趙波,應(yīng)曉國,張美超,3,龔晨輝,徐坤俐,王遠(yuǎn)會,楊澤鵬,萬海倫,陳廣川,吳韜,唐勇*
1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,四川 成都,610039) 2(浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江 舟山,316022)3(茂縣科學(xué)技術(shù)和農(nóng)業(yè)畜牧局,四川 阿壩州,623200) 4(成都奕陽現(xiàn)代食品安全技術(shù)研究中心,四川 成都,610000)
刺身魚是可作生食的一類魚,包括了不同的漁業(yè)種類,刺身又稱生魚片,具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值,是一道廣受世界各地消費(fèi)者青睞的菜肴[1]。魚類生物體含水量高,整個(gè)體系中的水分占總質(zhì)量的65%~80%,且肌纖維細(xì),極易腐敗變質(zhì)。因此,活魚捕撈后通常通過低溫來保持原有的色澤和新鮮度。經(jīng)過凍結(jié)后,雖然抑制了魚體內(nèi)的微生物生長,減弱了酶活性[2],但在冷凍過程中魚體內(nèi)的水轉(zhuǎn)化為冰晶,會對魚體組織細(xì)胞產(chǎn)生一定的破壞性[3],導(dǎo)致其水分受到影響,顏色、風(fēng)味和質(zhì)地等也隨之發(fā)生變化[4-5],致使刺身魚品質(zhì)明顯下降,但不同貯運(yùn)過程對刺身魚品質(zhì)影響的程度有所不同。目前行業(yè)中仍存在將捕撈上岸的刺身魚置于不同溫度條件進(jìn)行貯運(yùn)的現(xiàn)實(shí)情況,因此研究刺身魚在不同貯運(yùn)期間的水分遷移以及分布等變化對其品質(zhì)保鮮和經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有積極意義。
傳統(tǒng)的水分含量檢測方法無法做到對水分狀態(tài)、分布及遷移等的測量,不能確切直觀地反映體系中的水分結(jié)合特征[6]。SNCHEZ-ALONSO等[7]和MCDONNELL等[8]利用低場核磁共振技術(shù)(low-field nuclear magnetic resonance, LF-NMR)分別對冷凍鱈魚和鹽腌豬肉進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)橫向弛豫時(shí)間(T2)對不同的冷凍條件和鹽腌濃度敏感,在這2種過程中均存在水分遷移的現(xiàn)象。近年來,由于其具有快速無損、操作簡便、直觀明了、穩(wěn)定性高[9]等優(yōu)點(diǎn),越來越多的研究者運(yùn)用LF-NMR和核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)進(jìn)行食品中的水分分析。T2主要提供水在食物基質(zhì)中的結(jié)合性質(zhì),以此反映食物中不同狀態(tài)的水分群如結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水。而MRI則顯示水的空間分布及變化,二者是研究水在各種食品中的狀態(tài)、流動(dòng)性和分布的有力工具,可以為水的遷移提供直接信息[10-11]。
目前,已有許多學(xué)者對貯藏過程中的果蔬等食品的水分進(jìn)行了探究。如馮愛博等[12]和羅潔瑩等[13]分別對貯藏過程中的雷竹筍和鷹嘴蜜桃進(jìn)行了系統(tǒng)的水分研究。但對魚類的水分研究大都集中在加工過程當(dāng)中[14-16]。為豐富魚類在貯運(yùn)過程中的水分研究,本研究結(jié)合實(shí)際情況將刺身魚置于3種不同溫度條件下進(jìn)行貯藏,以模擬不同的貯運(yùn)過程中刺身魚內(nèi)水分隨貯藏時(shí)間變化的影響,為其貯運(yùn)過程的品質(zhì)研究提供支撐和參考。
刺身魚選用虹鱒(Oncorhynchusmykiss),由四川省雅安市天全縣潤兆漁業(yè)提供,每條魚的質(zhì)量為3.5~4.5 kg; 蘇木素染液、伊紅染液,珠海貝索生物技術(shù)有限公司;40%(體積分?jǐn)?shù))甲醛、無水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、無水乙醇、二甲苯、鹽酸,均為分析純,成都市科隆化學(xué)有限公司。
溫度標(biāo)簽,成都奕陽現(xiàn)代食品安全技術(shù)研究中心;ULTS 1368型超低溫冰箱,賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司;BCD-568 WDPF型冰箱,海爾集團(tuán);MesoMR23-040V-1型低場核磁共振儀,蘇州紐邁析儀器股份有限公司;RM 2016型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī),德國徠卡;JT-12S型自動(dòng)組織脫水機(jī),武漢俊杰電子有限公司;BMJ-A型包埋機(jī),常州郊區(qū)中威電子儀器廠;RS 36 型全自動(dòng)染色機(jī),常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司;PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀,常州市中威電子儀器有限公司;Pannoramic 250型數(shù)字切片掃描儀,濟(jì)南丹吉爾電子有限公司。
1.3.1 刺身魚前處理
將新鮮購回的刺身魚處死,去頭去尾、去骨去皮、去內(nèi)臟,用蒸餾水將其血污清洗干凈,分割成8 cm×4 cm×4 cm的魚塊,用保鮮膜包裹后隨機(jī)分成3組進(jìn)行貯藏。(1)低溫處理組:將魚塊置于-18 ℃條件下長期貯藏;(2)超低溫處理組:將魚塊置于-78 ℃條件下長期貯藏;(3)轉(zhuǎn)組:在-78 ℃條件下使魚塊中心溫度快速從室溫下降至-18 ℃,再迅速轉(zhuǎn)移到-18 ℃長期貯藏。
1.3.2 凍結(jié)曲線測定
取9個(gè)溫度標(biāo)簽,設(shè)置其采集時(shí)間間隔為300 s,采集次數(shù)為80次,將其啟動(dòng)后分別放至9個(gè)新鮮魚塊的中心部位,用保鮮膜包裹后隨機(jī)分為3組進(jìn)行相應(yīng)的處理,以對不同溫度貯藏條件下的刺身魚塊進(jìn)行凍結(jié)溫度的監(jiān)測,每組3個(gè)平行。待采集時(shí)間終止后取出魚塊中的標(biāo)簽讀取數(shù)據(jù)并做記錄,繪制不同處理?xiàng)l件下的凍結(jié)曲線。
1.3.3 低場核磁水分測定及1H成像分析
將刺身魚塊取出,于4 ℃解凍24 h后修整成大小為2 cm×2 cm×2 cm的方塊,用濾紙吸去魚塊表面的水分,裝入核磁管中,分別對3種不同溫度貯藏條件下貯藏了0、4、8、12、16、20、24周的刺身魚水分進(jìn)行測定,每組3個(gè)平行。在正式對樣品進(jìn)行測試之前,需要用標(biāo)準(zhǔn)油樣在Q-FID序列下對儀器和系統(tǒng)進(jìn)行校正。校正完成后,反復(fù)試驗(yàn)直到找到樣品的最佳脈沖重復(fù)序列時(shí)間,最后在Q-CPMG序列下對樣品進(jìn)行水分測定。參數(shù)設(shè)置為:工作溫度32 ℃,質(zhì)子共振頻率20 MHz,采樣點(diǎn)數(shù)240 154,脈沖重復(fù)序列時(shí)間3 500 ms,采樣頻率200 kHz,累加次數(shù)2,回波時(shí)間0.2 ms。將測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行反演,得到各水分群對應(yīng)的弛豫時(shí)間及峰積分面積。
水分測定完成之后利用核磁共振成像系統(tǒng)對樣品進(jìn)行成像處理。在成像之前,需用標(biāo)準(zhǔn)油樣對儀器和成像系統(tǒng)進(jìn)行校正,成像后用儀器自帶的圖像處理軟件對圖片進(jìn)行統(tǒng)一映射和偽彩處理。參數(shù)設(shè)置為:以俯視圖為成像方位,重復(fù)時(shí)間500 ms,回波時(shí)間20 ms。
1.3.4 HE染色分析
配制10%(體積分?jǐn)?shù))中性甲醛固定液,將在3種 不同溫度貯藏條件下貯藏了24周的刺身魚樣品分別取出后快速修整為2 cm×2 cm×2 cm的方塊,并迅速放入配好的固定液中持續(xù)固定48~72 h。將固定好的樣品取出依次進(jìn)行脫水、包埋、切片等操作,最終制得切片樣品。而后將其脫蠟,使用蘇木精染色后沖洗,再用鹽酸酒精分化,再次沖洗后放入50 ℃的溫水中或弱堿性水溶液返藍(lán),直到出現(xiàn)藍(lán)色為止。取出用自來水沖洗后放入85%的酒精,再用伊紅對其染色,水洗后用梯度酒精進(jìn)行脫水,經(jīng)二甲苯透明后利用中性樹膠封固。最后用數(shù)字切片掃描儀對切片進(jìn)行圖像采集,選擇要觀察的區(qū)域放大(×100),觀察刺身魚的肌纖維狀態(tài)及冰晶形成情況。
所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 26.0做方差分析及差異顯著性分析,作圖利用Origin Pro 9.0進(jìn)行繪制。
利用溫度標(biāo)簽獲得了3種不同溫度貯藏條件下的刺身魚樣品中心溫度隨凍結(jié)時(shí)間的變化曲線,其凍結(jié)點(diǎn)在-1.8 ℃左右,這與魚肉的凍結(jié)點(diǎn)在-2.0~-0.6 ℃相符合[17]。如圖1所示,刺身魚降溫過程可大致分為3個(gè)階段。在第一階段,3種不同溫度貯藏條件下的刺身魚中心溫度從初溫快速降低至-1.8 ℃, 這是因?yàn)榇藭r(shí)刺身魚放出的熱量是顯熱,這部分熱量與全部放出的熱量相比,其值較小,所以降溫速度快,曲線較陡[18];在第二階段,3組刺身魚樣品中心溫度從凍結(jié)點(diǎn)降低至-5 ℃過程中降溫速率緩慢,并且都在-1.8 ℃持續(xù)了一段時(shí)間,在圖中表現(xiàn)為重疊。其中-18 ℃低溫處理組的持續(xù)時(shí)間最長,達(dá)到了64 min,而該組通過第二階段的時(shí)間長達(dá)152 min。 這是因?yàn)榇藭r(shí)為冰結(jié)晶最大生成帶,刺身魚中的大部分水結(jié)成冰晶,放出大量的潛熱,而在整個(gè)凍結(jié)過程中,刺身魚的絕大部分熱量都在此階段放出,因此刺身魚在該階段的降溫速率慢,凍結(jié)曲線平坦;在第三階段,經(jīng)過潛熱釋放帶之后,3組刺身魚中心溫度從-5 ℃繼續(xù)下降至終溫,其降溫速率開始上升,凍結(jié)曲線斜率增大。此時(shí)放出的熱量一部分是由于已結(jié)晶的部分繼續(xù)降溫至凍結(jié)終溫,另一部分是由于剩余少量的水繼續(xù)結(jié)晶[19],所以此時(shí)的曲線不如第一階段陡峭。
圖1 不同貯藏條件下刺身魚的凍結(jié)曲線
食品中心溫度通過冰結(jié)晶最大生成帶的熱交換對食品凍結(jié)速度的影響很大,而凍結(jié)速度不僅關(guān)系到食品中冰晶的大小,更是關(guān)系到食品中的水分遷移[20]。比較3種不同貯藏條件下刺身魚中心溫度通過冰結(jié)晶最大生成帶的時(shí)間發(fā)現(xiàn),超低溫處理組和轉(zhuǎn)組用時(shí)29 min,與低溫處理組(152 min)相比明顯耗時(shí)較短;對于3組刺身魚中心溫度從初溫降至終溫的整個(gè)凍結(jié)過程中,超低溫處理組(終溫為-78 ℃)耗時(shí)385 min,低溫處理組(終溫為-18 ℃)耗時(shí)400 min, 而轉(zhuǎn)組(終溫為-18 ℃)僅耗時(shí)86 min。由此可見,貯藏溫度越低,刺身魚中心溫度降溫速率越快,且其經(jīng)過冰結(jié)晶最大生成帶的時(shí)間越短,越有利于刺身魚快速凍結(jié)。
2.2.1 不同溫度貯藏條件下刺身魚的低場核磁共振圖譜
LF-NMR可用于評價(jià)水分在食品中的呈現(xiàn)狀態(tài),圖2對刺身魚弛豫時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行多指數(shù)擬合,得到不同溫度貯藏條件下刺身魚弛豫時(shí)間隨貯藏時(shí)間變化的低場核磁共振圖譜。如圖2所示,在3種不同溫度貯藏條件下,刺身魚樣品在0~10 000 ms之間均呈現(xiàn)出3~4個(gè)峰,弛豫時(shí)間T2越短,說明水分的自由度越低[21]。其中,弛豫時(shí)間最短的水分群T2b(0~10 ms)被認(rèn)為是與大分子緊密結(jié)合且不受外界條件影響的結(jié)合水;弛豫時(shí)間最長的水分群T22和T23(100~10 000 ms) 是主要依靠毛細(xì)管凝結(jié)作用存在于肌纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)外的自由水[22];而弛豫時(shí)間介于兩者之間的水分群T21(10~100 ms)是被困在蛋白密集的肌纖維網(wǎng)絡(luò)中的不易流動(dòng)水[23]。因此可以看出,不同溫度貯藏條件下的刺身魚在貯藏期間均存在著3種不同狀態(tài)的水分群,且其中的不易流動(dòng)水為刺身魚的主要水分群。
不同的橫向弛豫時(shí)間對應(yīng)的峰面積表示不同狀態(tài)水分的相對含量,如圖2所示,各水分群的峰面積隨著貯藏時(shí)間的延長而變化,表明3種不同溫度貯藏條件下的刺身魚均存在著不同程度的遷移情況。且隨著貯藏時(shí)間的延長,各水分群對應(yīng)的弛豫時(shí)間均呈現(xiàn)出右移趨勢,這與ZHANG等[24]和LI等[25]分別對豬最長肌和速凍豬肉肉餅在凍藏期間的水分研究結(jié)論一致。但在圖2-c中,超低溫處理組的弛豫時(shí)間右移程度與低溫處理組和轉(zhuǎn)組相比較小,這說明貯藏溫度越低,對刺身魚水分自由度的影響越小[21]。由圖2可知,3種不同溫度貯藏條件下的刺身魚在貯藏后期都出現(xiàn)了自由度更高的一組水分群T23,這可能是由于貯藏過程中形成的冰晶和再結(jié)晶對刺身魚細(xì)胞造成了機(jī)械損傷,同時(shí)在凍結(jié)過程中離開細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞外間隙的水無法返回細(xì)胞內(nèi)間隙[26],最終導(dǎo)致刺身魚內(nèi)自由水增加,水分自由度增大。
a-低溫處理組; b-轉(zhuǎn)組;c-超低溫處理組
2.2.2 不同溫度貯藏條件下刺身魚的水分含量
圖3和圖4分別表示了不同溫度貯藏條件下的刺身魚在貯藏期間水分總峰面積的變化情況和其內(nèi)部各水分群的相對含量變化情況。如圖3所示,貯藏溫度越低,刺身魚中水分總峰面積越小,但在貯藏過程中,同一貯藏時(shí)間下轉(zhuǎn)組和超低溫處理組的水分總峰面積差別不顯著(P>0.05)。3種不同溫度貯藏條件下的刺身魚在其貯藏期間的水分總峰面積均呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(P<0.05),這是因?yàn)椴灰琢鲃?dòng)水是其中主要的水分群,受不易流動(dòng)水的含量影響最大,因此呈現(xiàn)出與圖7中相同的下降趨勢。而在圖4中,0~24周的貯藏期內(nèi),3種貯藏條件下的刺身魚內(nèi)結(jié)合水相對含量的波動(dòng)較為平緩,且變化幅度較小,均在4.3%~5.0%左右,這是因?yàn)榻Y(jié)合水是與大分子緊密結(jié)合的水分群,受溫度等外界條件的影響極小。低溫處理組、超低溫處理組和轉(zhuǎn)組的刺身魚在貯藏過程中的不易流動(dòng)水相對含量均隨著時(shí)間的延長顯著減少(P<0.05),分別從91.63%、93.73%、92.36%下降至61.18%、81.34%、72.40%,而自由水隨時(shí)間延長顯著增加(P<0.05),分別由3.45%、 1.74%、3.12%增加至34.36%、14.28%、 23.23%。但在貯藏前期,不同貯藏條件下的刺身魚內(nèi)不易流動(dòng)水和自由水變化均不顯著(P>0.05)。這表明不同溫度貯藏條件下刺身魚內(nèi)均存在不易流動(dòng)水向自由水遷移的現(xiàn)象,但這種水分遷移的程度受溫度影響較大,貯藏溫度越低,刺身魚內(nèi)水分遷移的量越少。
圖3 不同貯藏條件下刺身魚水分總峰面積隨貯藏時(shí)間的變化
a-結(jié)合水相對含量;b-不易流動(dòng)水相對含量;c-自由水相對含量
2.2.3 不同溫度貯藏條件下刺身魚的MRI成像
作為一種無損的食品基質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)可視化技術(shù),MRI已廣泛應(yīng)用于食品水分分布的研究[27]。為了更直觀地了解刺身魚在貯運(yùn)過程中內(nèi)部水分的變化信息,對不同溫度貯藏條件下的刺身魚進(jìn)行了MRI成像分析。圖像經(jīng)過偽彩處理后如圖5所示,圖中越亮(越趨近于黃色)的區(qū)域表示1H密度信號越強(qiáng),該區(qū)域的水分越多;反之(越趨近于藍(lán)色),則1H密度信號越弱,該區(qū)域的水分越少。隨著貯藏時(shí)間的延長,3種 不同溫度貯藏條件下的刺身魚MRI圖的亮度均呈現(xiàn)出由高到低的衰減趨勢,這與其水分總峰面積的變化相符。在貯藏中期,1H密度信號從內(nèi)部區(qū)域到外部區(qū)域呈不斷增強(qiáng)的趨勢,這表明水從肌纖維內(nèi)逐漸排出,遷移到肌纖維間隙[28]。到貯藏后期,刺身魚中的水分重新恢復(fù)均勻分布,但樣品邊緣信號較弱,外部輪廓較為模糊。這可能是因?yàn)橘A藏達(dá)到后期,刺身魚肌纖維組織損壞嚴(yán)重,導(dǎo)致體系對水分子的束縛能力下降,使得水分逐漸恢復(fù)均勻分布[29]。從不同溫度的貯藏條件來看,低溫處理組的偽彩圖像亮度減弱最明顯,說明刺身魚在此條件下的水分流失最嚴(yán)重。
圖5 不同貯藏條件下刺身魚的MRI成像
為了觀察刺身魚的肌纖維狀態(tài)以及冰晶的形成狀況,通過HE染色的方式對其進(jìn)行了處理。圖6展示了在不同溫度貯藏條件下貯藏了24周的刺身魚肌纖維組織狀態(tài)、冰晶大小及分布情況。圖中紅色片狀區(qū)域?yàn)榇躺眙~正常肌纖維組織,淺紅色點(diǎn)狀區(qū)域?yàn)閾p壞的肌纖維組織,而白色空洞區(qū)域則為冰晶。由圖6可知,刺身魚肌纖維分布均勻。其中,低溫處理組的刺身魚內(nèi)肌纖維壞死溶解最多,在一個(gè)視野內(nèi)的冰晶最少且體積最大;轉(zhuǎn)組的刺身魚內(nèi)肌纖維壞死溶解較少,形成的冰晶較低溫處理組多且?。怀蜏靥幚斫M的刺身魚內(nèi)肌纖維保持最好,形成的冰晶最多且體積最小。冰晶的形成會對刺身魚肌肉組織造成損害,且這種損害是不可逆的,冰晶越大,刺身魚肌肉組織受到的損傷越大[30-31],同時(shí)這也是水分從肌纖維內(nèi)的不易流動(dòng)水向肌纖維外的自由水遷移的重要原因。因此,低溫處理組的刺身魚肌纖維壞死溶解最多,導(dǎo)致該組刺身魚體系內(nèi)的持水能力最差,水分損失最為嚴(yán)重。而超低溫處理組因其經(jīng)過冰結(jié)晶最大生成帶的時(shí)間最短,凍結(jié)速度最快,組織細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外轉(zhuǎn)移的水分少,能使那些尚處于原來狀態(tài)的汁液迅速形成量多而細(xì)小的冰晶,對組織造成的損傷小,所以該組的肌纖維能較完整地保持。HE染色的微觀觀察結(jié)果為冰晶對肌纖維造成的機(jī)械損傷提供了直接證據(jù),并且支撐和驗(yàn)證了LF-NMR以及MRI對刺身魚水分研究的結(jié)果。
a-低溫處理組; b-轉(zhuǎn)組; c-超低溫處理組
通過LF-NMR和HE染色分析對低溫處理組、超低溫處理組、轉(zhuǎn)組3種不同溫度貯藏過程中刺身魚內(nèi)水分隨貯藏時(shí)間的變化進(jìn)行了探究。研究發(fā)現(xiàn),在3種不同溫度貯藏過程中的刺身魚內(nèi)均存在結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水3種不同狀態(tài)的水分群,其中不易流動(dòng)水為刺身魚的主要水分群;在0~24周的貯藏期內(nèi),低溫處理組、超低溫處理組和轉(zhuǎn)組中的不易流動(dòng)水和自由水相對含量隨貯藏時(shí)間變化顯著(P<0.05), 其中不易流動(dòng)水相對含量分別從91.63%、93.73%、92.36%下降至61.18%、81.34%、72.40%,自由水分別由3.45%、1.74%、3.12%增加至34.36%、14.28%、23.23%,而結(jié)合水相對含量在3種貯藏過程中均處于4.3%~5.0%,波動(dòng)幅度均較小;水分分布則由貯藏初期的均勻分布變化為由內(nèi)向外遷移,到貯藏后期又重新恢復(fù)均勻狀態(tài),且3種不同溫度貯藏條件下的刺身魚均有不同程度的水分流失。此外,超低溫處理組和轉(zhuǎn)組的刺身魚通過冰結(jié)晶最大生成帶的時(shí)間最短,均為29 min,更有利于刺身魚快速凍結(jié)。結(jié)合HE染色結(jié)果可知,在超低溫處理組中,刺身魚內(nèi)形成的冰晶尺寸最小,對肌纖維造成的機(jī)械損傷小,有利于肌纖維的完整保持和體系內(nèi)持水力的維持,水分遷移量更少。因此,一直處于超低溫條件下進(jìn)行貯運(yùn)的刺身魚在水分和肌纖維保持方面都具有良好的效果,能更好地保證其凍結(jié)品質(zhì)。