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        兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3緩解瀉劑結(jié)腸及其作用機制分析

        2021-11-29 11:24:02李鑫萍王琳琳趙建新張灝陳衛(wèi)王剛
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年22期
        關(guān)鍵詞:小鼠

        李鑫萍,王琳琳,趙建新,張灝,陳衛(wèi),王剛

        (江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

        瀉劑結(jié)腸是由于長期應(yīng)用刺激性瀉劑,損害結(jié)腸神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致腸神經(jīng)退行性變化[1-3],出現(xiàn)胃腸動力障礙,對瀉劑反應(yīng)性下降,使病人對瀉劑產(chǎn)生依賴性或者瀉劑成癮的一種狀況,常見于飽受便秘困擾的中老年人。在我國,隨著生活節(jié)奏加快、膳食結(jié)構(gòu)的改變及精神壓力激增,便秘的發(fā)病率逐年上升并趨于低齡化,嚴重威脅人類的生活質(zhì)量[4]。諸如番瀉葉、大黃、蘆薈等一系列刺激性瀉藥由于見效快、成本低飽受便秘患者青睞,患者為緩解便秘,長期使用刺激類瀉劑,隨著病程的進展,瀉劑的服用量與瀉下效果成反比,最終失去導(dǎo)瀉作用,形成“瀉劑結(jié)腸”,嚴重者甚至可發(fā)展為結(jié)腸黑變病甚至是結(jié)腸癌。但目前消費者對于這類瀉藥的副作用了解甚少,且國內(nèi)對于瀉劑結(jié)腸的報道較少,很少引起消費者尤其是便秘人群的關(guān)注。因此,刺激性瀉藥仍是很多家庭出現(xiàn)便秘癥狀時的首要選擇,長此以往,瀉劑結(jié)腸患者將越來越多,而目前對于瀉劑結(jié)腸的治療并無有效手段,嚴重患者需進行結(jié)腸切除術(shù)來緩解癥狀。

        目前,益生菌作為輔助治療手段在消化系統(tǒng)乃至神經(jīng)退行性疾病方面發(fā)揮著重要作用[5-6],雙歧桿菌作為緩解便秘的有效輔助治療手段,具有良好的通便效果[7-9],且在治療神經(jīng)退行性疾病方面具有巨大的潛力。因此,益生菌在緩解瀉劑結(jié)腸患者便秘的同時,有望修復(fù)瀉劑結(jié)腸患者受損的腸神經(jīng),將從根本上緩解瀉劑結(jié)腸。而目前的研究中,兩歧雙歧桿菌是緩解便秘常用的有效菌種,但其對于瀉劑結(jié)腸的具體作用還未有探究。本實驗通過長期服用番瀉葉提取物導(dǎo)致的瀉劑結(jié)腸小鼠模型,研究兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3對瀉劑結(jié)腸的緩解作用,以期為瀉劑結(jié)腸治療補充有效的益生菌診療方案。

        1 材料與方法

        1.1 試劑與儀器

        番瀉葉提取物,西安旭煌生物技術(shù)有限公司;枸櫞酸莫沙必利膠囊,上海新黃河制藥有限公司;活性炭粉、免疫熒光試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;阿拉伯樹膠粉、乙酸、丙酸、丁酸,國藥集團化學(xué)試劑公司;小鼠膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)ELISA試劑盒、小鼠乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)ELISA試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司;Anti-S100 beta抗體,Abcam(中國);PCR擴增引物以及合成序列,上海桑尼生物有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、HiScript III RTSuperMix for qPCR試劑盒,南京諾唯贊生物科技有限公司。

        1.2 菌株培養(yǎng)活化

        本實驗用菌兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3(Bifidobactirumbifidum)來源于江南大學(xué)生物技術(shù)中心菌種保藏庫。

        取-80 ℃冷凍保藏的菌液,用一次性接種環(huán)蘸取少量菌液在MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h,挑取單菌落接種于液體MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)20 h,以2%接種量傳代2次進行活化并擴大培養(yǎng)24 h,以轉(zhuǎn)速6 000 r/min,4 ℃下離心15 min收集菌泥,無菌生理鹽水洗滌2次后用10%脫脂乳重懸至6×109CFU/mL,分裝于保菌管-80 ℃凍存。

        1.3 動物實驗設(shè)計

        7周齡的SPF級雄性C57BL/6 J小鼠24只,購于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司,動物倫理審查編號:JN.No20190330c0780620。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±2)℃,相對濕度(50±10)%,12 h光照12 h黑夜更替。小鼠隨機分為4組:對照組、模型組、藥物對照莫沙必利組(莫沙必利組)和兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3組(FGSYC45M3),每組6只。適應(yīng)飼養(yǎng)1周 后開始灌胃,前12周空白組每天灌胃0.2 mL無菌水,其他組灌胃0.2 mL番瀉葉提取物(9 g/L), 每天濃度加倍,直至50%小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀后保持劑量灌胃,至80%小鼠恢復(fù)正常后繼續(xù)加倍灌胃,至50%小鼠腹瀉,持續(xù)以上3個循環(huán),并停藥1周,造模結(jié)束(該過程時間為13周)。14周開始進行為期3周的治療,空白組與模型組每天灌胃0.2 mL脫脂乳(100 g/L),藥物對照莫沙必利組灌胃0.2 mL脫脂乳重懸的莫沙必利懸液(200 g/L),兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3組灌胃0.2 mL脫脂乳(100 g/L)重懸的菌液(6×109CFU/mL)。

        1.4 實驗指標測定

        1.4.1 瀉劑結(jié)腸小鼠腸道轉(zhuǎn)運功能相關(guān)指標測定

        治療結(jié)束后第2天,每只小鼠灌胃0.2 mL墨汁,記錄從灌胃開始至排出首粒黑便時間。

        墨汁按照文獻[10]的方法配制:將100g阿拉伯膠與800 mL水混合均勻,加熱煮沸至溶液透明,再加入活性炭50 g,煮沸3次。待溶液冷卻后,用水稀釋定容至1 000 mL,4 ℃保存。

        將每只小鼠放入墊有吸水紙的籠盒中收集糞便,稱重后凍干,按照公式(1)計算糞便含水量:

        又聽到了吸鼻子和咳嗽的聲音,離他不到二十尺遠的兩塊巖石之間,他隱約看到一只灰狼的頭。那雙尖耳朵并不像別的狼那樣豎得筆挺;它的眼睛昏暗無光,布滿血絲;腦袋好像無力地、苦惱地耷拉著。這個畜生不斷地在太陽光里霎眼。正當他瞧著它的時候,它又發(fā)出了吸鼻子和咳嗽的聲音。

        (1)

        小鼠處死采集組織前,每只小鼠灌胃0.2 mL墨汁,30 min后處死小鼠,打開腹腔,剪取胃至盲腸腸段,測量幽門至盲腸上端為 “小腸總長度”,幽門至墨汁前沿為“墨汁推進距離”,按照公式(2)計算小腸推進率:

        (2)

        1.4.2 小鼠結(jié)腸組織S100 beta免疫熒光染色

        小鼠石蠟切片的制作參照文獻[11]的方法,按照免疫熒光試劑盒說明書進行S100 beta熒光染色,評價結(jié)腸組織中神經(jīng)膠質(zhì)細胞的數(shù)量。使用Pannoramic MIDI 數(shù)字切片掃描儀掃描切片拍照,每個樣品使用軟件Caseview放大40倍隨機截取6個視野,使用軟件ImageJ統(tǒng)計樣品的陽性表達面積。

        1.4.3 小鼠結(jié)腸組織GDNF,AChE水平測定

        用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液沖洗結(jié)腸組織,去除附著的糞便以及殘留血液,剔除周圍脂肪組織,稱重后剪碎,將剪碎的組織按照質(zhì)量比1∶9在組織破碎儀上進行破碎,以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心5 min,取上清液,按照說明書提供的方法進行測定,通過軟件Graphpad分析結(jié)果。

        1.4.4 小鼠結(jié)腸組織c-kit、AQP4、AQP8基因轉(zhuǎn)錄水平測定

        采用qRT-PCR法測定小鼠結(jié)腸組織中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平。取小鼠結(jié)腸組織,按照說明書提供的Trizol法提取結(jié)腸總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將小鼠結(jié)腸總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過PrimerBank查找小鼠c-kit、AQP4、AQP8和GAPDH基因的引物序列,由上海桑尼生物科技有限公司合成引物,引物序列如表1所示。

        表1 基因引物序列

        以cDNA為模板,GAPDH基因為內(nèi)參,按照iScript III RTSuperMix for qPCR試劑盒說明書進行qRT-PCR實驗,通過CFX96Manager軟件分析結(jié)果,Graphpad作圖分析。

        1.4.5 小鼠糞便中短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)的測定

        收集到的小鼠糞便凍干后參照文獻[12]的方法進行浸泡、酸化,用無水乙醚萃取后使用GC-MS測定糞便中的SCFAs含量。使用軟件Xcalibur分析結(jié)果。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3提高瀉劑結(jié)腸小鼠結(jié)腸轉(zhuǎn)運能力并提高糞便含水量

        瀉劑結(jié)腸是由于患者長期服用刺激性瀉藥導(dǎo)致的腸神經(jīng)系統(tǒng)受損,結(jié)腸傳輸障礙,臨床表現(xiàn)為頑固型便秘[1]。因此我們結(jié)合首粒黑便時間和小腸推進率來反應(yīng)腸道轉(zhuǎn)運能力,并輔以糞便含水量表征小鼠造模情況,并評價兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3的緩解效果。

        小鼠首粒黑便時間反映的是整個消化道的轉(zhuǎn)運時間,而小腸推進率反應(yīng)的是小腸的轉(zhuǎn)運能力。由圖1可知,造模后小鼠小腸推進率無明顯差異,而首粒黑便時間顯著延長,即全腸道轉(zhuǎn)運能力明顯下降,可知模型組小鼠存在明顯的結(jié)腸轉(zhuǎn)運障礙,且糞便含水量明顯下降,小鼠造模成功。灌胃FGSYC45M3進行治療后,小鼠首粒黑便時間顯著縮短,糞便含水量提高,且無論從首粒黑便時間還是糞便含水量,兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3的效果均優(yōu)于藥物對照莫沙必利,說明FGSYC45M3治療可以顯著提高瀉劑結(jié)腸小鼠的結(jié)腸轉(zhuǎn)運能力,提高糞便含水量,緩解瀉劑結(jié)腸。

        a-首粒黑便時間;b-小腸推進率;c-糞便含水量

        2.2 兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3對腸神經(jīng)系統(tǒng)的影響

        瀉劑結(jié)腸與普通便秘的區(qū)別在于患者具有長期服用瀉劑史或使用瀉劑成癮,導(dǎo)致腸神經(jīng)損傷。有研究發(fā)現(xiàn),瀉劑結(jié)腸存在明顯的腸神經(jīng)系統(tǒng)損傷,包括腸神經(jīng)元變性以及慢波起搏消失[1,13]。腸神經(jīng)系統(tǒng)主要由腸神經(jīng)元和腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞組成。其中神經(jīng)膠質(zhì)細胞的數(shù)量是腸神經(jīng)元的4倍。這些膠質(zhì)細胞包繞在神經(jīng)元之外,為神經(jīng)元提供營養(yǎng)和保護,并調(diào)節(jié)神經(jīng)信號傳遞和腸道穩(wěn)態(tài)[14]。S100 beta是神經(jīng)膠質(zhì)細胞的特征性表達蛋白[15],可通過免疫熒光測定小鼠結(jié)腸中特征蛋白S100 beta的表達來評價瀉劑結(jié)腸小鼠結(jié)腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞數(shù)量。由圖2可知,番瀉葉提取物的長期作用導(dǎo)致瀉劑結(jié)腸小鼠結(jié)腸組織中膠質(zhì)細胞減少,說明長期的番瀉葉刺激大腸致神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡,無法支持神經(jīng)系統(tǒng)正常功能從而影響腸道轉(zhuǎn)運,兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3可恢復(fù)瀉劑結(jié)腸小鼠結(jié)腸中膠質(zhì)細胞的數(shù)量,而藥物對照莫沙必利雖有恢復(fù)膠質(zhì)細胞數(shù)量的趨勢,但差異并不顯著。研究發(fā)現(xiàn),微生物群可以驅(qū)動腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞的更新,對于維持生理條件下的胃腸道功能至關(guān)重要[14],而莫沙必利是通過5-HT4受體作用緩解瀉劑結(jié)腸[2],或許對于神經(jīng)數(shù)量的影響并不直接,推測兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3或其代謝產(chǎn)物能夠刺激膠質(zhì)細胞前體細胞的分化,重建腸神經(jīng)膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò),從而緩解瀉劑結(jié)腸。

        GDNF在體內(nèi)廣泛分布,大量文獻證明,GDNF具有神經(jīng)支持和保護作用,并能促進神經(jīng)元修復(fù)與再生,可以保護和修復(fù)多巴胺能神經(jīng)元,有研究發(fā)現(xiàn),GDNF處理可以增加腸道神經(jīng)元數(shù)量并為神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持,提高腸道運動能力[16-17]。本研究中,瀉劑結(jié)腸小鼠結(jié)腸中GDNF含量明顯減少(圖3),結(jié)合圖2結(jié)果,我們認為長期的瀉藥刺激導(dǎo)致膠質(zhì)細胞數(shù)量減少,GDNF分泌量減少導(dǎo)致神經(jīng)受損。兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3處理可顯著提高瀉劑結(jié)腸小鼠結(jié)腸中GDNF的含量,且作用效果與藥物莫沙必利一致,考慮藥物莫沙必利可以刺激產(chǎn)生GDNF,而兩歧雙歧桿菌能夠增加結(jié)腸膠質(zhì)細胞數(shù)量,通過膠質(zhì)細胞表達的Toll樣受體和G蛋白偶聯(lián)受體識別腸道菌群及其產(chǎn)物提高GDNF分泌量,從而修復(fù)受損神經(jīng),加快神經(jīng)組織更新,恢復(fù)正常的腸神經(jīng)功能,從而緩解瀉劑結(jié)腸。

        a-各組小鼠結(jié)腸免疫熒光染色;b-小鼠結(jié)腸免疫熒光陽性表達面積

        圖3 小鼠結(jié)腸中GDNF含量

        AChE是由黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元分泌的一種神經(jīng)傳導(dǎo)關(guān)鍵酶,參與神經(jīng)信號在生物體內(nèi)的正常傳遞,其在神經(jīng)突觸中降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿已得到充分的研究[18],也有研究發(fā)現(xiàn),AChE在腸道發(fā)育中起關(guān)鍵作用,能促進神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)再生。PICKETT等[19]發(fā)現(xiàn)阻斷AChE具有神經(jīng)毒性,敲低AChE的表達導(dǎo)致非洲爪蟾和斑馬魚腸道發(fā)育異常,說明AChE的功能是腸道發(fā)育所必須的。SPERLING等[20]的研究發(fā)現(xiàn)AChE可以通過與層黏連蛋白結(jié)合促進神經(jīng)突生長。在本研究中,瀉劑結(jié)腸小鼠結(jié)腸中AChE含量顯著減少(圖4),提示黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元分泌不足,膽堿能神經(jīng)元信號傳遞異常,影響神經(jīng)發(fā)育,兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3處理恢復(fù)了AChE含量,這與前人的研究結(jié)果是一致的[21],且對于AChE的提高效果優(yōu)于對照藥物莫沙必利,推測FGSYC45M3或其代謝物參與某種途徑影響了AChE的分泌,促進神經(jīng)發(fā)育和再生,從而緩解瀉劑結(jié)腸。

        圖4 小鼠結(jié)腸中AChE含量

        Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal,ICC)是胃腸道運動的起搏細胞,提供促進腸道蠕動的慢波,而慢波是腸平滑肌蠕動的限速步驟,調(diào)控腸道動力,因此,對于ICC的研究仍作為評價腸道轉(zhuǎn)運功能的熱點[22]。c-kit受體是ICC特有的表面識別受體,通過對c-kit基因表達定量,可以反應(yīng)腸道中ICC的數(shù)量。張燕等[1]的研究發(fā)現(xiàn),長期使用瀉劑嚴重影響ICC的形態(tài)數(shù)量和功能,進而影響腸道傳輸功能。這與我們的結(jié)論是一致的,由圖5可知,瀉劑結(jié)腸小鼠c-kit轉(zhuǎn)錄水平明顯降低,說明長期的番瀉葉刺激導(dǎo)致ICC細胞數(shù)量減少,影響腸道慢波傳遞,使腸道失去動力,且結(jié)合上文的神經(jīng)相關(guān)指標,瀉劑結(jié)腸小鼠神經(jīng)信號傳導(dǎo)存在異常,更加重了腸道轉(zhuǎn)運受阻。藥物莫沙必利雖有恢復(fù)趨勢但效果并不顯著,而灌胃FGSYC45M3可以恢復(fù)ICC數(shù)量,改善腸道轉(zhuǎn)運功能,但是具體的作用途徑還有待探究。

        圖5 小鼠結(jié)腸c-kit基因表達量

        2.3 兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3對瀉劑結(jié)腸小鼠水份吸收的影響

        水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是胃腸道中水分跨細胞運輸?shù)闹饕緩?,參與腸道水液平衡。有研究發(fā)現(xiàn),AQP4基因敲除小鼠的糞便含水量增加,而AQPs在便秘患者中高表達,使便秘患者糞便脫水干結(jié),不易排出[23]。有學(xué)者認為,番瀉苷短期刺激會下調(diào)結(jié)腸中AQPs的表達導(dǎo)致腹瀉,而長期刺激會使AQPs表達增加[24],這可能是便秘患者對于番瀉葉逐漸耐受的原因之一。由圖6可知,瀉劑結(jié)腸小鼠AQP4和AQP8基因轉(zhuǎn)錄水平均高于對照組,腸道吸水能力變強,使其糞便含水量對應(yīng)變低,這也與圖1我們得到的結(jié)果一致,兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3處理能夠降低瀉劑結(jié)腸小鼠中AQP4和AQP8的表達量,雖然對于AQP8的效果不及藥物莫沙必利,但是對于AQP4的作用可以達到莫沙必利的效果,且整體對于AQP4和AQP8的降低均具有顯著差異,說明對于水分吸收方面,兩歧雙歧FGSYC45M3和莫沙必利一樣可以減少結(jié)腸水分吸收,提高糞便含水量,刺激結(jié)腸蠕動,使糞便更易排除,從而緩解瀉劑結(jié)腸患者的便秘癥狀。

        a- AQP4;b- AQP8

        2.4 兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3對糞便中SCFAs含量的影響

        SCFAs是由腸道微生物組發(fā)酵中產(chǎn)生的,參與調(diào)節(jié)腸道屏障和免疫功能。有研究發(fā)現(xiàn),糞便中乙酸、丙酸和丁酸的量與腸道轉(zhuǎn)運時間顯著相關(guān),且SCFAs的水平變化是由于腸道菌群變化引起的[25-26]。

        SCFAs中尤其丁酸是結(jié)腸細胞首選的能量底物,且丁酸可以恢復(fù)GDNF的量,顯著增加膽堿能神經(jīng)元的比例,增加結(jié)腸環(huán)形肌的收縮反應(yīng)[25-26]。在本研究中,瀉劑結(jié)腸小鼠糞便中SCFAs尤其是丁酸的水平下調(diào),或許是瀉劑結(jié)腸腸道動力失調(diào)的原因之一。灌胃FGSYC45M3 可以顯著提高糞便中SCFAs的水平(圖7),且效果明顯優(yōu)于藥物莫沙必利。結(jié)合以上結(jié)果,考慮是FGSYC45M3的定植改變了腸道環(huán)境,使腸道菌群產(chǎn)SCFAs增多,從而提高腸道轉(zhuǎn)能力,緩解瀉劑結(jié)腸。

        a-糞便中乙酸含量;b-糞便中丙酸含量;c-糞便中丁酸含量;d-糞便中總酸(乙酸+丙酸+丁酸)含量

        3 結(jié)論

        本研究使用的兩歧雙歧桿菌FGSYC45M3能夠有效增加瀉劑結(jié)腸小鼠腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞和ICC細胞數(shù)量,提高GDNF分泌量,重建受損的腸神經(jīng);增加糞便中SCFAs的含量,增強腸道轉(zhuǎn)運功能;降低瀉劑結(jié)腸小鼠AQP4和AQP8基因的表達,提高糞便含水量,且讓人驚喜的是,該菌的綜合作用效果優(yōu)于藥物莫沙必利,能在緩解瀉劑結(jié)腸便秘的基礎(chǔ)上,重建腸神經(jīng)功能。基于本研究結(jié)果,兩歧雙歧FGSYC45M3可以更好的應(yīng)用于臨床,治療由于長期服用番瀉葉導(dǎo)致的瀉劑結(jié)腸。

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