂蜜分別處于不同的區(qū)域，無(wú)重疊，說(shuō)明不同花種中蜂蜜的特征揮發(fā)性成分非常明顯，以此為依據(jù)能夠較好地將4種中蜂蜜分開(kāi)。

載荷圖反映的是所選取的58個(gè)特征性揮發(fā)性成分與不同蜂蜜樣品在得分圖中位置的對(duì)應(yīng)情況，位置越近表明該種特征成分在相應(yīng)蜂蜜中的含量越高，相反，位置越遠(yuǎn)含量越低。結(jié)合PCA得分圖中4種中蜂蜜的象限位置從載荷圖(圖4-b)可以看出，油菜花中蜂蜜和五倍子花中蜂蜜特征性揮發(fā)成分相對(duì)較多，而枇杷花中蜂蜜和柑橘花中蜂蜜相對(duì)較少，比如編號(hào)為52～55、57和58的揮發(fā)性成分屬于柑橘花中蜂蜜的特征成分，編號(hào)為46、48～51的揮發(fā)性成分屬于枇杷花中蜂蜜的特征成分；另外，從圖4中還可以看出，在油菜花中蜂蜜和五倍子花中蜂蜜交叉位置分布有較多揮發(fā)性成分，表明這些成分是2種蜂蜜區(qū)別于枇杷花中蜂蜜和柑橘花中蜂蜜的共有特征成分。此分析結(jié)果與圖3中表示的各蜂蜜的特征成分一致。

a-主成分得分圖;b-載荷圖

2.3 不同植物來(lái)源蜂蜜的判別

將原始數(shù)據(jù)經(jīng)PCA后的前3個(gè)主成分進(jìn)行LDA分析，進(jìn)一步研究區(qū)分預(yù)測(cè)重慶三峽庫(kù)區(qū)4種不同植物來(lái)源中蜂蜜的可能性，建立對(duì)應(yīng)植物來(lái)源中蜂蜜的判別模型。以前3個(gè)主成分為坐標(biāo)軸對(duì)經(jīng)過(guò)PCA降維后的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性分析，函數(shù)系數(shù)選用Fisher′s，由于樣品數(shù)量較少，本研究通過(guò)“留一分類”的方式進(jìn)行判別驗(yàn)證，這種方式是每次只使用一個(gè)樣品數(shù)據(jù)作為測(cè)試集，剩下的全部作為訓(xùn)練集，所有的樣品數(shù)據(jù)均作為測(cè)試集判別1次，例如油菜花中蜂蜜共14個(gè)樣品，分別將每個(gè)樣品作為測(cè)試集，其余13個(gè)作為訓(xùn)練集，共驗(yàn)證14次，其他種類蜂蜜樣品同樣判別驗(yàn)證。判別分類結(jié)果如表2所示，4種不同花種中蜂蜜鑒別正確率為100%，由此可見(jiàn)前3個(gè)主成分能夠代表大部分蜂蜜的種類信息，采用LDA建模分析方法可以較好地將重慶三峽庫(kù)區(qū)油菜花中蜂蜜、五倍子花中蜂蜜、枇杷花中蜂蜜和柑橘花中蜂蜜分類。

表2 LDA判別驗(yàn)證結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證LDA建模判別的準(zhǔn)確性，收集來(lái)自重慶三峽庫(kù)區(qū)的17個(gè)其他植物來(lái)源中蜂蜜樣品用于模型判別，其中包括多花種6個(gè)、洋槐花5個(gè)、苕子花6個(gè)。驗(yàn)證結(jié)果如表3所示，誤判率僅為5.9%，其中多花種蜂蜜有一個(gè)樣品判別錯(cuò)誤。通過(guò)溯源得知，此多花種蜂蜜被誤判的樣品取蜜時(shí)間為4月中旬，此時(shí)油菜花期剛過(guò)去不久，蜂蜜中存在較大比例的油菜花中蜂蜜。

表3 其他植物來(lái)源中蜂蜜判別結(jié)果

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用氣相離子遷移譜技術(shù)對(duì)重慶三峽庫(kù)區(qū)4種不同植物來(lái)源的特色中蜂蜂蜜(油菜花中蜂蜜、五倍子花中蜂蜜、枇杷花中蜂蜜和柑橘花中蜂蜜)進(jìn)行測(cè)定和分析，依據(jù)58種不同植物來(lái)源中蜂蜜揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)的GC-IMS圖譜，對(duì)不同蜜源蜂蜜進(jìn)行鑒別和分類。運(yùn)用PCA和LDA方法建立了重慶三峽庫(kù)區(qū)4種不同植物來(lái)源中蜂蜜的判別模型。結(jié)果表明，本研究建立的判別模型對(duì)重慶三峽庫(kù)區(qū)4種特色中蜂蜜的準(zhǔn)確判別率為100%，對(duì)其他植物來(lái)源的17種中蜂蜜的誤判率僅為5.9%。建立不同植物來(lái)源蜂蜜的判別方法對(duì)于蜂蜜質(zhì)量控制具有重要意義，本研究表明運(yùn)用GC-IMS技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的LDA方法建模判別方法是可行的，與傳統(tǒng)方法相比不需要復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，操作簡(jiǎn)單，成本低，為中蜂蜜品種鑒別和質(zhì)量控制提供了新的技術(shù)參考。