周海波，申琪瑤，陳漢娜，王宗杰，李越中，張友明，卞小瑩

（山東大學(xué)，微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237）

黏細(xì)菌屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，是新穎活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源，具有巨大的藥用開(kāi)發(fā)潛力。目前已從黏細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了大約100多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)和600多種結(jié)構(gòu)類似物。這些化合物不僅結(jié)構(gòu)類型豐富，包括聚酮類、非核糖體肽、萜類以及其他雜合的結(jié)構(gòu)類型，同時(shí)也顯示了廣泛的生物活性，如抗菌、抗腫瘤、抗病毒、免疫抑制、抗瘧等［1-6］。

隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的基因組信息分析表明黏細(xì)菌基因組所蘊(yùn)藏的生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster，BGC）合成新穎次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了目前已分離獲得的化合物的數(shù)目。例如，抗腫瘤藥物埃博霉素（epothilone）的產(chǎn)生菌纖維堆囊菌So0157-2（Sorangium cellulosumSo0157-2）的基因組測(cè)序結(jié)果表明，該菌株擁有14.78 Mb 的環(huán)狀染色體，是目前已知基因組最大的原核生物［7-9］。除了已知的埃博霉素系列衍生物［10-15］之外仍未見(jiàn)其他化合物從該菌株中分離報(bào)道，這預(yù)示著該菌株仍具有較大的代謝潛能。對(duì)隱性基因簇進(jìn)行有效的激活和改造，能夠?yàn)樗幬锵葘?dǎo)結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)提供更多的化合物資源。由于纖維堆囊菌So0157-2 生長(zhǎng)相對(duì)較慢、培養(yǎng)困難，本源菌也缺乏合適的遺傳操作體系，對(duì)其天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)存在著諸多挑戰(zhàn)。

近年來(lái)天然產(chǎn)物生物合成基因簇的異源表達(dá)策略受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注。異源表達(dá)是將完整的基因簇克隆到穿梭載體上然后轉(zhuǎn)移到合適的異源宿主中進(jìn)行表達(dá)，是挖掘難培養(yǎng)或未培養(yǎng)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的有效手段。相比于原始宿主，異源宿主在遺傳操作和生長(zhǎng)速度上有較大優(yōu)勢(shì)。一方面，異源表達(dá)可以用于提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。另一方面，異源表達(dá)可以用于鑒定已知天然產(chǎn)物的生物合成途徑。此外，異源表達(dá)還可以用于鑒定隱性基因簇，發(fā)現(xiàn)新型天然產(chǎn)物，特別有利于難培養(yǎng)或未培養(yǎng)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的挖掘［16-19］。

異源表達(dá)的難點(diǎn)之一在于大部分天然產(chǎn)物生物合成基因簇都相當(dāng)大（＞10 kb），PCR 擴(kuò)增很難得到如此長(zhǎng)的DNA 序列。通過(guò)構(gòu)建和篩選基因文庫(kù)雖然能夠獲得目的基因簇，但是工作量非常大，且不一定能獲得完整的基因簇。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，可以利用直接克隆技術(shù)（direct cloning）從基因組中克隆大型基因簇，比如LLHR（linear-linear homologous recombination）、 TAR（transformation-associated recombination）、CATCH（Cas9 assisted targeting of chromosome segments）等［20］。其中LLHR是由本團(tuán)隊(duì)于2012年開(kāi)發(fā)的基于Red/ET 重組工程技術(shù)（recombineering）的直接克隆技術(shù)［21］，并與異源表達(dá)相結(jié)合，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物基因簇的挖掘。2018年將Red/ET重組工程技術(shù)與核酸外切酶體外處理技術(shù)相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了ExoCET（exonuclease combined with RecET recombination）克隆技術(shù)，進(jìn)一步提高了BGCs 直接克隆的效率［22］。此外，Red/ET 重組工程技術(shù)還可以用于基因簇的無(wú)痕定點(diǎn)突變，結(jié)構(gòu)域替換等等，極大促進(jìn)了大型基因簇的遺傳操作［22-28］。

異源表達(dá)的另一個(gè)難點(diǎn)在于異源宿主的選擇。大腸桿菌和釀酒酵母都是表征良好、易于遺傳操作的模式菌株，為細(xì)菌和真菌中天然產(chǎn)物的表達(dá)提供了良好的異源宿主［29-31］。研究者也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)宿主菌與包含目標(biāo)基因簇的菌株在進(jìn)化上相近時(shí)，異源表達(dá)就更易成功。所以，很多鏈霉菌被開(kāi)發(fā)為異源宿主菌，用于放線菌中基因簇的異源表達(dá)［32-33］?？捎糜陴ぜ?xì)菌異源表達(dá)的異源宿主菌相對(duì)缺乏，目前常用的有黃色黏球菌（Myxococcus xanthus）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）以及Schlegelella brevitaleaDSM 7029（曾用名：BurkholderialesStrain DSM 7029，［Polyangium］brachysporumDSM 7029）等［16-18］。除了黃色黏球菌和S.brevitaleaDSM 7029之外，其他異源宿主產(chǎn)量普遍較低。黃色黏球菌也屬于黏細(xì)菌屬，自身生長(zhǎng)周期慢、難于進(jìn)行遺傳操作等劣勢(shì)也限制了其應(yīng)用。S.brevitaleaDSM 7029 是一株能夠產(chǎn)生多種非核糖體肽、聚酮-非核糖體肽雜合化合物的革蘭氏陰性細(xì)菌，相較于黃色黏球菌具有生長(zhǎng)快、易操作、代謝背景清晰等諸多優(yōu)點(diǎn)，特別是在表達(dá)纖維堆囊菌來(lái)源埃博霉素中顯示了作為通用底盤菌的潛力［34-37］。因此，該菌株可作為本研究的異源宿主候選菌。

基于纖維堆囊菌So0157-2 基因組信息預(yù)測(cè)分析所顯示出的代謝潛能，本論文利用ExoCET 直接克隆技術(shù)從該菌基因組DNA 中克隆了1 個(gè)未知功能的NRPS-PKS 雜合的基因簇BGC18。通過(guò)啟動(dòng)子插入，并以S.brevitaleaDSM 7029為異源宿主進(jìn)行異源表達(dá)，經(jīng)過(guò)液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）分析，正相與反相色譜柱靶向分離純化，獲得了3個(gè)該基因簇對(duì)應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物。最后，通過(guò)核磁共振（NMR）結(jié)構(gòu)鑒定和Marfey 反應(yīng)確定了3 個(gè)化合物分別為新天然產(chǎn)物Cyclo（N-Me-L-Leu-L-Val）（1）和 Cyclo （N-Me-L-Leu-L-Leu）（2）， 新 化 合 物Cyclo（N-Me-L-Leu-L-Ⅰle）（3）。將化合物結(jié)構(gòu)與生物合成基因簇對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)化合物結(jié)構(gòu)的多樣性來(lái)源于第1 個(gè)腺苷化結(jié)構(gòu)域（A domain）對(duì)底物識(shí)別的寬泛性。此外，推測(cè)由于缺少硫醇化結(jié)構(gòu)域（T domain）導(dǎo)致PKS 模塊被跳過(guò)，從而只獲得了兩個(gè)NRPS模塊指導(dǎo)合成的環(huán)二肽產(chǎn)物。該研究成功構(gòu)建了基于Red/ET 重組工程技術(shù)的纖維堆囊菌So0157-2 基因簇的直接克隆、遺傳修飾和異源表達(dá)體系，不僅豐富了纖維堆囊菌So0157-2 的代謝產(chǎn)物庫(kù)，也為挖掘該菌株中其他新穎的天然產(chǎn)物用于藥物篩選評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

本研究所用的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。寡核苷酸引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，本研究所用的寡核苷酸序列見(jiàn)表2。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒Tab.1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用的引物Tab.2 Primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：酵母粉0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.1%，pH 7.0。

CYMG 培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.8%，酵母粉0.4%，MgCl2·2H2O 0.4%，甘油5 mL/L。

M26 培養(yǎng)基：土豆淀粉0.8%，葡萄糖0.2%，蛋白胨0.2%，酵母提取物0.2%，CaCl2·2H2O 0.1%，微量元素液1 mL/L；pH 7.0。

VY/2 培 養(yǎng) 基 ： 鮮 酵 母 0.5%， MgSO4·7H2O 0.4%，維生素B120.005%，CaCl2·2H2O 0.1%。

以上固體培養(yǎng)基均添加1.5%的瓊脂。

1.1.3 主要試劑和儀器

限制性DNA 內(nèi)切酶、T4 DNA 聚合酶購(gòu)自New England BioLabs 公司；PrimeSTAR Max DNA聚合酶、DNA Marker 購(gòu)自Takara 公司；卡那霉素（kanamycin，km）、氯霉素（chloramphenicol，cm）購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；培養(yǎng)基組分購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；分析純甲醇、無(wú)水乙醇、異丙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜級(jí)甲醇、乙腈購(gòu)自Thermo Fisher 科技有限公司。

液質(zhì)聯(lián)用儀型號(hào)為Thermo Fisher UltiMate3000與Bruker Amazon SL聯(lián)用；高效液相色譜儀型號(hào)為Agilent 1260；電轉(zhuǎn)儀型號(hào)為Eppendorf AG 4309；核磁共振波普儀型號(hào)為Agilent 500 MHz DD2；HPLC 制備所用色譜柱型號(hào)為Agilent ZORBAX SB-C18，9.4 mm×250 mm，5 μm；液質(zhì)分析所用色譜柱為Thermo Scientific Acclaim RSLC 120 C18，2.1 mm×100 mm，2.2 μm。

1.2 BGC18 基因簇的直接克隆與異源表達(dá)

1.2.1S.cellulosumSo0157-2基因組提取

將-80 ℃保藏的S. cellulosumSo0157-2 接種到VY/2 平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌膜，轉(zhuǎn)接到表面濕潤(rùn)的M26平板上。刮取M26平板培養(yǎng)5～7 d的菌落置于50 mL離心管中，水洗兩次，然后根據(jù)菌量加入適量的無(wú)菌水，渦旋混勻。吸取1.8 mL菌液分裝到2 mL EP 管中，12 000 r/min 離心1 min，棄上清。加入450 μL Tris-HCl（10 mmol/L，pH 8.0），吹打混勻。加入30 μL 20 mg/mL 蛋白酶K，顛倒混勻。加入40 μL 10%SDS（sodium laurylsulfonate）后，輕輕混勻。50 ℃水浴1～2 h，中間間斷顛倒直至溶液變澄清。加入500 μL 苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1），快速混勻，至溶液呈乳濁狀，13 800 r/min 離心15 min。用去尖的移液吸頭吸取300 μL 上清置于新的 2 mL EP 管中。加入 35 μL 3 mol/L NaAc（pH 7.5），混勻后，加入1.2 mL 無(wú)水乙醇，混勻。準(zhǔn)備新的2 mL EP 管并加入1 mL 70%乙醇，用黃色吸頭將懸浮的DNA 挑至該EP管中。10 000 r/min 離心1 min。棄上清，倒置于吸水紙上并用吸水紙將管壁上的水吸掉。室溫干燥15～20 min。加入200 μL 雙蒸水（double-distilled H2O，ddH2O），放置4°C冰箱備用。

1.2.2S.cellulosumSo0157-2基因組酶切產(chǎn)物制備

將基因組DNA 利用限制性內(nèi)切酶DraⅠ和HindⅢ酶切，釋放目標(biāo)基因簇片段。取上述制備的基因組 DNA 200 μL，加入 40 μL 10×Cutsmart buffer、 12 μL 限 制 性 內(nèi) 切 酶DraⅠ 和Hind Ⅲ 、1.5 μL RNase A，用ddH2O 補(bǔ)齊至 400 μL，37 ℃反應(yīng)3 h。取10 μL 酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)之后用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）抽提酶切產(chǎn)物除去蛋白，然后進(jìn)行乙醇沉淀。

1.2.3 直接克隆載體的制備

以 BGC18-HAF 和 BGC18-HAR 為 PCR 引 物 ，以質(zhì)粒p15A-cm-tetR-tetO-hyg-ccdB 為PCR 模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。取2 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，確認(rèn)正確后將剩余PCR產(chǎn)物切膠回收目的片段。

1.2.4 目的基因簇BGC18的直接克隆

直接克隆載體和酶切基因組產(chǎn)物在體外用T4 DNA Polymerase 退火：取 200 ng 克隆載體、2 μL 10×NEB Buffer 2.1、0.13 μL T4 DNA Polymerase 混勻后，輕輕加入12 μL 基因組酶切產(chǎn)物，再用ddH2O將酶切體系補(bǔ)足到20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，60 min；75 ℃，20 min；50 ℃，30 min；4 ℃保溫。反應(yīng)完成之后將產(chǎn)物室溫除鹽40 min。將上述除鹽后的產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到經(jīng)L-Ara 誘導(dǎo)的感受態(tài)細(xì)胞E.coliGB05-dir/pSC101-BAD-ETgA 中。從LB 轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切分析。

1.2.5 目的基因簇BGC18的遺傳修飾

分別對(duì)質(zhì)粒p15A-cm-BGC18 進(jìn)行轉(zhuǎn)座元件和啟動(dòng)子的插入。利用帶有同源臂的引物對(duì)ⅠR-Pkm-C18-ⅠR-HAF1/HAR1對(duì)質(zhì)粒pR6K-oriT-TnpA-ⅠR-km進(jìn)行擴(kuò)增，得到oriT-ⅠR-PkmPCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物通過(guò)切膠回收純化；隨后將回收的產(chǎn)物與質(zhì)粒p15A-cm-BGC18 共同轉(zhuǎn)入E. coliGB05-red 感受態(tài)細(xì)胞中，使用合適的抗生素（km/cm）篩選重組子；重組質(zhì)粒通過(guò)限制性內(nèi)切酶ApaL Ⅰ進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序鑒定。

1.2.6 目的基因簇BGC18異源表達(dá)

S.brevitaleaDSM 7029已作為異源宿主表達(dá)了多個(gè)黏細(xì)菌來(lái)源的基因簇，所以本研究中選擇野生型的S.brevitaleaDSM 7029 作為首選異源宿主。首 先 將 質(zhì) 粒 p15A-oriT-TnpA-ⅠR-Pkm-BGC18 （ 約1 μg）電轉(zhuǎn)入野生型S.brevitaleaDSM 7029 中［24］，通過(guò)含卡那霉素的CYMG 平板篩選重組子。分別利用detect-C18 in 7029-F1/R1，detect-C18 in 7029-F2/R2，detect-C18 in 7029-F3/R3，detect-C18 in 7029-F4/R4，detect-C18 in 7029-F5/R5五對(duì)引物對(duì)重組子進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.2.7 菌株的發(fā)酵提取分離與LC-MS檢測(cè)

將正確的重組子接種于含有50 mL CYMG 培養(yǎng)基（km 3μg/mL）的300 mL 錐形瓶中，30 °C，180 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜制備種子液。轉(zhuǎn)接50 μL 種子液于相同的培養(yǎng)基相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2 d，然后每瓶加入1 mL經(jīng)前處理的XAD16大孔樹(shù)脂，繼續(xù)恒溫?fù)u床培養(yǎng)2 d。

將菌體和大孔樹(shù)脂通過(guò)100目篩進(jìn)行分離，并用雙蒸水將樹(shù)脂洗滌3 次（盡量去除菌體）。將樹(shù)脂倒入新的干燥的錐形瓶中，加入50 mL 的甲醇，30°C，180 r/min浸泡1 h。通過(guò)濾紙過(guò)濾將樹(shù)脂和甲醇分離，并將甲醇組分減壓濃縮蒸干得到粗提物。加入1 mL 色譜甲醇或乙腈溶解粗提物，然后12 000 r/min，離心 10 min，取上清過(guò) 0.22 μm 微孔濾膜并轉(zhuǎn)移至HPLC 進(jìn)樣管中，待HPLC-MS 進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

液質(zhì)檢測(cè)條件如下：液質(zhì)分析色譜柱；流動(dòng)相，A相為水+0.1%甲酸，B相為乙腈+0.1%甲酸；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣 3 μL；檢測(cè)波長(zhǎng) 190～400 nm；洗脫程序0～3 min，5% B；3～18 min，5%～95%B；18～22 min，95% B；22～25 min，5% B。質(zhì)譜檢測(cè)條件：電噴霧離子源，正離子模式，二級(jí)質(zhì)譜AutoMS2，檢測(cè)范圍m/z70～2200。

1.2.8 氨基酸絕對(duì)構(gòu)型的確定

采用Marfey 法將化合物1～3 分別進(jìn)行酸水解， 水解產(chǎn)物分別與 L-FDAA （1-fluoro-2-4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide） 或 D-FDAA 反應(yīng)［35］。采用同樣的方法制備標(biāo)準(zhǔn)品N-Me-L-Leu 與L/D-FDAA 的衍生產(chǎn)物，L/D-Val、L/D-Leu、L/D-Ⅰle、L/D-allo-Ⅰle 與 L-FDAA 的衍生物，隨后進(jìn)行LC-MS 分析。N-Me-L-Leu、L/D-Val 與 L/D-FDAA的衍生產(chǎn)物的分析條件與1.2.7液質(zhì)檢測(cè)條件一致，檢測(cè)波長(zhǎng) 330 nm。L/D-Leu、L/D-Ⅰle、L/D-allo-Ⅰle的衍生產(chǎn)物洗脫程序?yàn)?～45 min，5%～50% B。對(duì)應(yīng)衍生物的參照分子量為［M+H］+m/z398（N-Me-L-Leu）、370（L/D-Val）、384（L/D-Leu，L/D-Ⅰle，L/D-allo-Ⅰle）。

2 結(jié)果和分析

2.1 S.cellulosum So0157-2生物信息學(xué)分析

通過(guò)antiSMASH 分析，S.cellulosumSo0157-2基因組（NCBⅠ數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)：CP003969.1）共包含35 個(gè)BGCs（表3），編碼聚酮（PKS）、非核糖體 肽 （NRPS）、 PKS-NRPS 雜 合 以 及 萜 類（terpene）等多種結(jié)構(gòu)類型化合物。除了已知的epothilone［8］及另外兩個(gè)萜類生物合成基因簇geosmin［40］和 eremophilene［41］之外，其余基因簇與目前已知的生物合成基因簇都存在著較大的不同，相似度較低，這預(yù)示著該菌株仍具有較大的代謝潛能。PKS-NRPS雜合的化合物通常具有新穎的結(jié)構(gòu)以及廣泛的生物活性［42］，因此優(yōu)先選取該類型基因簇進(jìn)行激活。BGC18 預(yù)測(cè)為PKS-NRPS雜合基因簇，長(zhǎng)度約為26.7 kb（圖1）。核心基因（SCE1572_24725）包含3 個(gè)模塊共有10 個(gè)結(jié)構(gòu)域（C1-A1-T1，C2-A2-MT-T2，KS-AT-TE）（圖 1）。其中A1（adenylation）被預(yù)測(cè)可能識(shí)別纈氨酸/丙氨酸/甘氨酸/亮氨酸/異亮氨酸（Val/Ala/Gly/Leu/Ⅰle），A2被預(yù)測(cè)可能識(shí)別亮氨酸，然后被N-甲基化形成N-甲基亮氨酸（N-Me-Leu），AT（acyltransferase）則可能識(shí)別丙二酰輔酶A（Malonyl-CoA），但是缺少PKS 所必需的硫醇化（thiolation，T）結(jié)構(gòu)域，這些底物能否通過(guò)NRPS和PKS的延伸單元被依次加載、縮合，形成的終產(chǎn)物最后被硫酯酶（TE）結(jié)構(gòu)域釋放是一個(gè)值得研究的問(wèn)題。

圖1 BGC18基因簇結(jié)構(gòu)Fig.1 Organization of the biosynthetic gene cluster BGC18

表3 antiSMASH 預(yù)測(cè)So0157-2基因組編碼的生物合成基因簇Tab.3 Biosynthetic gene clusters in the genome of so0157-2 predicted by antiSMASH

2.2 BGC18 的直接克隆、改造、異源表達(dá)

利用DraⅠ和Hind Ⅲ酶切基因組，釋放出27 kb 的完整BGC18，將酶切后的基因組回收備用。然后PCR擴(kuò)增1.79 kb的直接克隆載體p15A-cm，得到的片段兩端各帶有72 bp 的同源臂。參照ExoCET 的方法［22］，對(duì)基因簇進(jìn)行克隆（圖 2）。復(fù)蘇后的菌體涂布含氯霉素的LB 篩選平板，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取24 個(gè)轉(zhuǎn)化子，用MscⅠ酶切鑒定（圖3），將其中4 個(gè)所有酶切條帶均正確的質(zhì)粒，對(duì)它們的同源臂部分進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的命名為p15A-cm-BGC18。為了讓質(zhì)粒p15A-cm-BGC18能在異源宿主中成功表達(dá)，需要插入轉(zhuǎn)座元件oriT-tnpA-ⅠR 將基因簇通過(guò)轉(zhuǎn)座的方式整合至異源宿主的基因組上。此外，來(lái)源于黏細(xì)菌的啟動(dòng)子在DSM 7029中可能無(wú)法正常工作，所以將BGC18的結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子替換成異源宿主中可以工作的組成型啟動(dòng)子Tn5-kan（Pkm）。用帶有50 bp 同源臂的引物對(duì)pR6K-oriT-TnpA-ⅠR-km 進(jìn)行擴(kuò)增，得到oriT-TnpA-ⅠR-km 片段，將這個(gè)片段與p15A-cm-BGC18 發(fā)生線環(huán)重組（LCHR），挑選7 個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切分析和同源臂部分測(cè)序，成功獲得重組質(zhì)粒p15A-oriT-ⅠR-Pkm-BGC18（圖3）。

圖2 基因簇BGC18的直接克隆與遺傳修飾Fig.2 Direct cloning and modification of BGC18

圖3 重組質(zhì)粒 p15A-cm-BGC18（a）和p15A-OriT-ⅠR-Pkm-BGC18（b）分別以MscⅠ和 ApaLⅠ酶切鑒定（紅色方框代表酶切條帶正確）Fig.3 a:Restriction analysis of the recombinant plasmids p15A-cm-BGC18 by MscⅠ(a)and p15A-OriT-ⅠR-Pkm-BGC18 by ApaLⅠ(b)(Red box indicates right recombinant plasmids)

將質(zhì)粒 p15A-oriT-ⅠR-Pkm-BGC18 電轉(zhuǎn)入野生型的S. brevitaleaDSM 7029 中，從含卡那霉素的CYMG 平板上挑取重組子進(jìn)行菌落PCR 鑒定，挑選3 個(gè)正確的重組子（DSM7029：Pkm-BGC18）進(jìn)行發(fā)酵檢測(cè)，并以野生型DSM 7029 作為陰性對(duì)照。利用HPLC-MS 對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行分析。HPLCMS結(jié)果顯示，所有帶有BGC18的突變體均產(chǎn)生了兩個(gè)顯著的化合物峰m/z227［M+H］+、241［M+H］+，且這些峰在陰性對(duì)照中未發(fā)現(xiàn)，推測(cè)是BGC18 在DSM 7029中表達(dá)的產(chǎn)物（圖4）。

圖4 BGC18在S.brevitalea DSM 7029中的異源表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)C-MS分析（BPC+：m/z 200～300）Fig.4 LC-MS analysis for the heterologous products of BGC18 expressed in S.brevitalea DSM 7029

2.3 產(chǎn)物的分離純化

將突變菌株DSM7029：Pkm-BGC18采用CYMG培養(yǎng)基批量發(fā)酵10 L，大孔樹(shù)脂XAD-16 吸附目標(biāo)化合物，然后用甲醇提取發(fā)酵粗提物。發(fā)酵粗提物首先經(jīng)過(guò)正相硅膠柱色譜分離，干法上樣，以CH2Cl2-MeOH為流動(dòng)相，梯度洗脫（100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1），得到 5 個(gè)分組分 Fr1～Fr5。液質(zhì)檢測(cè)將含有目標(biāo)化合物的組分Fr3 繼續(xù)通過(guò)反相中壓液相色譜制備，水和甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫。最終通過(guò)HPLC 制備，30%乙腈水溶液恒梯度洗脫得到化合物1（33 mg），40%乙腈水溶液恒梯度洗脫得到化合物2（7 mg）和化合物3（4 mg）。

2.4 化合物1-3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 為白色固體，陽(yáng)離子質(zhì)譜ESⅠMS 在m/z227.0 處給出［M+H］+分子離子峰，結(jié)合化合物的一維1H 譜、13C 譜（表4）可以得到化合物分子式為C12H12O2N2。分析13C NMR，DEPT 譜發(fā)現(xiàn)，化合物 1 具有 2 個(gè)酰胺羰基（δC167.6，165.1）；4個(gè)次甲基（δC60.1，59.2，32.6，25.1）；1個(gè)亞甲基 （δC42.7）；5 個(gè)甲基 （δC32.1，23.1，21.8，19.2，18.0）其中1 個(gè)與氮相連；進(jìn)一步通過(guò)HMBC二維核磁數(shù)據(jù)確定化合物1的結(jié)構(gòu)與已知有機(jī) 合 成 中 間 體 Cyclo （N-Me-L-Leu-L-Val） 相同［43-44］（圖5），但是其核磁數(shù)據(jù)未見(jiàn)報(bào)道，因此對(duì)其核磁數(shù)據(jù)H和C譜進(jìn)行了解析與指認(rèn)（表4）。

化合物2 和3 均為白色固體，陽(yáng)離子質(zhì)譜ESⅠMS 在m/z241.0 處給出［M+H］+分子離子峰，提示化合物分子式為C13H24O2N2比1 多一個(gè)CH2。與化合物1 的氫譜數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)（表4），化合物2中的兩個(gè)氨基酸均為亮氨酸（Leu）。進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)化合物2 為已知有機(jī)合成中間體Cyclo（N-Me-L-Leu-L-Leu）（圖 5）［45］?；衔?3 與化合物2 的氫譜數(shù)據(jù)非常類似，除了一個(gè)二重峰（d）的甲基變成了三重峰（t）的甲基（δH0.84）以及一個(gè)與氮相連的CH 信號(hào)由dt 峰變?yōu)閐d 峰（δH3.61），這就表明化合物3中的氨基酸為Ⅰle，為新化合物（圖5）。采用Marfey 法對(duì)氨基酸的絕對(duì)構(gòu)型進(jìn)行了確定，4 種氨基酸（N-Me-Leu、Val、Leu、Ⅰle）均為L(zhǎng)構(gòu)型（表5）。

表5 化合物1～3氨基酸與marfey試劑衍生產(chǎn)物的保留時(shí)間Tab.5 Retention time of amino acids derivatized with Marfey's reagent

圖5 化合物1～3的結(jié)構(gòu)式及化合物1的HMBC相關(guān)信號(hào)Fig.5 Structures of 1～3 and HMBC correlations of 1

表4 化合物1～3的NMR核磁數(shù)據(jù)Tab.4 1H(500 MHz)and13C(125 MHz)data of 1～3 in DMSO-d6

2.5 化合物1～3 的生物合成途徑分析

根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)及其生物合成基因簇的生信分析，對(duì)化合物1～3 的生物合成途徑進(jìn)行了推測(cè) （圖 6）。A1結(jié)構(gòu)域可識(shí)別 L 型的 Val/Leu/Ⅰle。A2結(jié)構(gòu)域可識(shí)別的L-Leu，然后經(jīng)過(guò)N-甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化修飾后形成N-Me-Leu。兩部分經(jīng)過(guò)縮合與TE 介導(dǎo)的環(huán)化，最終形成化合物1～3 的完整結(jié)構(gòu)。盡管該基因簇含有PKS 模塊，推測(cè)可能因?yàn)槿鄙貾KS 所必需的T 結(jié)構(gòu)域?qū)е翽KS 模塊被跳過(guò)，從而只獲得了NRPS 指導(dǎo)合成的環(huán)二肽產(chǎn)物1～3。

圖6 化合物1～3生物合成途徑推測(cè)Fig.6 Proposed biosynthetic pathway of 1～3

2.6 化合物1～3 的抗菌活性測(cè)試

本研究采用96孔板二倍稀釋法［35］測(cè)定了化合物1～3 對(duì)下列指示菌株（E. coliATCC 35218、P.aeruginosaATCC 27853、Staphylococcus aureusATCC 29213、Bacillus subtilisATCC 6633、Helicobacter pyloriG27、H.pylori159、Enterococcus faecalisATCC 19434、Mycobacterium smegmatisATCC 607、Candida albicansSC5314）的抗菌活性，結(jié)果顯示化合物1～3 對(duì)所測(cè)菌株均無(wú)抑制作用（MⅠC＞32 μg/mL）。

3 結(jié) 論

基因組信息分析表明，纖維堆囊菌So0157-2基因組中含有豐富的未知功能的基因簇，特別是含有大量通常具有良好生物活性的PKS、NRPS 或兩者雜合的基因簇，預(yù)示著該菌株仍具有產(chǎn)生新穎天然產(chǎn)物的潛力。BGC18 即為該菌基因組中預(yù)測(cè)的一個(gè)NRPS-PKS 雜合的基因簇，大小約為26.7 kb。該基因簇中NRPS 模塊的核心基因預(yù)測(cè)含有兩個(gè)A 結(jié)構(gòu)域，其中A2結(jié)構(gòu)域被預(yù)測(cè)具有底物的專一性，而A1結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜锏淖R(shí)別具有寬泛性，因此該基因簇可能合成結(jié)構(gòu)多樣的二酮哌嗪類化合物。此外，該基因簇PKS模塊缺少T結(jié)構(gòu)域，這些底物能否通過(guò)NRPS和PKS的延伸單元被依次加載、縮合，形成的終產(chǎn)物最后被TE 結(jié)構(gòu)域釋放值得深入研究。然而，由于該菌株較難培養(yǎng)且自身未建立遺傳操作體系，因此將該生物合成基因簇轉(zhuǎn)移到合適的異源宿主中，利用異源表達(dá)策略是激活該生物合成基因簇挖掘其次級(jí)代謝產(chǎn)物的一個(gè)有效途徑。異源表達(dá)成功的關(guān)鍵主要涉及基因簇的克隆與遺傳修飾以及異源宿主的合理選擇。本課題組已經(jīng)建立了以Red/ET DNA 同源重組技術(shù)為核心的生物合成基因簇直接克隆與遺傳修飾技術(shù)平臺(tái)，為天然產(chǎn)物的挖掘提供了技術(shù)支撐［21-28］?；虼卦诋愒幢磉_(dá)時(shí)，存在著密碼子偏好性的影響。選擇異源宿主時(shí)，首先考慮與原始生產(chǎn)菌在進(jìn)化地位上親緣關(guān)系相近的菌。本文中所選用的異源宿主S. brevitaleaDSM 7029 與纖維對(duì)囊菌So0157-2 均為變形菌門，GC 含量相似，分別為68%和72%［8，39］。前期，本課題組將纖維堆囊菌來(lái)源的埃博霉素成功地在該異源宿主S. brevitaleaDSM 7029 中進(jìn)行了表達(dá)，說(shuō)明兩株菌的密碼子有一定的兼容性［36］。此外，通過(guò)啟動(dòng)子工程改造以及額外補(bǔ)充稀有密碼子的tRNA 或者進(jìn)行密碼子優(yōu)化等也可以提高異源表達(dá)的概率［36-37］。

因此，本研究成功構(gòu)建了纖維堆囊菌So0157-2中基因簇的直接克隆與遺傳修飾體系，并將一個(gè)NRPS-PKS 雜合的基因簇BGC18 轉(zhuǎn)入異源宿主S.brevitaleaDSM 7029中實(shí)現(xiàn)了該基因簇的功能性表達(dá)，成功獲得了3個(gè)對(duì)應(yīng)的代謝產(chǎn)物。通過(guò)正相硅膠柱色譜和HPLC 分離純化，以及MS、NMR 解析了化合物的結(jié)構(gòu)。SciFinder 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索證實(shí)化合物1 和2 僅作為有機(jī)合成中間體被報(bào)道，為新天然產(chǎn)物，而化合物3為新化合物。BGC18為NRPSPKS 雜合基因簇，從結(jié)構(gòu)上看，化合物1～3 為二酮哌嗪類化合物，其所含氨基酸與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)一致，但是并未見(jiàn)PKS 單元。仔細(xì)分析PKS 相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)該基因簇缺少硫醇化結(jié)構(gòu)域，推測(cè)導(dǎo)致PKS不能有效組裝。化合物1～3結(jié)構(gòu)上差別主要為第1 個(gè)氨基酸的不同（1 Val， 2 Leu， 3 Ⅰle），這是由于第1 個(gè)腺苷化結(jié)構(gòu)域（A domain）對(duì)底物識(shí)別的非特異性所導(dǎo)致的。由A 結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜镒R(shí)別的寬泛性導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)多樣性也在我們前期分離獲得的多個(gè)脂肽類化合物得到證實(shí)［46-47］。基于Red/ET 重組工程技術(shù)的纖維堆囊菌So0157-2 隱性基因簇的直接克隆、修飾和異源表達(dá)體系的建立，不僅有助于進(jìn)一步了解該菌的生物合成潛力，而且能夠發(fā)現(xiàn)新穎的天然產(chǎn)物用于藥物篩選評(píng)價(jià)。

致謝：本工作得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFA0905 700）；國(guó)家自然科學(xué)基金（32070060，31670098）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2020QH345，ZR2019JQ11）的支持。