孫文濤，張昕哲，萬(wàn)盛通，王茹雯，李春，

（1 清華大學(xué)化工系，北京 100084；2 北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，北京 100101）

細(xì)胞色素P450 酶（P450）可催化碳?xì)滏I氧化、脫甲基、脫飽和等二十余類(lèi)反應(yīng)，在植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成中扮演著重要的角色，是萜烯化合物、生物堿及黃酮等多種天然產(chǎn)物合成中的關(guān)鍵修飾酶［1-2］，在高價(jià)值天然產(chǎn)物的異源合成中被廣泛研究和應(yīng)用［3-7］，比如重要保肝護(hù)肝藥物甘草次酸的合成過(guò)程中，CYP88D6 與CYP72A154 對(duì)骨架分子β-香樹(shù)脂醇C-11 與C-30 進(jìn)行連續(xù)氧化最終將其轉(zhuǎn)化成甘草次酸［8-9］。

P450 是一種含血紅素蛋白，利用分子氧及NAD（P）H 對(duì)底物進(jìn)行加氧反應(yīng)，根據(jù)P450 酶從NAD（P）H 獲取電子的方式不同可將其分為4 種類(lèi)型：Ⅰ型P450酶的氧化還原伴侶需要一個(gè)包含F(xiàn)AD的還原酶以及一個(gè)鐵氧還蛋白構(gòu)成；Ⅱ型P450酶的氧化還原伴侶為一個(gè)同時(shí)包含F(xiàn)MN和FAD結(jié)構(gòu)域的單一蛋白又稱P450還原酶（CPR）；Ⅲ型P450酶為自給自足的蛋白，其實(shí)質(zhì)為P450酶與氧化還原伴侶形成的多結(jié)構(gòu)域蛋白；Ⅳ型P450 酶可以直接從NAD（P）H中獲取電子，不需要額外的氧化還原伴侶蛋白或結(jié)構(gòu)域。其中細(xì)菌等原核生物來(lái)源的P450酶多為Ⅰ型和Ⅲ型，且通常為游離蛋白，動(dòng)物、植物等來(lái)源的P450酶多為Ⅱ型，且通常為膜蛋白，具有N端跨膜結(jié)構(gòu)域，比如甘草來(lái)源的CYP88D6 與CYP72A154［10］。

由于Ⅱ型P450 酶難以純化，因此目前對(duì)于其反應(yīng)特性調(diào)控的研究較少。基于同源建模等方法，張學(xué)禮課題組通過(guò)對(duì)來(lái)自于犁頭霉菌的CYP5311B2底物通道進(jìn)行改造提高其催化活性，使工程菌的氫化可的松產(chǎn)量提高了3倍［11］。Schele等通過(guò)同源建模和定點(diǎn)突變對(duì)鐵銹醇合酶CYP76AH1 以及11-羥基鐵銹醇合酶 CYP76AH4、 CYP76AH22、CYP76AH23、 CYP76AH24 進(jìn) 行 改 造 發(fā) 現(xiàn) 301、303以及478的氨基酸是決定11-羥基鐵銹醇合酶選擇性氧化鐵銹醇的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)［12］。當(dāng)前對(duì)于P450 催化特性調(diào)控的相關(guān)研究主要集中于可溶性的P450酶，如來(lái)自巨大芽孢桿菌的P450BM3［13-15］。研究人員通過(guò)對(duì)其活性口袋進(jìn)行重塑實(shí)現(xiàn)了其區(qū)域和立體選擇性的調(diào)控，可控合成了對(duì)苯二酚、2β-羥基睪丸酮等化合物，并進(jìn)一步拓寬了P450 酶催化反應(yīng)的范疇，成功實(shí)現(xiàn)了S—N 鍵、C—Si鍵、C—B 鍵的形成以及芳基烯烴的氮雜環(huán)丙烷化、卡賓向炔烴的轉(zhuǎn)移反應(yīng)等一系列新型反應(yīng)［16-19］。

為實(shí)現(xiàn)Ⅱ型P450 酶催化特性的調(diào)控，解決甘草次酸合成關(guān)鍵酶，來(lái)源于蒺藜狀苜蓿的CYP72A63（AB558146.1）催化的底物選擇性、區(qū)域選擇性以及氧化進(jìn)程不可控的問(wèn)題，提高甘草次酸合成特異性與合成效率。課題組前期通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的理性設(shè)計(jì)與釀酒酵母驗(yàn)證平臺(tái)，重塑了CYP72A63 的催化口袋，獲得高活性突變體CYP72A63（T338S）可對(duì) 11-氧-β-香樹(shù)脂醇 C-30 特異性的連續(xù)氧化，實(shí)現(xiàn)甘草次酸的可控合成。然而仍然無(wú)法解決其底物選擇性差的問(wèn)題，CYP72A 63（T338S）可同時(shí)對(duì)β-香樹(shù)脂醇以及 11-氧-β-香樹(shù)脂醇的C-30 進(jìn)行氧化，導(dǎo)致副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成。在酶改造過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，除了活性口袋重塑外，Ⅱ型P450 酶與其氧化還原伴侶CPR之間的相互作用可改變其催化活性以及選擇性，影響工程菌甘草次酸產(chǎn)量及產(chǎn)物譜［20］。這種現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在Ⅰ型P450 酶中，李盛英等通過(guò)重構(gòu)P450酶MycG與氧化還原伴侶的組合，重建了其催化功能，實(shí)現(xiàn)了4種新產(chǎn)物的合成［19］，這說(shuō)明P450酶催化系統(tǒng)組成成分之間的相互作用會(huì)對(duì)P450的催化特性產(chǎn)生顯著影響。由于Ⅱ型P450酶多定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，除CPR外，P450、CPR與膜之間的相互作用都可能對(duì)P450 酶催化特性產(chǎn)生影響［21］。為實(shí)現(xiàn)CYP72A63（T338S）底物選擇性的調(diào)控，本文對(duì)于跨膜域、膜組分代謝等因素對(duì)P450酶催化特性調(diào)控的影響進(jìn)行了研究，以期獲得能夠調(diào)控其底物選擇性的新方法，以CYP72A63（T338S）為對(duì)象，開(kāi)發(fā)Ⅱ型細(xì)胞色素P450酶催化選擇性調(diào)控的新策略。

1 材料與方法

1.1 菌株與Ⅱ型P450酶突變體

1.2 基因克隆與表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究中利用諾唯贊Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase 進(jìn) 行 PCR 擴(kuò) 增 ， PCR 產(chǎn) 物 用Thermo Scientific GeneJET 膠回收試劑盒進(jìn)行純化。通過(guò)吉布森組裝將啟動(dòng)子、基因、終止子、同源臂等按照需求進(jìn)行多片段組裝（成分如表1所示），構(gòu)建含有目標(biāo)表達(dá)盒的質(zhì)粒，隨后利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)并涂布到含有100 mg/L 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，置于37 ℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜。通過(guò)PCR驗(yàn)證，獲得條帶正確的質(zhì)粒由擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證后備用。

表1 本研究所涉及的菌種信息Tab.1 Strains used in this study

（1）5×ⅠSO緩沖液配制（表2）

表2 5×ⅠSO緩沖液組分Tab.2 Components of the 5×ⅠSO buffer

（2）Gibson反應(yīng)液配制（表3）

表3 Gibson反應(yīng)液組分Tab.3 Components of Gibson reaction solution

1.3 蛋白跨膜域預(yù)測(cè)

使用跨膜域預(yù)測(cè)軟件TMHMM對(duì)蛋白質(zhì)跨膜域進(jìn)行預(yù)測(cè)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）［22］。

1.4 酵母轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)

酵母轉(zhuǎn)化采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，將新鮮酵母宿主細(xì)胞接入2 mL YPD 培養(yǎng)基中，在30 ℃下200 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)后，以10%的接種量接入新鮮YPD 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，至細(xì)胞濃度大約為2×107cells/mL。吸取適量菌液到無(wú)菌的1.5 mL離心管中，5000 r/min 離心2 min 后水洗一次并收集細(xì)胞。用1 mL 濃度100 mmol/L 的醋酸鋰溶液將細(xì)胞重懸并靜置5 min，隨后4000 r/min 離心3 min棄上清。依次在菌體中加入適量DNA 片段、10 μL ssDNA、240 μL 500 g/L PEG3350、36 μL 1 mol/L 醋酸鋰，加水至總體積360 μL。渦旋振蕩充分混勻，依次30 ℃保溫30 min、42 ℃水浴20～30 min，4000 r/min 離心3 min 收集沉淀隨后用1 mL 無(wú)菌水清洗菌體。取適量菌液涂平板，30 ℃培養(yǎng)2～4天，PCR驗(yàn)證正確后進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證［23］。

挑取少量PCR 驗(yàn)證正確的菌體接入適量新鮮YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h制備種子液，以10%接種量接入新鮮YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min，培養(yǎng)5天后提取發(fā)酵產(chǎn)物。

1.5 基因表達(dá)水平檢測(cè)

將工程釀酒酵母接在YPD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板利用FastStart Essential DNA Green Master 試劑盒（Roche）通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行相對(duì)定量。管家基因ACT1為內(nèi)參基因。

1.6 酵母RNA-Seq

工程酵母接在YPD 培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)30 h后，5000 r/min 離心2 min 收集菌體，并用無(wú)菌水洗滌菌體3 次后轉(zhuǎn)入-80 ℃短暫保存，隨后由北京博云華康基因科技有限公司完成RNA-seq。

1.7 工程酵母代謝產(chǎn)物的樣品處理

酵母發(fā)酵結(jié)束后，取60 mL 菌液用6 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 至3 以下，對(duì)其進(jìn)行超高壓破碎。取2 mL 超高壓破碎的勻漿，加入等體積乙酸乙酯，渦旋振蕩10 min。將勻漿12 000 r/min離心10 min，吸取上清并轉(zhuǎn)移至液相小瓶。在真空干燥儀中60 ℃干燥至乙酸乙酯完全揮發(fā)。加入100μL吡啶與100μLN，O-雙（三甲基硅基）三氟代乙酰胺，混勻后80 ℃反應(yīng)30 min。冷卻至室溫后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入200μL套管后置于液相小瓶中，準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。

1.8 GC-MS產(chǎn)物鑒定

使用島津GCMS-QP2010 Ultra，配備低流失色譜柱SH-Rxi-5Sil MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm，島津，日本）。進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比5∶1，進(jìn)樣1 μL，載氣氦氣的流速為1.2 mL/min。升溫程序：80 ℃保持 1 min，以 20 ℃/min 升至 290 ℃，保持38 min；色譜質(zhì)譜接口溫度為290 ℃。質(zhì)譜掃描范圍為m/z50～700。使用外標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行定性定量［24-25］。

2 結(jié)果與討論

2.1 跨膜域?qū)YP72A63（T338S）催化特性的影響

Ⅱ型細(xì)胞色素P450 酶的跨膜結(jié)構(gòu)對(duì)于酶的催化活性具有重要影響［26-27］。在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，增溶修飾（N 端融合增溶序列，截除跨膜域等）可以提高Ⅱ型P450 酶的溶解性，但是酶與膜相互作用的破壞會(huì)對(duì)其活性產(chǎn)生顯著的抑制作用，CYP11B1 的N 端突變甚至?xí)?duì)其選擇性產(chǎn)生影響［26-27］。為進(jìn)一步探究在酵母體內(nèi)表達(dá)時(shí)跨膜域?qū)YP72A63（T338S）催化特性的影響，本研究將酵母內(nèi)源細(xì)胞色素P450 酶ERG11（YHR007C）、ERG5（YMR015C）與其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白ERG1（YGR175C）、ERG2（YMR202W）、NTE1（YML059C）的 N 端跨膜域，以及 GPⅠ8（YDR331W）、KAR1（YNL188W）的C 端跨膜域，直接融合在突變體CYP72A63（T338S）的 N 端以對(duì)其 跨 膜域進(jìn)行改造。

利用TMHMM 對(duì)改造后的嵌合蛋白跨膜域結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖1 所示。其中紅色柱狀區(qū)域出現(xiàn)的次數(shù)代表跨膜螺旋的數(shù)量，橫坐標(biāo)代表氨基酸位點(diǎn)，融合ERG5N（ERG5 的N 端跨膜域）、GPⅠ8C（GPⅠ8 的 C 端跨膜域）后仍為單跨膜域蛋白，跨膜域由29 個(gè)氨基酸分別延長(zhǎng)為69 個(gè)和43 個(gè)氨基 酸 ；融 合 ERG2N（ERG2 的 N 端 跨 膜 域 ）、KAR1C（KAR1 的C 端跨膜域）后，由單跨膜域改變?yōu)殡p跨膜域蛋白；融合ERG11N（ERG11 的N 端跨膜域）與NTE1N（NTE1 的N 端跨膜域）后則變?yōu)槿缒び虻鞍?，這說(shuō)明內(nèi)源內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白跨膜域的融合顯著改變了CYP72A63（T338S）的跨膜結(jié)構(gòu)（圖1）。

圖1 跨膜域改造后CYP72A63（T338S）的TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.1 TMHMM prediction for the transmembrane-domain-modified CYP72A63(T338S)

為確定跨膜域改造對(duì)CYP72A63（T338S）催化特性的影響，所獲得的嵌合蛋白突變體均在釀酒酵母底盤(pán)GA0-1 體內(nèi)進(jìn)行功能驗(yàn)證。結(jié)果表明，跨膜域的改造對(duì)CYP72A63（T338S）的催化特 性 影 響 顯 著（ 圖 2）。 ERG5N、 KAR1C、ERG2N 對(duì)其活性有顯著的抑制作用，KAR1C、ERG2N 直接導(dǎo)致其失活，這也說(shuō)明這些雙跨膜域的結(jié)構(gòu)對(duì)該酶活性有顯著的抑制作用，其可能原因?yàn)楦脑旌蟮目缒び驘o(wú)法在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上正確定位與折疊從而導(dǎo)致了該酶的失活，在改造過(guò)程中應(yīng)避免這種結(jié)構(gòu)的形成。但是融合NTE1N 后降低了CYP72A63（T338S）對(duì)底物β-香樹(shù)脂醇選擇性，顯著抑制了其氧化β-香樹(shù)脂醇的能力，降低甘草次酸合成過(guò)程中副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成。而 GPⅠ8C 進(jìn)一步提高了 CYP72A63（T338S）對(duì)底物β-香樹(shù)脂醇的選擇性，促進(jìn)了甘草次酸合成過(guò)程中副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成（圖2）。這一結(jié)果說(shuō)明，跨膜域的改造對(duì)于細(xì)胞色素P450酶的催化特性具有顯著的影響，通過(guò)對(duì)跨膜區(qū)域進(jìn)行改造是一種調(diào)控Ⅱ型P450 酶底物選擇性的有效策略。

圖2 不同跨膜結(jié)構(gòu)對(duì)CYP72A63（T338S）底物選擇性的影響Fig.2 Ⅰnfluence of the transmembrane structures on the substrate selectivity of CYP72A63(T338S)

2.2 細(xì)胞膜組分對(duì)CYP72A63（T338S）底物選擇性的影響

脂質(zhì)是生物膜的主要組成成分，細(xì)胞中脂質(zhì)組分的調(diào)整對(duì)于維持膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有重要作用［28］，膜結(jié)構(gòu)為膜蛋白發(fā)揮功能的支架，也會(huì)對(duì)膜結(jié)合的P450 酶與CPR 之間的相互作用產(chǎn)生影響，從而影響P450 的催化活性［29］。研究表明，在蛋白與蛋白以及蛋白與脂質(zhì)之間的相互作用下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上能夠形成富含甾醇以及鞘脂的脂質(zhì)微結(jié)構(gòu)域，這些微結(jié)構(gòu)域是P450 以及CPR 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上定位的重要場(chǎng)所，鞘脂分子結(jié)構(gòu)以及種類(lèi)的改變可能會(huì)重塑這些微結(jié)構(gòu)域，影響定位其中的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)之間的相互作用，進(jìn)而影響P450 酶的催化特性［30-31］。

在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，相同的P450 酶在不同的宿主中表達(dá)時(shí)，其活性差異較大。以Sgib［32］以及與SynV［33］為宿主，利用 CYP72A63（T338S）在胞內(nèi)重構(gòu)甘草次酸的合成途徑時(shí)，在相同條件下，底物11-氧-β-香樹(shù)脂醇有大量剩余時(shí)，其甘草次酸產(chǎn)量差異顯著，分別為8 mg/L 與30 mg/L，這說(shuō)明兩種宿主中P450的活性存在差異。

本研究對(duì)兩種工程菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，參與鞘脂合成的FAA1以及SUR2在Sgib 中顯著高表達(dá)（表4），為驗(yàn)證這些差異對(duì)CYP72A63（T338S）催化特性的影響，本研究在GA160 中對(duì)其進(jìn)行了敲除，結(jié)果表明SUR2的敲除顯著改變了CYP72A63（T338S）的催化底物選擇性。該基因敲除雖然降低了甘草次酸的合成能力，但是顯著提高了 CYP72A63（T338S）對(duì)底物 11-氧-β-香樹(shù)脂醇的選擇性，抑制了甘草次酸合成過(guò)程中β-香樹(shù)脂醇氧化導(dǎo)致的副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成，使甘草次酸所占比例由82.9%提高至97.6%（圖3）。SUR2敲除抑制了神經(jīng)酰胺向植物神經(jīng)酰胺的轉(zhuǎn)化過(guò)程，造成神經(jīng)酰胺的積累，從而改變了膜結(jié)構(gòu)中鞘脂的組成成分，這說(shuō)明膜結(jié)構(gòu)中鞘脂結(jié)構(gòu)的改變對(duì)膜結(jié)合的Ⅱ型細(xì)胞色素P450 酶的催化特性具有顯著的影響。

圖3 敲除FAA1及SUR2的工程菌株產(chǎn)物分布Fig.3 Product profile of the strains with FAA1or SUR2 knock out

表4 不同宿主中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄豐度Tab.4 Transcription levels of genes associated to lipid metabolism in different strains

2.3 調(diào)節(jié)鞘脂合成途徑調(diào)控CYP72A63（T338S）底物選擇性

SUR2的敲除對(duì)CYP72A63（T338S）的底物選擇性產(chǎn)生了顯著的影響，這表明脂質(zhì)成分的改變，尤其鞘脂的成分和結(jié)構(gòu)的改變對(duì)于P450 酶的催化特性影響顯著。鞘脂由神經(jīng)酰胺骨架、極性頭和超長(zhǎng)鏈脂肪酸（C18～C26）構(gòu)成，鞘脂分子中超長(zhǎng)鏈脂肪酸的長(zhǎng)度的改變會(huì)對(duì)生物膜的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，同時(shí)游離超長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量的改變對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)也有一定的影響［34-35］。

在釀酒酵母中，脂肪酸碳鏈的延長(zhǎng)由elo1p、elo2p、elo3p 三種酶催化，其中C18CoA 主要由elo1p 與 elo2p 合成，C26CoA 主要由 elo2p、elo3p 合成。因此，本研究對(duì)工程菌中編碼這三種蛋白的基因ELO1、ELO2、ELO3基因進(jìn)行了過(guò)表達(dá)，促進(jìn)超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成。結(jié)果表明，三個(gè)基因的過(guò)表達(dá)對(duì)于CYP72A63（T338S）的底物選擇性沒(méi)有顯著影響，11-脫氧甘草次酸和甘草次酸的產(chǎn)量沒(méi)有產(chǎn)生顯著變化，但是這些基因的過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了其前體物質(zhì)β-香樹(shù)脂醇的積累，其可能原因?yàn)榍手Y(jié)構(gòu)的改變提高了膜結(jié)構(gòu)對(duì)于無(wú)羧基三萜產(chǎn)物的容納能力（圖4）。

圖4 過(guò)表達(dá)ELO1、ELO2、ELO3工程菌中三萜化合物的產(chǎn)量Fig.4 Production of triterpenoids in the engineered strains overexpressing ELO1,ELO2 and ELO3

植物來(lái)源的酶在酵母中進(jìn)行異源表達(dá)時(shí)，活性低、特異性差是一種常見(jiàn)現(xiàn)象。由于細(xì)胞色素P450 酶為膜蛋白，影響其活性的原因之一可能為植物與酵母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脂質(zhì)成分的不同。

葡萄糖神經(jīng)酰胺是植物鞘脂的主要成分之一，由鞘氨醇和脂酰-CoA經(jīng)葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶催化合成［36］，通過(guò)對(duì)釀酒酵母基因組進(jìn)行檢索發(fā)現(xiàn)，其基因組中不存在葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶及其同工酶，對(duì)釀酒酵母代謝組進(jìn)行檢索也未發(fā)現(xiàn)葡萄糖神經(jīng)酰胺［37］，該差異可能為導(dǎo)致植物來(lái)源的酶在釀酒酵母中催化特性差的原因。為驗(yàn)證葡萄糖神經(jīng)酰胺對(duì)三萜合成的影響，本研究在釀酒酵母工程菌GA160的YPRCtau3位點(diǎn)中引入的來(lái)源于苜蓿（Mt）、畢赤酵母（Pa）以及解脂酵母（Ya）的葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶（GCS）。結(jié)果表明，來(lái)自于畢赤酵母的葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶PaGCS2提高了CYP72A63（T338S）對(duì)底物β-香樹(shù)脂醇選擇性，顯著促進(jìn)了11-脫氧甘草次酸的合成（圖5）。綜合以上結(jié)果，調(diào)節(jié)酵母鞘脂代謝，改變其組成對(duì)P450酶的催化特性具有顯著的影響，通過(guò)控制鞘脂合成可實(shí)現(xiàn)對(duì)Ⅱ型P450酶底物選擇性的調(diào)控。

圖5 過(guò)表達(dá)外源葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶工程菌的三萜產(chǎn)量Fig.5 Production of triterpenoids in the engineered strains overexpressing heterogenous GCSs

2.4 調(diào)控雙步氧化比例提高CYP72A63（T338S）反應(yīng)特異性

甘草次酸合成過(guò)程中，中間產(chǎn)物11-氧-β-香樹(shù)脂醇以及副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成前體均為β-香樹(shù)脂醇，因此催化11-氧-β-香樹(shù)脂醇合成的Uni25647 以及催化副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸合成的CYP72A63（T338S）之間存在底物競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，通過(guò)提高Uni25647的活性，增強(qiáng)其競(jìng)爭(zhēng)底物β-香樹(shù)脂醇的能力，有望削弱CYP72A63（T338S）氧化β-香樹(shù)脂醇合成11-脫氧甘草次酸的能力。強(qiáng)化酶的表達(dá)是提高酶催化能力的一種直接有效的方式，因此本研究在GA160基礎(chǔ)上，將Uni25647基因的啟動(dòng)子更換成表達(dá)強(qiáng)度更高的Gal7啟動(dòng)子，構(gòu)成菌株GA180-1。結(jié)果表明，更換強(qiáng)度更高的Gal啟動(dòng)子后對(duì)甘草次酸的合成無(wú)顯著的促進(jìn)作用，但顯著促進(jìn)了CYP72A63（T338S）對(duì)底物 11-氧-β-香樹(shù)脂醇的特異性氧化，完全抑制了甘草次酸合成過(guò)程中副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成，甘草次酸產(chǎn)量為（31.6 ±2.2）mg/L相比于對(duì)照（30.3±1.7）mg/L沒(méi)有顯著變化（圖 6）。通 qPCR 對(duì)菌株 GA160 與 GA180-1 中Uni25647及CYP72A63（T338S）基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在GA180-1中Uni25647基因轉(zhuǎn)錄水平提高了18.8倍，Uni25647與CYP72A63（T338S）轉(zhuǎn)錄豐度的比例由1∶24.5提高至1∶1.5。Uni25647表達(dá)水平的提高，強(qiáng)化了其對(duì)于β-香樹(shù)脂醇的競(jìng)爭(zhēng)力，導(dǎo)致β-香樹(shù)脂醇代謝流均流向Uni25647 催化的11-oxo-βamyrin合成反應(yīng)從而抑制了11-脫氧甘草次酸的合成，使工程菌11-氧-β-香樹(shù)脂醇產(chǎn)量由（51.0±2.4）mg/L提高至（67.9±7.4）mg/L，由于CYP72A63（T338S）催化活性沒(méi)有得到顯著的促進(jìn)，因此甘草次酸的產(chǎn)量并未獲得顯著的提高。這一結(jié)果說(shuō)明通過(guò)調(diào)節(jié)具有底物競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的催化酶比例的策略可實(shí)現(xiàn)對(duì)其反應(yīng)、特異性的控制（圖6）。

圖6 Uni25647表達(dá)強(qiáng)化后工程菌的產(chǎn)物的分布（a）及P450酶的相對(duì)轉(zhuǎn)錄豐度（b）Fig.6 Product profile(a)and the relative transcription abundance of P450 enzymes after up-regulating Uni25647 expression(b)

3 討論

相比于化學(xué)催化，P450 酶是一種高選擇性的催化劑，具有更強(qiáng)的區(qū)域和立體選擇性，但是許多P450 酶催化仍然具有一定的雜泛性，比如CYP72A63 可以氧化β-香樹(shù)脂醇的 C-30 與 11-氧-β-香樹(shù)脂醇的C-29和C-30兩個(gè)位點(diǎn)，合成11-脫氧甘草次酸、甘草次醇、甘草次醛、29-羥-11-氧-β-香樹(shù)脂、甘草次酸五種產(chǎn)物，其突變體CYP72A63（T338S）雖然可以實(shí)現(xiàn)良好的C-30區(qū)域選擇性，但是可以同時(shí)氧化β-香樹(shù)脂醇和11-氧-β-香樹(shù)脂醇導(dǎo)致合成甘草次酸過(guò)程中同時(shí)合成副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸，即導(dǎo)致底物的消耗也增加了目標(biāo)產(chǎn)物分離純化的難度［18］。

要實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效選擇性合成，需要進(jìn)一步增強(qiáng)P450 酶的催化選擇性。酶催化口袋的幾何結(jié)構(gòu)、化學(xué)環(huán)境等因素是決定其催化特性的關(guān)鍵，通過(guò)對(duì)P450 酶活性口袋進(jìn)行重塑，獲得了多種具有良好區(qū)域選擇性、立體選擇性等催化特性的突變體［14，34］。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)與P450 酶存在蛋白與蛋白之間相互作用的氧化還原伴侶也會(huì)對(duì)P450 的催化特性產(chǎn)生顯著影響。在Ⅱ型P450 酶中，除了CPR 與P450 酶的相互外，還存在膜、P450 酶和CPR 三者之間的相互作用。這些相互作用同樣對(duì)P450 的催化特性具有顯著影響，研究表明，膜組分磷脂酰膽堿是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中促進(jìn)CPR 與P450 相互作用的主要成分，除此之外，另外一種組分磷脂酰乙醇胺能夠促進(jìn)CPR 與CYP2B4 之間的電子傳遞效率從而提高其催化活性［31］。為進(jìn)一步探索膜對(duì)P450 酶的影響，本研究中對(duì)連接膜與蛋白的跨膜域以及膜組分鞘脂合成的關(guān)鍵途徑進(jìn)行了改造，發(fā)現(xiàn)跨膜域?qū)YP72A63（T338S）催化的底物選擇性具有顯著的影響，本研究中利用該特性開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)改造CYP72A63（T338S）跨膜域控制其底物選擇性的策略。通過(guò)對(duì)鞘脂合成途徑的調(diào)控發(fā)現(xiàn)，改變鞘脂成分也是一種實(shí)現(xiàn)對(duì)P450 催化底物選擇性的調(diào)控的有效方法，然而鞘脂成分改變以及跨膜域改造對(duì)酶活性的調(diào)控機(jī)制并不清晰，在后期的研究中，通過(guò)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析、分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法，闡明膜結(jié)構(gòu)以及P450 跨膜域結(jié)構(gòu)變化對(duì)其催化結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的影響將會(huì)促進(jìn)鞘脂成分改變以及跨膜域改造對(duì)P450酶活性調(diào)控機(jī)制的解析。

除了改變催化劑本身的催化特性外，從化合物合成過(guò)程的角度出發(fā)，也可以為我們提供反應(yīng)調(diào)控的新思路。在天然產(chǎn)物的生物合成過(guò)程中，由于酶的雜泛性，導(dǎo)致下游反應(yīng)的酶可以催化上游酶的底物，在兩種酶之間形成底物競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，從而導(dǎo)致副產(chǎn)物的合成。這種情況下提高上游酶的催化活性，強(qiáng)化其底物競(jìng)爭(zhēng)能力會(huì)顯著降低甚至消除下游酶對(duì)上游底物的消耗，起到抑制副產(chǎn)物合成的作用。在本研究中，通過(guò)強(qiáng)化甘草次酸合成過(guò)程中的上游P450 酶Uni25647 的催化活性，增強(qiáng)其競(jìng)爭(zhēng)底物β-香樹(shù)脂醇的能力，完全消除了下游酶CYP72A63（T338S）對(duì)于β-香樹(shù)脂醇的氧化，這也進(jìn)一步說(shuō)明，調(diào)控合成途徑中具有底物競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的酶的表達(dá)比例，也是一種改變酶催化的底物選擇性、消除副產(chǎn)物產(chǎn)生的有效策略。

不同于傳統(tǒng)的P450 酶催化結(jié)構(gòu)域改造以及還原伴侶工程來(lái)調(diào)控P450 酶的催化特性，本研究通過(guò)改造P450 酶的跨膜結(jié)構(gòu)域以及調(diào)控膜組分的代謝實(shí)現(xiàn)了Ⅱ型P450 酶催化的底物選擇性的調(diào)控，改變了CYP72A63（T338S）對(duì)于兩種底物β-香樹(shù)脂醇以及11-氧-β-香樹(shù)脂醇的氧化選擇性；同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改變具有底物競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的酶的表達(dá)比例，是一種消除級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中由于上下游酶均可氧化同一種底物而導(dǎo)致的副產(chǎn)物的有效方法，為Ⅱ型P450 酶催化特異性的調(diào)控提供了更加豐富的策略，然而跨膜域結(jié)構(gòu)以及膜組分代謝對(duì)于P450催化特性影響的機(jī)制仍需更加深入的研究。