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        天麻酵素化過程中風味物質(zhì)及抗氧化活性動態(tài)變化

        2021-11-29 11:24:04趙敏王瑜李立郎安正斌解春芝林靈楊小生楊娟
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年22期

        趙敏,王瑜,李立郎,安正斌,解春芝,林靈,楊小生,楊娟*

        1(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽,550025) 2(藥用植物功效與利用國家重點實驗室(貴州醫(yī)科大學),貴州 貴陽,550014) 3(貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室,貴州 貴陽,550014) 4(徐州工程學院 食品與生物工程學院,江蘇 徐州,221018)

        天麻是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材,為蘭科天麻屬植物天麻(Gastrodiaelata)的干燥塊莖[1],主產(chǎn)于貴州、四川、云南等地。天麻中含有天麻素、巴利森苷、對羥基苯甲醇等活性成分[2],具有增強記憶、改善老年癡呆、抗衰老、鎮(zhèn)靜催眠等功效[3]。天麻的食用方式主要是將鮮天麻炮制成天麻粉,但其不利于人體吸收且天麻本身具有不良的“馬尿臭”氣味[4],難以被消費者接受。酵素是以動植物、食用菌等為原料,添加或不添加輔料,經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品[5]。大量研究表明,酵素具有抗氧化、降脂、解酒、促進消化等[6]功效。因此,通過酵素化工藝處理是天麻深加工的一種途徑。隨著對天麻的食用安全性的深入研究,2020年貴州已將天麻作為新資源食品開展了試點工作。因此,從食品的角度開發(fā)天麻具有重要的應用前景。而目前,國內(nèi)外對天麻的研究主要關注于藥理作用,對于鮮天麻酵素化過程中風味物質(zhì)和抗氧化活性的動態(tài)變化研究少有報道。

        因此,本研究以鮮天麻為研究對象,通過氨基酸自動分析儀、固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)聯(lián)用技術對天麻酵素化過程中游離氨基酸和揮發(fā)性物質(zhì)變化進行研究,同時采用試劑盒對酵素化過程中的總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、DPPH自由基清除能力與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性進行定量分析,以期初步明晰天麻酵素化過程中的風味物質(zhì)及抗氧化活性成分動態(tài)變化,為天麻的高值化利用提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        德江天麻,貴州省德江縣綠通天麻發(fā)展有限公司;發(fā)酵劑,貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室自制,優(yōu)勢菌株為酵母菌,乳酸菌,醋酸菌;纖維素酶,南寧龐博生物工程有限公司;磺基水楊酸,天津市科密歐化學試劑有限公司;SOD活性、DPPH自由基清除能力、T-AOC檢測試劑盒,北京索萊寶科技有限公司。

        1.2 儀器與設備

        HP6890/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀,美國Agilent公司;固相微萃取裝置,美國Supelco公司;S433D型全自動氨基酸分析儀,德國Sykam公司;YH-A20002型電子天平,瑞安市英衡電器有限公司;22010型攪拌機,佛山艾詩凱奇電氣有限公司。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 天麻的發(fā)酵工藝

        新鮮天麻清洗干凈后打漿,裝入發(fā)酵壇內(nèi)按照其質(zhì)量比1∶1加入沸水(溫度>90 ℃)攪拌熟化,再添加10%(質(zhì)量分數(shù))的白砂糖,攪拌使白砂糖完全溶化,待溫度降至50~60 ℃時,添加0.02%(質(zhì)量分數(shù))的纖維素酶,待溫度降至30~40 ℃時,最后添加0.03%(質(zhì)量分數(shù))的發(fā)酵劑,用保鮮膜密封發(fā)酵壇,在無氧條件下發(fā)酵10 d后,去掉保鮮膜換成紗布進行有氧發(fā)酵,發(fā)酵到第30天,用牛皮紙封口貯藏陳釀,陳釀至60 d結(jié)束發(fā)酵。

        樣品的取樣時間分別為:0 d(加發(fā)酵劑前);7 d(發(fā)酵液開始澄清);10 d(無氧發(fā)酵結(jié)束);20 d(形成菌膜);30 d(菌膜穩(wěn)定,完成發(fā)酵);60 d(貯藏陳釀階段)。每個階段取樣后,將樣品置于-80 ℃的超低溫冰箱內(nèi)保存待測。

        1.3.2 游離氨基酸含量的測定

        采用氨基酸自動分析儀進行檢測,準確稱取1.022 g 磺基水楊酸至100 mL容量瓶中并定容,配制成1%的磺基水楊酸溶液;取不同樣品1 mL分別加入9 mL磺基水楊酸溶液,振蕩均勻,10 000 r/min離心15 min,上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后上機檢測。

        1.3.3 揮發(fā)性成分的測定

        萃取方法:取樣品5 mL置于固相微萃取儀采樣瓶中,插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器,在60 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min后,移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口(溫度250 ℃)中,熱解析進樣。

        氣相色譜條件:色譜柱為Agilent HP-5MS(60 m×0.25 mm,0.25 μm)彈性石英毛細管柱,初始溫度42 ℃ (保留2 min),以3.5 ℃/min升溫至189 ℃,再以8 ℃/min升溫至310 ℃,運行時間:67.13 min;汽化室溫度250 ℃;載氣為高純He(99.999%);柱前壓111 212.43 pa,載氣流量1.0 mL/min,分流比10∶1,溶劑延遲時間1 min。

        質(zhì)譜條件:離子源為EI源;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;發(fā)射電流34.6 μA; 倍增器電壓1 671 V;接口溫度280 ℃;質(zhì)量范圍29~500 amu。對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist 17和Wiley 275標準質(zhì)譜圖,確定X種揮發(fā)性化學成分,用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對質(zhì)量分數(shù)。

        1.3.4 抗氧化活性的測定

        T-AOC、DPPH自由基清除能力、SOD活性均采用試劑盒進行檢測。

        T-AOC按公式(1)計算,以Fe2+終濃度為橫坐標,以不同濃度Fe2+對應的吸光度值為縱坐標繪制標準曲線,所得標準曲線為Y=5.104 8X+0.004 4,R2=0.999 8,線性較好,可用于后期實驗。

        (1)

        式中:V1為反應總體積,1.02 mL;V2為反應中樣品體積,0.03 mL;X為標準曲線中的函數(shù)變量。

        DPPH自由基清除率按公式(2)計算:

        (2)

        式中:A0、A1、A2分別為空白管、對照管和測定管于515 nm處測定的吸光值。

        SOD活性按公式(3)~公式(6)計算:

        ΔA1=A1-A2

        (3)

        ΔA0=A10-A20

        (4)

        (5)

        (6)

        式中:A1、A2、A10、A20分別為測定管、對照管、空白管1和空白管2于560 nm處測定的吸光值;F為樣品稀釋倍數(shù)。

        1.3.5 數(shù)據(jù)處理

        使用Excel 2018對實驗數(shù)據(jù)進行錄用和計算,采用Data Analysis對氣質(zhì)聯(lián)用的峰面積進行積分與提取,Origin 9.0軟件作圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 天麻酵素化過程中風味物質(zhì)分析

        2.1.1 天麻酵素化過程中游離氨基酸含量與組成分析

        由表1可知,天麻酵素化過程中氨基酸的總含量(total content of amino acids,TAA)呈先下降后上升的趨勢,可能是發(fā)酵前期酵母菌利用葡萄糖和氨基酸進行無氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化為酒精以及氨基酸自身的氧化降解,導致氨基酸含量降低;發(fā)酵后期氨基酸含量上升,可能是微生物細胞中的氨基酸溶出造成[7]。必需氨基酸(essential amino acids,EAA)影響食物營養(yǎng)價值,聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織提出氨基酸以EAA/TAA約40.00%為佳[8],天麻汁的EAA/TAA為18.26%,經(jīng)陳釀后天麻酵素中的EAA/TAA可達到50.76%,比天麻汁增加2.7倍,說明天麻汁酵素化處理后營養(yǎng)價值更高。

        表1 天麻酵素化過程中氨基酸質(zhì)量變化

        滋味活度值(taste activity value,TAV)[9]表示氨基酸含量與其味覺閾值比值。TAV>1時,則該氨基酸對樣品的滋味有貢獻,TAV與氨基酸滋味的貢獻呈正比,當TAV<1時,該氨基酸對樣品的滋味沒有貢獻。由表2可知,天麻汁中絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、纈氨酸(Val)、精氨酸(Arg)的TAV均>1,說明這9種氨基酸對天麻汁的滋味貢獻較大,其中谷氨酸(17.10)和精氨酸(4.88)的TAV最大,Glu可提供強烈的鮮味,Arg具有苦澀味[10],天麻汁以鮮味和苦味為主,此時呈現(xiàn)一定的鮮甜味和苦澀味,滋味不佳。經(jīng)陳釀后,苦味氨基酸中精氨酸的TAV下降,甜味氨基酸中Ala和His的TAV上升,甜味和鮮味是天麻酵素的主要呈味氨基酸,此時鮮甜味濃郁、苦味淡薄,滋味更佳。

        表2 天麻酵素化過程中游離氨基酸的TAV變化

        2.1.2 天麻酵素化過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

        由表3可知,天麻汁(發(fā)酵0 d)共檢出26種揮發(fā)性風味物質(zhì),其中醇類5種,相對含量為8.30%;醛酮類和酯類均為4種,含量分別為6.40%、3.90%;烷烴類種類最多為8種,含量可達3.61%;萜烯類種類最少為1種,相對含量為2.81%;醚類2種,醚類含量最高為74.18%。醚類在天麻汁中的含量最大,是天麻汁的主要揮發(fā)性物質(zhì),醚類一般具有煙熏、刺鼻、異味等氣味[11],可能是造成天麻汁馬尿臭氣味、雜味的原因。

        表3 天麻酵素化過程中揮發(fā)性成分的變化 單位:%(相對含量)

        天麻酵素化過程中(發(fā)酵7~30 d)共檢測出46種揮發(fā)性風味物質(zhì),其中醇類5種、醛酮類和酚類均為3種、酯類最多為27種、烷烴類4種、萜烯類2種、酸類1種。其中醇類在酵素化過程中呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,在發(fā)酵20 d相對含量最高為89.61%。 醇類主要來源于酵母菌等微生物酒精發(fā)酵,對食品的風味有較大的影響,是助香劑也是形成其他風味物質(zhì)的前體,少量高級醇可以使酒體醇甜,香氣豐滿[12]。如乙醇可以賦予食品蘋果甜香的風味特征[13]。苯乙醇具有玫瑰花香和茉莉花香等多種風味,給人以柔和愉悅的感覺[14]。酯類物質(zhì)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,發(fā)酵7 d時相對含量最高為18.84%,其中乙酸乙酯、山梨酸乙酯、9-十八酸乙酯、3-苯基丙酸乙酯、苯甲酸乙酯逐漸增加,乙酸異戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯先增加后下降。酯類是發(fā)酵過程中酸跟醇發(fā)生反應產(chǎn)生的,賦予天麻酵素獨特的香味[15]。如9-十八酸乙酯有淡淡的花味,辛酸乙酯具有類似白蘭地的香氣[16],苯甲酸乙酯具有濃烈的花香,并帶有水果的清香氣味,癸酸乙酯具有似葡萄的水果香氣[17]。因此,這些酯類作為天麻酵素中酯類物質(zhì)的骨架成分,對天麻酵素的品質(zhì)和香氣起著決定性作用。醛酮類是由酵母菌代謝產(chǎn)生,風味閾值較低,但是醛酮類物質(zhì)的香氣能夠作用于感官使得天麻酵素的香氣提升。萜烯類主要來源于植物原料,對天麻酵素的風味具有改善作用。醚類、烷烴類在發(fā)酵過程中含量雖然較低,但是豐富了天麻酵素的風味層面。與天麻汁相比,經(jīng)過微生物發(fā)酵后的天麻酵素花果香濃郁、口感柔和且未出現(xiàn)馬尿臭等不良風味。說明酵素化技術可以顯著改善天麻本身具有的不良風味。

        天麻酵素經(jīng)陳釀后(發(fā)酵60 d)共檢測出49種揮發(fā)性風味物質(zhì),其中醇類7種,相對含量最高可達66.86%;醛酮類、萜烯類、酸類均為2種,相對含量分別為0.89%、 0.27%、0.20%;酚類4種,相對含量為2.09%; 酯類種類最多為20種,相對含量可達28.10%, 其中乙酸乙酯的相對含量最高為11.80%;烷烴類8種,相對含量為0.57%;醚類1種,相對含量為0.44%。相比于發(fā)酵后的天麻酵素,經(jīng)陳釀后醇類、醛酮類、萜烯類、醚類含量降低,其中醇類可以生成醛酮類,而醛酮類物質(zhì)與有機酸發(fā)生酯化反應,生成大量酯類[18],酯類的變化與尹小慶等[19]在研究小米辣鲊辣椒發(fā)酵過程中風味物質(zhì)的變化一致。因此,經(jīng)陳釀后,酒精度適當降低,芳香味更加突出。

        2.2 天麻酵素化過程中抗氧化活性變化研究

        2.2.1 天麻酵素化過程中T-AOC分析

        T-AOC是評價樣品中的各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構成總抗氧化水平的重要指標[20]。如圖1所示,T-AOC的含量在發(fā)酵前期呈現(xiàn)下降的趨勢,在發(fā)酵20 d達到最低為2.52 μmol/mL;發(fā)酵后期不斷上升,在陳釀階段達到最高為5.87 μmol/mL,相比于天麻汁上升了0.7倍。這可能是發(fā)酵前期樣品中含有較多的游離羧基與Fe2+形成螯合物,而減少自由基的形成;在發(fā)酵后期微生物酶解一些中性和酸性氨基酸,自由基含量增加[21]。

        圖1 天麻酵素化過程中T-AOC的變化

        2.2.2 天麻酵素化過程中DPPH自由基清除能力分析

        DPPH自由基清除率廣泛運用于測定自由基清除能力。由圖2可知,DPPH自由基清除率在整個酵素化過程中不斷上升,天麻汁的DPPH自由基清除率只有62.36%,陳釀階段樣品中DPPH自由基清除率最高可達99.37%,這可能是酵素化過程中,蛋白質(zhì)在水解酶的作用下水解導致一些具有抗氧化性的氨基酸殘基暴露,DPPH自由基清除率升高[22]。

        圖2 天麻酵素化過程中DPPH的變化

        2.2.3 天麻酵素化過程中SOD活性分析

        圖3 天麻酵素化過程SOD活性的變化

        3 結(jié)論與展望

        在天麻酵素化過程中,總氨基酸的含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,陳釀結(jié)束后為1 971.79 mg/100g,天麻汁的EAA/TAA為18.26%,經(jīng)發(fā)酵陳釀后天麻酵素中的EAA/TAA達到50.76%,相比于天麻汁增加了2.7倍,在呈味氨基酸中,天麻汁以鮮味和苦味為主,經(jīng)陳釀后,天麻酵素以鮮味和甜味為主。天麻汁主要香氣物質(zhì)為醚類,發(fā)酵期間,醇類在發(fā)酵20 d 達到最大值為89.61%,醚類物質(zhì)被微生物降解,馬尿臭味消失,其主要香氣物質(zhì)為醇類和酯類,陳釀階段,酯類物質(zhì)的相對含量達到最高,說明陳釀對香味的形成具有至關重要的作用。T-AOC、DPPH自由基清除能力與SOD活性在發(fā)酵過程中整體均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,在陳釀結(jié)束后達到最大值,分別為5.87 μmol/mL、 99.37%與25.72 U/mL,其中SOD活性相比于天麻汁增加了25倍。

        天麻是傳統(tǒng)的藥食同源類藥物。目前,國內(nèi)外對天麻的研究主要關注于天麻的藥理作用,而對天麻酵素的開發(fā)與研究的報道較少。因此,本論文初步探討了天麻在不同酵素化階段風味物質(zhì)和抗氧化活性的動態(tài)變化,后期將對天麻酵素中的功能性成分進行研究,并結(jié)合改善小鼠睡眠實驗,進一步深入研究天麻發(fā)酵過程中的目標代謝產(chǎn)物,明晰天麻酵素的藥理活性以及作用機制,為促進天麻的發(fā)展提供理論支撐。

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