張萍，魏文平，周英，葉邦策，

（1 華東理工大學(xué)微分析與生物系統(tǒng)工程實(shí)驗(yàn)室，生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2 浙江工業(yè)大學(xué)工程生物學(xué)與健康研究中心，長(zhǎng)三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，藥學(xué)院，浙江 杭州 310014）

人工構(gòu)建的調(diào)控元件是改造細(xì)胞可控地生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的重要改造工具［1-2］，光誘導(dǎo)型傳感器作為一類重要的控制元件，在底盤細(xì)胞的工程化改造過(guò)程中展現(xiàn)出很好的應(yīng)用潛力［3-4］。之前傳統(tǒng)的基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)雖然可高效快速地得到目標(biāo)產(chǎn)物，但由于一些化學(xué)型誘導(dǎo)劑價(jià)格昂貴、易產(chǎn)生細(xì)胞毒性、難清除等缺陷，限制其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用；光作為一種誘導(dǎo)因子具有快速無(wú)毒，可將誘導(dǎo)信號(hào)迅速地傳遞至細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)勢(shì)，在不改變宿主代謝條件的前提下，可實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)基因時(shí)間空間上的精確表達(dá)，具有較好的應(yīng)用潛力。在實(shí)際操作中可根據(jù)光照強(qiáng)度和時(shí)間，調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因的表達(dá)水平［5］，或者通過(guò)切換光照和黑暗條件，使光效應(yīng)蛋白發(fā)生光依賴型的構(gòu)象變化，從而達(dá)到可逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)效果。 Zhao 等在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中引入光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，將異丁醇的產(chǎn)量提高到（8.49±0.31）g/L［6］；之后為了克服持續(xù)性產(chǎn)物代謝途徑激活產(chǎn)生的不良后果，如與初級(jí)代謝的能量競(jìng)爭(zhēng)及有毒中間代謝產(chǎn)物積累等造成細(xì)胞生物量下降等負(fù)面影響，他們以脫氧核糖乙酸合成途徑為模型，利用光遺傳控制對(duì)酵母細(xì)胞代謝進(jìn)行區(qū)域化動(dòng)態(tài)調(diào)控，通過(guò)降低中間代謝產(chǎn)物濃度和減少競(jìng)爭(zhēng)途徑能量流消耗，最終使產(chǎn)物合成產(chǎn)量提高了6 倍［7］。此外，Tandar 等［8］通過(guò)對(duì)葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的光控表達(dá)，調(diào)節(jié)EMP/PPP 流量比，優(yōu)化前體和還原力供給，并最終在光控傳感器的作用下提高了甲羥戊酸等產(chǎn)物的產(chǎn)量。但如何選擇具有應(yīng)用優(yōu)勢(shì)且適配性好的底盤細(xì)胞仍是限制光控傳感器開(kāi)發(fā)的首要 問(wèn) 題 之 一［9-10］。 解 脂 耶 氏 酵 母（Yarrowia lipolytica）是非常規(guī)酵母中最具代表性的一種，是近年應(yīng)用較為廣泛的一種底盤細(xì)胞［11-14］，具有利用底物譜廣，安全性高，耐酸及有機(jī)溶劑，在代謝過(guò)程中可大量產(chǎn)生合成聚酮類、黃酮類和萜類化合物所必需的前體物acetyl-CoA 和malonyl-CoA 等眾多優(yōu)勢(shì)［11，15-25］，已被廣泛應(yīng)用于多種食品及藥品的發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域。目前，在Y. lipolytica中已經(jīng)成功地開(kāi)發(fā)了脂肪酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子［26］、銅離子響應(yīng)傳感器［27］和木糖誘導(dǎo)型傳感器［28］等調(diào)控元件，但還未見(jiàn)時(shí)空動(dòng)態(tài)調(diào)控元件的報(bào)道，光誘導(dǎo)型傳感器在一定程度上可以彌補(bǔ)這一缺陷。本研究中利用的光敏調(diào)控系統(tǒng)來(lái)自于革蘭氏陰性細(xì)菌（如Myxococcus xanthus、Thermus thermophilus），是一套細(xì)菌自發(fā)的防御機(jī)制，目的是保護(hù)自身免受光的氧化。在這些生物體中，CarH 是一種光響應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)控胡蘿卜素基因簇的表達(dá)，而它的活性和光敏性依賴于腺苷鈷胺素（AdoB12）。Chatelle 等［4］利用T.thermophilus來(lái)源的 CarH 及其同源DNA操縱序列CarO在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中構(gòu)建了一套光控轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)；經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子中CarO的數(shù)量等參數(shù)優(yōu)化，可以實(shí)現(xiàn)350倍的誘導(dǎo)倍數(shù)；此研究展現(xiàn)出這一系統(tǒng)在真核系統(tǒng)中的應(yīng)用前景。

對(duì)香豆酸和柚皮素主要來(lái)源于植物，具有多種保健功效，而從植物中提取受季節(jié)和產(chǎn)地等多種因素影響較大，利用微生物法合成具有顯著優(yōu)勢(shì)，如生產(chǎn)強(qiáng)度高、反應(yīng)條件溫和、成本低廉等。對(duì)香豆酰-CoA 是白藜蘆醇、柚皮素、芹菜素、野黃芩素等黃酮類化合物以及生物堿等天然產(chǎn)物的合成前體，而對(duì)香豆酸是合成對(duì)香豆酰-CoA 的必要前體物質(zhì)，對(duì)高效生物合成眾多天然活性產(chǎn)物具有重要的意義［18-19，29-32］。對(duì)香豆酸又名對(duì)羥基肉桂酸（CAS號(hào)：501-98-4），是植物苯丙烷途徑的上游代謝物，具有強(qiáng)大的抗氧化、抗菌和抗炎特性，也是多種功能活性成分的前體物質(zhì)［29-30］。柚皮素就是其中的一種重要衍生物，屬于天然黃酮類的化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒等多種重要的藥理活性，具有重要的應(yīng)用價(jià)值［18］。由于兩者都來(lái)源于植物，來(lái)源受限，有必要利用合成生物學(xué)方法，通過(guò)代謝工程手段，實(shí)現(xiàn)植物來(lái)源天然產(chǎn)物在微生物中的異源高效合成；然而，微生物底盤細(xì)胞的改造過(guò)程受制于高效調(diào)控元件的限制，發(fā)掘性能優(yōu)良、適配性好的多樣化調(diào)控元件，有助于實(shí)現(xiàn)不同來(lái)源天然產(chǎn)物在微生物細(xì)胞中的生產(chǎn)。

本研究利用細(xì)菌來(lái)源的CarH 作為綠光誘導(dǎo)因子［4］，以 VPRH 結(jié)構(gòu)域［28］為轉(zhuǎn)錄激活因子，在真核細(xì)胞Y. lipolytica中構(gòu)建基于復(fù)合因子CarHVPRH 為綠光響應(yīng)元件的光控表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在綠光和黑暗條件下對(duì)報(bào)告基因mcherry進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并且具有及時(shí)響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控優(yōu)勢(shì)；在此基礎(chǔ)上，將其應(yīng)用于Y. lipolytica中構(gòu)建對(duì)香豆酸及柚皮素的光誘導(dǎo)型合成途徑。實(shí)現(xiàn)在綠光及黑暗條件下對(duì)合成途徑的干預(yù)性調(diào)控，有利于動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)前體及產(chǎn)物合成，平衡細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物積累之間的關(guān)系，為Y. lipolytica的光誘導(dǎo)型元件的開(kāi)發(fā)提供了可精準(zhǔn)動(dòng)態(tài)調(diào)控的傳感器工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

本研究使用的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。本研究合成的引物序列見(jiàn)表2。

表1 本研究所用的質(zhì)粒和菌株Tab.1 Plasmids and strains used in this study

表2 本研究中使用的引物Tab.2 Primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

YNB-Leu 固體培養(yǎng)基（100 mL）：酵母基礎(chǔ)氮源（yeast nitrogen base W/O）0.67 g，葡萄糖1 g，L-亮氨酸0.05 g，瓊脂2 g。

YNB 固體培養(yǎng)基（100 mL）：酵母基礎(chǔ)氮源0.67 g，葡萄糖1 g，瓊脂2 g。

YPD 液體培養(yǎng)基（100 mL）：蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，酵母提取物1 g。

1.1.3 主要試劑和儀器

試劑：限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；高保真聚合酶（Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase）購(gòu)自南京諾唯贊公司；LB 培養(yǎng)基、瓊脂及葡萄糖購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；蛋白胨及酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOⅠD 公司；酵母基礎(chǔ)氮源及L-亮氨酸購(gòu)自Solarbio 公司；腺苷鈷胺素（coenzyme B12）購(gòu)自阿拉丁公司；酵母轉(zhuǎn)化試劑盒Frozen-EZ yeast transformation Ⅱ 購(gòu) 自 ZYMO RESEARCH 公司；PCR 純化試劑盒及同源重組試劑盒購(gòu)自全式金（北京）生物技術(shù)有限公司。

儀器：上海精宏電熱恒溫培養(yǎng)箱；上海精宏恒溫?fù)u床；Biotek Synergy2 多功能酶標(biāo)儀；島津Prominence-ⅠLC-2030 系列高液相色譜儀；艾瑞嘉LED綠光燈10 W（520～530 nm）；尼康激光共聚焦顯微鏡。

1.2 質(zhì)粒設(shè)計(jì)與構(gòu)建

1.2.1 信號(hào)輸出模塊構(gòu)建

以pSET152-Pj23119-2CarO-GFP 質(zhì)粒為模板，使 用 引 物 SalⅠ-Pj23119F 和 CarO-TEF-R 擴(kuò) 增 得 到2CarO；以p13-Tm 質(zhì)粒為模板，使用引物CarOTEF-F 和 StuⅠ-XPR2-277R 擴(kuò) 增 得 到 TEF-mCherry-XPR2； 以 2CarO 和 TEF-mCherry-XPR2 為 模 板 ，使用引物 SalⅠ-Pj23119F 和 StuⅠ-XPR2-277R 進(jìn)行融合PCR，得到2CarO-TEF-mCherry-XPR2。此片段即為含有CarO 位點(diǎn)、TEF 核心啟動(dòng)子序列和報(bào)告基因mCherry的信號(hào)輸出模塊。

1.2.2 激活因子復(fù)合體CarH-VPRH 的表達(dá)模塊構(gòu)建

以pUC57-CarH 質(zhì)粒為模板， 使用引物1312CarH-F 和 CarH-VPRH-R 擴(kuò)增得到 CarH（GeneⅠD：3169555）；以 pUC57-VPRH 質(zhì)粒為模板，使用引物 CarH-VPRH-F 和 KpnⅠHSF1-R，擴(kuò)增得到VPRH［28］； 以 CarH 和 VPRH 為 模板 ，使 用 引 物1312CarH-F 和 KpnⅠHSF1-R 進(jìn)行融合 PCR，得到CarH-VPRH。用限制性核酸內(nèi)切酶PmlⅠ和KpnⅠ酶切pⅠNA1312 質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物使用PCR 純化試劑盒純化。將CarH-VPRH 插入到上述酶切pⅠNA1312質(zhì)粒中以構(gòu)建質(zhì)粒p13-CV。

1.2.3 綠光響應(yīng)質(zhì)粒p13-CV-2CarO-Tm構(gòu)建

用限制性核酸內(nèi)切酶SalⅠ和StuⅠ酶切p13-CV 質(zhì)粒，并將片段2CarO-TEF-mCherry-XPR2 通過(guò)同源重組的方式插入到上述位點(diǎn)中（SalⅠ和StuⅠ）以構(gòu)建質(zhì)粒p13-CV-2CarO-Tm。

1.2.4 對(duì)香豆酸合成質(zhì)粒p13-CV-2CarO-TAL構(gòu)建

以p13PxoTAL 質(zhì)粒為模板，使用引物TEFTAL-F 和 StuⅠ-XPR2-277R 擴(kuò)增得到 TAL；使用引物 SalⅠ-Pj23119F 和 StuⅠ-XPR2-277R，將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子2CarO-TEF 與 TAL 進(jìn)行融合 PCR，得到2CarO-TEF-TAL，并通過(guò)同源重組的方式組裝到SalⅠ和StuⅠ雙酶切的p13-CV 質(zhì)粒中以構(gòu)建質(zhì)粒p13-CV-2CarO-TAL。

1.2.5 柚皮素合成質(zhì)粒p12-4CC構(gòu)建

以p12-4CL 質(zhì)粒為模板，使用引物1269-SpeⅠ-XPR2-F 和 FBAin-CYCt-R 擴(kuò) 增 得 到 FBAin-4CL；以pCas-AXPCHSCHⅠ質(zhì)粒為模板，使用引物FBAin-CYCt-F 和 1269-SpeⅠ-XPR2-R 擴(kuò) 增 得 到CHS-Pexp1-FBAin-CHⅠ。用限制性核酸內(nèi)切酶SpeⅠ酶切pⅠNA1269 質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物使用PCR 純化試劑盒純化。將FBAin-4CL 和CHS-Pexp1-FBAin-CHⅠ通過(guò)多片段同源重組的方式組裝到SpeⅠ酶切的pⅠNA1269質(zhì)粒中以構(gòu)建質(zhì)粒p12-4CC。

1.3 酵母重組菌構(gòu)建

本研究使用的骨架質(zhì)粒pⅠNA1312和pⅠNA1269需要酶切線性化處理后轉(zhuǎn)入Po1f 菌株。酶切線性化體系（200 μL）：超純水洗脫的質(zhì)粒溶液140 μL，緩 沖 液 0.1% BSA、 10×H Buffer、 0.1% Triton各 20 μL，內(nèi)切酶NotⅠ 3 μL。反應(yīng)條件 37 ℃水浴4 h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，使用PCR 純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，最后用50～80 μL 超純水洗脫酶切線性質(zhì)粒并用于酵母轉(zhuǎn)化。酵母轉(zhuǎn)化步驟參考轉(zhuǎn)化試劑盒Frozen-EZ yeast transformation Ⅱ的試劑比例和操作步驟。待轉(zhuǎn)化步驟結(jié)束后，將酵母菌液涂布在YNB-Leu 或YNB 固體平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h。

1.4 菌株的篩選和培養(yǎng)

轉(zhuǎn)化篩選和純化培養(yǎng)含有pⅠNA1312 衍生質(zhì)粒的菌株的培養(yǎng)基為YNB-Leu固體培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步轉(zhuǎn)化質(zhì)粒p12-4CC的菌株的培養(yǎng)基為YNB固體培養(yǎng)基。菌株種子液的培養(yǎng)以及光誘導(dǎo)培養(yǎng)基為YPD 液體培養(yǎng)基。挑選能夠在YNB-Leu 或YNB固體平板上生長(zhǎng)的酵母單菌落于裝有1.2 mL YPD液體培養(yǎng)基（含20 μmol/L 腺苷鈷胺素）的24 孔的深孔板（有不透光的蓋子覆蓋，可視為黑暗條件），并于30 ℃、220 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h。48 h后各孔吸取700 μL 菌液測(cè)定熒光值（RFU）和600 nm 處的光密度（OD600），以此熒光強(qiáng)度較高的菌株作為能夠發(fā)揮CarH-VPRH激活作用的菌株。

1.5 光誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)接含有光控傳感器質(zhì)粒的Y. lipolytica進(jìn)行綠光響應(yīng)性能測(cè)試。以不包裹錫箔紙的透明的錐形瓶作為誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組，以包裹錫箔紙的錐形瓶作為黑暗條件實(shí)驗(yàn)組。培養(yǎng)基為YPD（含20 μmol/L腺苷鈷胺素），裝液量為5/25（25 mL 錐形瓶中裝有5 mL 的 YPD 培養(yǎng)基）。在裝有綠光燈（520～530 nm）的恒溫?fù)u床（30 ℃，220 r/min）中培養(yǎng)，錐形瓶和綠光燈的距離為12 cm，培養(yǎng)72 h，取樣測(cè)定RFU 與OD600值，評(píng)價(jià)誘導(dǎo)效果。培養(yǎng)測(cè)試時(shí)按照種子液OD600=5，接種量1%的條件接種培養(yǎng)。種子液培養(yǎng)條件為：30 ℃，220 r/min，YPD 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。

1.6 腺苷鈷胺素濃度優(yōu)化

對(duì)CarH-VPRH 發(fā)揮激活作用所必需的腺苷鈷胺素的濃度進(jìn)行優(yōu)化。以Yl-CVH 為測(cè)試菌株，其培養(yǎng)條件同光誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，并設(shè)置腺苷鈷胺素濃度梯度為：0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L，每個(gè)濃度梯度分別設(shè)置光照組和黑暗組。培養(yǎng)48 h，取樣700 μL菌液測(cè)定RFU與OD600值。

1.7 綠光響應(yīng)傳感器的動(dòng)態(tài)響應(yīng)實(shí)驗(yàn)

接種綠光響應(yīng)菌株Yl-CVH 進(jìn)行綠光響應(yīng)傳感器動(dòng)態(tài)響應(yīng)光照條件變化的性能測(cè)試。對(duì)Yl-CVH設(shè)置3 組不同光照條件：①0～24 h 綠光照射，24～36 h 黑暗，36～48 h 綠光照射，48～60 h 黑暗，60～72 h 綠光照射，72～84 h 黑暗，84～96 h綠光照射，96～108 h 黑暗，108～120 h 綠光照射；②始終綠光照射；③始終黑暗，同時(shí)進(jìn)行光誘導(dǎo)培養(yǎng)（方法參照1.5），并均在0 h、24 h、48 h、72 h 和 96 h 補(bǔ) 加 15 μmol/L 腺 苷 鈷 胺 素 。 培 養(yǎng)120 h，每隔12 h取樣測(cè)定RFU與OD600值。

1.8 對(duì)香豆酸合成菌株構(gòu)建與產(chǎn)量測(cè)定

本研究選擇來(lái)自黏紅酵母（Rhodotorula glutinis）的酪氨酸解氨酶（tyrosine ammonia lyase，TAL）編碼基因tal（GenBank：KF765779.1）［33］，將其置于光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子下游并構(gòu)建工程菌株，以工程菌株的對(duì)香豆酸合成產(chǎn)量為考察指標(biāo)，測(cè)試綠光響應(yīng)系統(tǒng)在天然產(chǎn)物合成方面的潛力。菌株P(guān)o1f 中轉(zhuǎn)入經(jīng)過(guò)線性化處理的p13-CV-2CarO-TAL 質(zhì)粒（步驟如1.3 和1.4），以得到對(duì)香豆酸合成菌株Yl-CA。對(duì)Yl-CA 設(shè)置3 組不同的光照條件：①始終綠光照射；②始終黑暗；③0～48 h 黑暗，48 h 后綠光照射，同時(shí)進(jìn)行光誘導(dǎo)培養(yǎng)（方法參照1.5），培養(yǎng)96 h并取樣利用HPLC檢測(cè)對(duì)香豆酸產(chǎn)量。具體檢測(cè)方法可參照Wei等［34］建立的檢測(cè)方法。

1.9 柚皮素合成菌株構(gòu)建與產(chǎn)量測(cè)定

在對(duì)香豆酸合成菌株中進(jìn)一步引入來(lái)自擬南芥（Arabidopsis thaliana）的4-香豆酸輔酶A 連接酶（4-coumaroyl-CoA ligase，4CL）編碼基因4c（lGeneⅠD：841593）、 查 爾 酮 合 酶（chalcone synthase，CHS）編碼基因ch（sGene ⅠD：831241）、查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHⅠ）編碼基因ch（iGeneⅠD：830409）［33-35］，以實(shí)現(xiàn)柚皮素的從頭合成。菌株Yl-CA 中轉(zhuǎn)入經(jīng)過(guò)線性化處理的p12-4CC 質(zhì)粒（步驟如1.3 和1.4），得到柚皮素合成菌株Yl-NA。對(duì)Yl-NA 設(shè)置4 組不同的光照條件：①0～24 h 綠光照射，24 h 后黑暗；②0～48 h 綠光照射，48 h后黑暗；③始終綠光照射；④始終黑暗，同時(shí)進(jìn)行光誘導(dǎo)培養(yǎng)（方法參照1.5），4 組均在0 h 添加15 μmol/L 腺苷鈷胺素；其中①和②組分別在24 h和 48 h 再添加 15 μmol/L 腺苷鈷胺素，培養(yǎng) 96 h 并取樣利用HPLC檢測(cè)對(duì)香豆酸和柚皮素產(chǎn)量。具體檢測(cè)過(guò)程可參照Wei等［34］建立的檢測(cè)方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠光響應(yīng)傳感器的構(gòu)建

2.1.1 綠光響應(yīng)傳感器設(shè)計(jì)

本研究中應(yīng)用的光響應(yīng)元件CarH 是一種綠光響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子［36］。CarH 的 DNA 結(jié)合活性和光敏性依賴于輔酶脫氧腺苷鈷胺素（AdoB12）。在無(wú)光條件下，AdoB12連接的CarH四聚體與啟動(dòng)子序列的CarO 位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Chatelle 等［4］利用真核細(xì)胞通用型的激活結(jié)構(gòu)域的激活性能，設(shè)計(jì)了CarHVP64 復(fù)合體，將其原本對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的抑制作用改造為轉(zhuǎn)錄激活作用。同理，鑒于底盤細(xì)胞Y. lipolytica的真核特性，也可以基于真核細(xì)胞通用的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域來(lái)構(gòu)建具有轉(zhuǎn)錄激活功能的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)元件。為此，選用已在Y.lipolytica中驗(yàn)證激活功能的VPRH復(fù)合激活結(jié)構(gòu)域作為轉(zhuǎn)錄激活組件［28］，構(gòu)建復(fù)合型CarH-VPRH 轉(zhuǎn)錄因子。利用組成型表達(dá)（hp4d 啟動(dòng)子）CarH-VPRH 因子的模塊和報(bào)告基因輸出模塊，設(shè)計(jì)構(gòu)建綠光響應(yīng)傳感器質(zhì)粒［圖1（a）］。在綠光照射條件下，AdoB12的Co-C 鍵被破壞，CarH-VPRH 四聚體解離，因此無(wú)法再結(jié)合誘導(dǎo)型啟動(dòng)子2CarO-TEF，進(jìn)而使綠光響應(yīng)系統(tǒng)處于“Off”狀態(tài)［圖1（b）］；當(dāng)傳感菌株處在黑暗條件下，CarH-VPRH 四聚體會(huì)靶向結(jié)合到2CarO-TEF啟動(dòng)子，進(jìn)而借助VPRH的轉(zhuǎn)錄激活功能強(qiáng)化下游基因的表達(dá)，使綠光響應(yīng)系統(tǒng)處于活躍的“On”狀態(tài)［圖1（c）］。

hp4d啟動(dòng)子屬于人工合成的復(fù)合型啟動(dòng)子［37］，含有Leu核心啟動(dòng)子序列以及來(lái)源于XPR2啟動(dòng)子的UAS 序列［38］，能夠有效地驅(qū)動(dòng)下游 CarH-VPRH 的表達(dá)，進(jìn)而為胞內(nèi)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制基因的激活表達(dá)提供足夠的CarH-VPRH因子。驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子由TEF啟動(dòng)子序列中的TATA box上游的CarO 位點(diǎn)和核心啟動(dòng)子Ptef 組成。在TATA box上游插入CarO位點(diǎn)的設(shè)計(jì)避免了對(duì)TATA box等核心元件區(qū)域的破壞，減小外源插入序列對(duì)啟動(dòng)子活性的影響。基于上述元件構(gòu)建的綠光響應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Y.lipolyticaPo1f菌株后，分別測(cè)試菌株在綠光照射與黑暗條件下的紅色熒光信號(hào)，考察傳感菌株對(duì)于綠光誘導(dǎo)的敏感性。結(jié)果如［圖2（a）］所示，在綠光照射的條件下，菌株在608 nm處沒(méi)有對(duì)應(yīng)的特異熒光發(fā)射譜；而在無(wú)光條件下存在明顯的熒光發(fā)射譜。結(jié)果表明復(fù)合因子CarH-VPRH在無(wú)光條件下能夠靶向結(jié)合到誘導(dǎo)型啟動(dòng)子上并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用［圖1（c）］，且熒光信號(hào)輸出強(qiáng)度顯著高于綠光（P＜0.01）［圖2（b）］，差異高達(dá)43倍。此結(jié)果表明本研究構(gòu)建的綠光響應(yīng)傳感器具有良好的綠光響應(yīng)性能。

圖1 綠光響應(yīng)傳感器的設(shè)計(jì)Fig.1 Design of the green light response sensor

圖2 綠光響應(yīng)傳感器的性能表征Fig.2 Performance of the green light response sensor

鑒于本研究選用的綠光感應(yīng)蛋白CarH 的DNA結(jié)合能力受到腺苷鈷胺素（cobamide vitamin B12）濃度的影響，進(jìn)一步考察了腺苷鈷胺素濃度與熒光信號(hào)輸出強(qiáng)度之間的關(guān)系。如［圖2（c）］所示，Y1-CVH菌株發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，當(dāng)腺苷鈷胺素的濃度在5～20 μmol/L時(shí)，綠光照射和黑暗實(shí)驗(yàn)組間的信號(hào)輸出具有顯著的差異。當(dāng)濃度為15 μmol/L 時(shí)，輸出信號(hào)達(dá)到最大值?；谙佘这挵匪貪舛鹊挠绊懞凸饪匦?yīng)，本研究構(gòu)建的光控系統(tǒng)具有開(kāi)發(fā)為響應(yīng)二元因素的邏輯門傳感器的潛力，即可以通過(guò)同時(shí)控制腺苷鈷胺素的濃度和光照條件來(lái)實(shí)現(xiàn)不同的調(diào)控效果。同時(shí)，鑒于腺苷鈷胺素的成本問(wèn)題以及腺苷鈷胺素添加對(duì)于產(chǎn)物后續(xù)純化等步驟的影響，基于CarH因子的傳感系統(tǒng)，將來(lái)有必要通過(guò)CarH蛋白結(jié)構(gòu)的定向進(jìn)化改善CarH 與腺苷鈷胺素的親和力、最低飽和濃度等參數(shù)，以減少腺苷鈷胺素的添加濃度，對(duì)推廣CarH系統(tǒng)的應(yīng)用具有重要意義。

2.1.2 綠光響應(yīng)傳感器對(duì)光照條件的動(dòng)態(tài)響應(yīng)

為考察綠光響應(yīng)傳感器對(duì)光照條件變化動(dòng)態(tài)響應(yīng)的靈敏度，在菌株Y1-CVH表達(dá)熒光蛋白的階段（24～120 h），每隔12 h對(duì)光照條件進(jìn)行了切換，同時(shí)考慮到光照對(duì)腺苷鈷胺素的降解作用，在將光照條件由綠光照射切換為黑暗時(shí)，再補(bǔ)加15 μmol/L腺苷鈷胺素以確保黑暗條件下CarH-VPRH 的激活作用。通過(guò)菌體生長(zhǎng)量和熒光蛋白表達(dá)量的測(cè)定，得到綠光響應(yīng)傳感器的動(dòng)態(tài)響應(yīng)曲線（圖3）。結(jié)果如圖3（a）所示，光照條件動(dòng)態(tài)切換組與始終綠光照射組和始終黑暗組的菌株生長(zhǎng)量隨時(shí)間變化趨勢(shì)基本一致。紅色熒光蛋白動(dòng)態(tài)響應(yīng)光照條件變化的信號(hào)輸出如圖3（b）所示，對(duì)數(shù)期（0～24 h）的熒光蛋白表達(dá)量均較低，可能是由于處于生長(zhǎng)前期的細(xì)胞胞內(nèi)還沒(méi)有足量的CarH-VPRH 表達(dá)積累，從而使依賴于VPRH 轉(zhuǎn)錄激活性能的熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)度較低。始終黑暗組的熒光蛋白表達(dá)量在24～60 h內(nèi)迅速增加，并在生長(zhǎng)后期60～120 h 內(nèi)呈現(xiàn)持續(xù)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，表明此階段胞內(nèi)積累的CarH-VPRH已足夠激活熒光蛋白的高表達(dá)，在120 h 時(shí)，單位細(xì)胞熒光強(qiáng)度可達(dá)到4809.40。始終綠光照射組的熒光蛋白表達(dá)量則一直維持在較低水平，熒光信號(hào)強(qiáng)度在0～35 之間。光照條件動(dòng)態(tài)切換組在24 h 由綠光照射改為黑暗時(shí)，熒光蛋白表達(dá)量迅速增加，和始終黑暗組具有相同的速率，36 h再次切換為綠光照射時(shí)，熒光蛋白表達(dá)量基本保持不變，且在之后的6次光照條件切換中均保持同樣快速且靈敏的響應(yīng)，即黑暗條件下熒光蛋白持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)，綠光照射則能及時(shí)抑制熒光蛋白的表達(dá)，體現(xiàn)了綠光響應(yīng)傳感器對(duì)光照條件變化動(dòng)態(tài)響應(yīng)的高度靈敏性。該系統(tǒng)對(duì)綠光的快速響應(yīng)在時(shí)空上精確控制基因表達(dá)水平具有一定的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

圖3 綠光響應(yīng)傳感器對(duì)光照條件的動(dòng)態(tài)響應(yīng)Fig.3 Dynamic response of the green light response sensor to light conditions

2.1.3 綠光響應(yīng)傳感菌株的細(xì)胞成像

為更加直觀地分析綠光照射和黑暗條件對(duì)工程菌株的激活表達(dá)差異性，本實(shí)驗(yàn)采用尼康激光共聚焦顯微鏡對(duì)菌體進(jìn)行顯微成像（圖4）。根據(jù)2.2 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，收集經(jīng)過(guò)72 h 分別在光照和黑暗條件培養(yǎng)的工程菌株Y1-CVH，使胞內(nèi)的mcherry基因高效表達(dá)。如圖4所示，黑暗組對(duì)應(yīng)的菌株可明顯檢測(cè)到胞內(nèi)mCherry的信號(hào)，而綠光照射組幾乎沒(méi)有顯示出熒光，綠光響應(yīng)系統(tǒng)具有應(yīng)用于Y.lipolytica菌株目標(biāo)基因調(diào)控表達(dá)的能力。

圖4 綠光調(diào)控細(xì)胞成像Fig.4 Cell imagines regulated by green light irradiation

2.2 綠光響應(yīng)傳感器在對(duì)香豆酸及柚皮素合成中的應(yīng)用

2.2.1 綠光響應(yīng)傳感器在對(duì)香豆酸合成中的應(yīng)用

對(duì)香豆酸合成的其中一種方式是通過(guò)酪氨酸的解氨作用脫去氨基形成對(duì)香豆酸，酪氨酸解氨酶（TAL）是催化酪氨酸轉(zhuǎn)化為對(duì)香豆酸的關(guān)鍵限速酶。本研究利用綠光誘導(dǎo)型傳感器調(diào)控tal基因表達(dá)［圖5（a）］，構(gòu)建獲得一株對(duì)光誘導(dǎo)有顯著響應(yīng)的工程菌Yl-CA。通過(guò)HPLC 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)［圖5（b）］，綠光照射可明顯影響工程菌Yl-CA 的對(duì)香豆酸產(chǎn)量，在與對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間一致的13.7 min處，光照條件下產(chǎn)物峰面積明顯小于黑暗組。之后設(shè)置了3組不同的光照條件，考察了對(duì)香豆酸在96 h 發(fā)酵周期中的產(chǎn)量變化。從不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)量對(duì)比可知，隨著菌株培養(yǎng)時(shí)間的增加，對(duì)香豆酸產(chǎn)量增加，且Yl-CA 在3組不同光照條件下的對(duì)香豆酸產(chǎn)量具有明顯差異性。如圖5（c）所示，第1組始終保持黑暗條件的菌株在96 h對(duì)香豆酸產(chǎn)量為99.1 mg/L；第2組始終綠光照射的菌株在96 h 產(chǎn)量?jī)H為49.6 mg/L；第3 組0～48 h 黑暗，48 h 后保持綠光照射的菌株在96 h 對(duì)香豆酸產(chǎn)量為82.0 mg/L。黑暗條件與始終綠光誘導(dǎo)相比，對(duì)香豆酸產(chǎn)量有2倍的增加；當(dāng)48 h時(shí)將光照條件由黑暗轉(zhuǎn)變綠光照射時(shí)，對(duì)香豆酸的合成速率減緩，其終產(chǎn)量?jī)H達(dá)到始終黑暗條件下的82.7%，表明后期綠光照射對(duì)對(duì)香豆酸合成能達(dá)到一定的抑制效果。此策略可應(yīng)用于與目標(biāo)產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)相同前體的細(xì)胞內(nèi)必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成調(diào)控中，以達(dá)到平衡細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的目的。由于本研究中菌株的莽草酸途徑等前體合成通路未經(jīng)過(guò)全面系統(tǒng)改造，所以對(duì)香豆酸產(chǎn)量較低，但光誘導(dǎo)菌株產(chǎn)對(duì)香豆酸仍具有較大的提升空間。

圖5 綠光調(diào)控對(duì)香豆酸合成Fig.5 p-Coumaric acid synthesis regulated by green light irradiation

2.2.2 綠光響應(yīng)傳感器在柚皮素合成中的應(yīng)用

在前期對(duì)香豆酸合成可顯著響應(yīng)光照的基礎(chǔ)上，繼續(xù)探究光控對(duì)其衍生產(chǎn)物——柚皮素合成效果的影響［圖6（a）］。工程菌株Yl-NA 分別在光照和黑暗條件下，發(fā)酵96 h 后收集發(fā)酵液樣本進(jìn)行產(chǎn)物測(cè)定，可測(cè)得中間產(chǎn)物對(duì)香豆酸和終產(chǎn)物柚皮素的特異的色譜峰［圖6（b）］。之后設(shè)置四組不同光照條件，考察不同條件對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)量、對(duì)香豆酸和柚皮素產(chǎn)量的影響［圖6（c）～（e）］。結(jié)果顯示，發(fā)酵菌株Yl-NA 的生物量在光照組和黑暗組之間具有一定的差異［圖6（c）］。在產(chǎn)物合成方面，始終保持黑暗條件的菌株合成對(duì)香豆酸和柚皮素的能力強(qiáng)于始終綠光照射組［圖6（d）、（e）］，在96 h 時(shí)兩者的產(chǎn)量分別達(dá)到4.7 倍和2.6 倍的差異，其中終產(chǎn)物柚皮素在黑暗組條件下的產(chǎn)量最高可達(dá)到117.1 mg/L。為了進(jìn)一步考察不同光照時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化，設(shè)置前期分別綠光照射24 h 和48 h，之后在黑暗條件下繼續(xù)發(fā)酵的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果顯示，與始終光照處理的實(shí)驗(yàn)組相比，階段性切換光照條件的實(shí)驗(yàn)組中對(duì)香豆酸和柚皮素的合成產(chǎn)量明顯增加；特別在24 h 將綠光照射轉(zhuǎn)變?yōu)楹诎颠@一組，Yl-NA合成對(duì)香豆酸和柚皮素的能力明顯增強(qiáng)，且其對(duì)香豆酸合成能力略高于始終黑暗組，在96 h 時(shí)對(duì)香豆酸產(chǎn)量可達(dá)161.4 mg/L，比始終黑暗組高出1.2 倍，說(shuō)明該光控系統(tǒng)具有較好且靈敏的切換響應(yīng)。在柚皮素合成途徑中，對(duì)香豆酸濃度是柚皮素合成效率的第一個(gè)限速步驟，黑暗組和先光照24 h 再黑暗組中，對(duì)香豆酸產(chǎn)量明顯高于其他兩組［圖6（d）］，相對(duì)應(yīng)柚皮素的產(chǎn)量也較高［圖6（e）］，但由于CHS活性高低是限制柚皮素合成的第二個(gè)限速步驟［圖6（a）］［39］，所以對(duì)香豆酸高產(chǎn)的兩組在柚皮素產(chǎn)量上并沒(méi)有顯著區(qū)別，后續(xù)可將高活性的CHS 進(jìn)行光控元件構(gòu)建，達(dá)到解除兩個(gè)限速步驟的目的，使柚皮素的產(chǎn)量在光控條件下進(jìn)一步提升。此外，菌株Yl-NA 在綠光照射下的生長(zhǎng)量略高于黑暗組，且在綠光照射24 h 后切換至黑暗條件的處理組中，對(duì)香豆酸產(chǎn)量高于其他組，可能是前期短時(shí)間照射可以讓細(xì)胞更好地生長(zhǎng)，從而有利于后期產(chǎn)物的合成。這種結(jié)合培養(yǎng)條件或者生理代謝特征的可控表達(dá)策略，有利于提升工程菌株的合成性能。Lü 等［40］利用脂肪酸誘導(dǎo)型和柚皮素誘導(dǎo)型系統(tǒng)協(xié)調(diào)菌株生長(zhǎng)、脂肪酸基礎(chǔ)代謝與產(chǎn)物合成途徑共用malonyl-CoA 前體帶來(lái)的供需矛盾，促進(jìn)malonyl-CoA 衍生產(chǎn)物柚皮素的有效合成；Zhou等［41］在大腸桿菌（Escherichia coli）中利用對(duì)香豆酸傳感器和柚皮素傳感器協(xié)調(diào)產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系，最終將柚皮素產(chǎn)量提高到原始菌株的8.7 倍。后期研究中如果將環(huán)境因子（如光照）響應(yīng)系統(tǒng)和上述的中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物傳感器綜合使用，可進(jìn)一步提升工程菌株的合成潛力。綜合分析誘導(dǎo)型工具的應(yīng)用效果以及本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，光誘導(dǎo)合成通路的設(shè)計(jì)，在多步酶催化的天然產(chǎn)物合成方面具有較好的效果，并且在平衡細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成方面具有一定的潛力。同時(shí)，因?yàn)殍制に睾铣苫颍?cl，chs及chi）表達(dá)強(qiáng)度等參數(shù)未系統(tǒng)性優(yōu)化，導(dǎo)致部分對(duì)香豆酸積累及其下游產(chǎn)物轉(zhuǎn)化效率較低；為此在后續(xù)研究中一方面需探索光控表達(dá)模式在前體高效轉(zhuǎn)化利用方面的應(yīng)用策略，另一方面需系統(tǒng)優(yōu)化底盤細(xì)胞的合成途徑，以實(shí)現(xiàn)柚皮素等天然產(chǎn)物在Y. lipolytica底盤細(xì)胞中的高效生產(chǎn)。

圖6 綠光調(diào)控柚皮素合成Fig.6 Naringenin synthesis regulated by green light irradiation

3 結(jié)論

隨著合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展，如何構(gòu)建多樣化的生物傳感器來(lái)調(diào)控和檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物，定向改造代謝途徑提高產(chǎn)量及品質(zhì)越來(lái)越受到關(guān)注。在近幾十年中，多種化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)已在酵母細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用，并得到較好的效果，但由于化學(xué)誘導(dǎo)劑在培養(yǎng)過(guò)程中擴(kuò)散、無(wú)法去除且成本較高等缺陷，不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需求。而光與化學(xué)物質(zhì)相比，是一種理想的基因誘導(dǎo)劑，可以在特定的時(shí)間和空間進(jìn)行精確調(diào)控，并已得到了一定的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用［42-43］。本研究所使用的一種響應(yīng)綠光誘導(dǎo)抑制下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的光控元件CarH-VPRH，可以在真核細(xì)胞——解脂耶氏酵母中發(fā)揮功能，并且在還未充分優(yōu)化的條件下，黑暗和光照組的熒光信號(hào)在120 h時(shí)相差143 倍［圖3（b）］。通過(guò)每12 h 切換光照和黑暗處理，熒光信號(hào)可即時(shí)響應(yīng)光照且抑制和激活熒光蛋白的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)態(tài)精確調(diào)控的目標(biāo)［圖3（b）］。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，光控系統(tǒng)與細(xì)胞生長(zhǎng)量存在一定的相關(guān)性。在柚皮素和對(duì)香豆酸合成過(guò)程中，生長(zhǎng)量有較為明顯的差異［圖6（c）］，說(shuō)明代謝產(chǎn)物的積累會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，為了解除抑制效應(yīng)，可在產(chǎn)物生產(chǎn)到一定階段，加入光照進(jìn)行干預(yù)調(diào)控，停止產(chǎn)物轉(zhuǎn)化和積累，從而轉(zhuǎn)向細(xì)胞初級(jí)代謝，達(dá)到積累細(xì)胞生長(zhǎng)量的目的。Binder 等［44］在谷氨酸棒狀桿菌中利用光控生產(chǎn)朱欒倍半萜，獲得高產(chǎn)，由于朱欒倍半萜對(duì)菌體生長(zhǎng)有嚴(yán)重影響，通過(guò)光控在生長(zhǎng)期抑制朱欒倍半萜的合成，當(dāng)菌體達(dá)到一定密度后，用光誘導(dǎo)半萜合酶基因表達(dá)，從而在不影響菌體生長(zhǎng)情況下，獲得高產(chǎn)量的朱欒倍半萜。同樣，在我們生物合成某些生物質(zhì)產(chǎn)品過(guò)程中，通過(guò)精確調(diào)控光照時(shí)間和強(qiáng)度，可以尋找到代謝產(chǎn)物積累與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的動(dòng)態(tài)平衡，開(kāi)發(fā)動(dòng)態(tài)光照及無(wú)光的發(fā)酵調(diào)控策略，達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物產(chǎn)量的最大化。

綜上，本研究首次設(shè)計(jì)應(yīng)用于Y. lipolytica的光控誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠顯著地響應(yīng)綠光，有效調(diào)控靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。在天然產(chǎn)物合成中，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)調(diào)控細(xì)胞響應(yīng)綠光進(jìn)行對(duì)香豆酸及柚皮素產(chǎn)物合成的目標(biāo)，雖然目前搖瓶發(fā)酵水平與其他研究中的產(chǎn)量具有一定差距，但后續(xù)可以從光照強(qiáng)度、時(shí)間及代謝合成的區(qū)室化策略等方面進(jìn)一步優(yōu)化以提升目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。綠光誘導(dǎo)傳感器又一次重現(xiàn)了Y. lipolytica中原核轉(zhuǎn)錄因子與通用型激活結(jié)構(gòu)域協(xié)同設(shè)計(jì)并開(kāi)發(fā)外源轉(zhuǎn)錄因子衍生傳感器的方法的有效性［27］。后續(xù)對(duì)于傳感器的信號(hào)輸出規(guī)律、信號(hào)強(qiáng)度提升策略等還有待進(jìn)一步研究，促進(jìn)光誘導(dǎo)傳感器在Y. lipolytica的應(yīng)用。本研究初步建立了在Y. lipolytica中綠光調(diào)控抑制某一特定基因的轉(zhuǎn)錄的體系，后續(xù)可將這一策略推廣應(yīng)用于抑制與目標(biāo)產(chǎn)物合成競(jìng)爭(zhēng)性途徑的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的規(guī)?；a(chǎn)。

致謝：本研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“合成生物學(xué)”重點(diǎn)專項(xiàng)（2018YFA0900404；2020YFA0908800）和國(guó)家自然科學(xué)基金（31730004）的支持。