許樂(lè)鵬，劉培慧，盛偉偉，王季堃

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，遼寧 錦州 121001；2.葫蘆島市中心醫(yī)院腫瘤日間病房，遼寧 葫蘆島 125000；3.葫蘆島市中心醫(yī)院介入血管外科，遼寧 葫蘆島 125000；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸疝外科，沈陽(yáng) 110001）

研究［1］顯示，我國(guó)2000年至2011年男性胰腺癌 發(fā)病率及年齡-標(biāo)準(zhǔn)化死亡率顯著上升，分別為惡性腫瘤的第一位和第二位。胰腺癌死亡率高的主要原因?yàn)榧膊≡缙跈z出率低，而且發(fā)病后腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力以及對(duì)周圍組織的侵襲能力強(qiáng)，進(jìn)而預(yù)后極差。因此，提高疾病的早期檢出率，改善患者預(yù)后是目前急需解決的課題。

已有研究［2］發(fā)現(xiàn)染色體不穩(wěn)定是惡性腫瘤的主要特征之一，其在惡性腫瘤發(fā)生進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞對(duì)染色體穩(wěn)定性進(jìn)行維護(hù)的過(guò)程中，凝聚蛋白復(fù)合體是關(guān)鍵因子。染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白1A（structural maintenance of chromosomes protein 1A，SMC1A）是組成凝聚蛋白的主要亞基，其功能異常與惡性腫瘤（大腸癌、前列腺癌和肝癌）發(fā)生密切相關(guān)［3-5］。胰腺癌組織中SMC1A表達(dá)的臨床意義及對(duì)細(xì)胞增殖的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在檢測(cè)胰腺癌組織中SMC1A表達(dá)情況，探討其表達(dá)的臨床意義及對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2010年1月至2015年12月錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科行胰腺癌手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為腺癌的標(biāo)本59例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料完整；（2）提供標(biāo)本的患者可接受隨訪。胰腺癌細(xì)胞系，包括轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞［AsPC-1（轉(zhuǎn)移性腹水）、SW1990（脾轉(zhuǎn)移）］和原發(fā)胰腺癌細(xì)胞（BxPC-3和PANC-1）均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，并用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液（美國(guó)HyClone公司）培養(yǎng)。主要試劑包括SMC1A單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），DAB顯色液、免疫組化試劑盒（北京中杉金橋公司），轉(zhuǎn)染試劑Opti-MEM及Oligofectamine2000（美國(guó)Invitrogen公司），ECL發(fā)光試劑盒、BCA定量蛋白裂解液及抑制劑（碧云天生物公司），SYBR Green Ⅱ 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（DRR037S）、RNA分離試劑盒 TRIzol（日本TaKaRa公司）。SMC1A siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化：標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定、4 μm切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后去除內(nèi)源性過(guò)氧化酶。PBS清洗后將胰腺癌組織標(biāo)本置于pH 6.0檸檬酸高壓修復(fù)1 min，自然冷卻。室溫環(huán)境下封閉血清，再將一抗（1 ∶200）加入，更換至4 ℃環(huán)境下12 h孵育。第2天加入霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶，PBS清洗、DAB顯色、蘇木素復(fù)燃。鹽酸乙醇分化后脫水、透明、封片后光學(xué)顯微鏡（400倍）下觀察。

1.2.2 SMC1A表達(dá)判定：參照文獻(xiàn)［6］，每張切片觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞。（1）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0～10%，0分；＞10%～25%，1分；＞25%～50%，2分；＞50%～75%，3分；＞75%，4分。（2）染色強(qiáng)度：無(wú)著色，0分；淺黃色，1分；黃或深黃色，2分；褐或棕褐色，3分。2項(xiàng)評(píng)分乘積＞4分為SMC1A高表達(dá)，≤4分為低表達(dá)。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)：轉(zhuǎn)染SMC1A胰腺癌細(xì)胞系接種至6孔板，48 h后加入裂解液和蛋白酶抑制劑提取總蛋白，超聲裂解，冰上靜置 30 min 后12 000 r/min 4 ℃離心10 min，收集上清液，采用二辛可寧酸法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 V 100 min 電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入SMC1A（1 ∶1 000）4 ℃ 孵育過(guò)夜。二抗室溫孵育 2 h，凝膠顯像儀（以色列MF-chemibis 3.2 DNR公司）顯像。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）：采用 RNA分離試劑盒TRIzol提取并純化組織總RNA，所有RNA樣本濃度均稀釋至1 μg/μL，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。熒光實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系 25 μL（2× SYBRR Premix ExTaqTM12.5 μL，100 nmol/ L上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，H2O 8.5 μL）。SMC1A上游引物5’-AAGTGAGGAGGAGGAGGAG-3’，下游引物5’-ACTTTCTTCAGGGTCTTGTTC-3’；GAPDH上游引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，保持5 s，60 ℃ 30 s，以此為1個(gè)循環(huán)，共循環(huán)45次，并配有復(fù)孔，焦碳酸二乙酯水為陰性對(duì)照。結(jié)果采用2-ΔΔCt計(jì)算。

1.2.5 SMC1A siRNA干擾實(shí)驗(yàn)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Capan-2細(xì)胞加入6孔板，嚴(yán)格按照Oligofectamine2000說(shuō)明進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Capan-2胰腺癌細(xì)胞加入6孔板中68 h，8 μL 脂質(zhì)體與200 μL opti-MEM混合靜置5 min后與含8 μL siRNA（20 μmol/L）200 μL的opti-MEM混合靜置20 min，然后加入相應(yīng)各孔中。6 h后換液，24～48 h后提取相應(yīng)RNA、蛋白。

1.2.6 細(xì)胞增殖：酶標(biāo)定量?jī)x檢測(cè)SMC1A siRNA組（轉(zhuǎn)染SMC1A siRNA）和對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空白對(duì)照）轉(zhuǎn)染1～5 d后的細(xì)胞，經(jīng)MTT噻唑藍(lán)法（5 mg/mL）和二甲基亞砜（DMSO）處理后用酶標(biāo)定量?jī)x檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處的吸光度（optical density，OD）值。細(xì)胞增殖率=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD調(diào)零孔）/（OD對(duì)照組-OD調(diào)零孔）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織中SMC1A的表達(dá)

結(jié)果顯示，癌組織中SMC1A主要在胞質(zhì)和胞核中表達(dá)，59例胰腺癌組織中有37例（62.7%）高表達(dá)，22例（37.2%）低表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組化檢測(cè)胰腺癌中 SMC1A的表達(dá)情況×200Fig.1 Immunohistochemistry of SMC1A expression in pancreatic cancer tissue ×200

2.2 SMC1A表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系

結(jié)果顯示，SMC1A表達(dá)與患者腫瘤大?。é?=4.515，P=0.034）、T分期（χ2=10.277，P=0.003）及UICC分期（χ2=3.940，P=0.047）正相關(guān)，見(jiàn)表1。

表1 SMC1A表達(dá)與胰腺癌患者臨床指標(biāo)的關(guān)系［n（%）］Tab.1 Relationship between SMC1A expression and clinical data in patients with pancreatic cancer ［n（%）］

2.3 患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)與預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，SMC1A高表達(dá)胰腺癌患者較低表達(dá)者預(yù)后差，見(jiàn)圖2。單因素分析結(jié)果顯示，SMC1A表達(dá)、血管浸潤(rùn)、UICC分期與患者預(yù)后相關(guān)（表2）。將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）指標(biāo)進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，SMC1A高表達(dá) ［95%CI：1.011～5.207，P=0.047］ 和UICC分期晚 ［95%CI：1.209～5.342，P=0.014］ 是患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表2 各項(xiàng)臨床指標(biāo)對(duì)預(yù)后影響的單因素及多因素分析Tab.2 Univariate analysis and multi-factor analysis of the influence of various clinical indicators on prognosis

圖2 SMC1A低表達(dá)和高表達(dá)患者的 Kaplan-Meier生存曲線分析Fig.2 Kaplan-Meier survival curve analysis of patients with low and high SMC1A expression

2.4 SMC1A在胰腺癌細(xì)胞系中表達(dá)以及SMC1A干擾效果驗(yàn)證

結(jié)果顯示，SMC1A在轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞AsPC-1及SW1990中蛋白和mRNA表達(dá)明顯高于原發(fā)胰腺癌細(xì)胞（PANC-1和BxPC-3，均P＜ 0.01），見(jiàn)圖3。提示SMC1A表達(dá)與胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。AsPC-1和SW1990細(xì)胞中SMC1A干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA組SMC1A蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著低于其對(duì)照組，見(jiàn)圖4。

圖3 不同胰腺癌細(xì)胞中SMC1A 蛋白及mRNA表達(dá)比較Fig.3 Comparison of SMC1A protein and mRNA expression in different pancreatic cancer cells

圖4 AsPC-1和SW1990細(xì)胞中SMC1A干擾后表達(dá)情況Fig.4 Expression of SMC1A after interference in AsPC-1 and SW1990 cells

2.5 SMC1A干擾對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，在AsPC-1和SW1990中與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染后3～5 d SMC1A siRNA組細(xì)胞增殖率顯著降低（均P＜ 0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 SMC1A干擾對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響Fig.5 The effect of SMC1A interference on the proliferation of pancreatic cancer cells

3 討論

SMC1A是凝聚蛋白復(fù)合體重要亞基，在染色體凝聚過(guò)程中防止姐妹染色單體提前分裂，維護(hù)子細(xì)胞染色體穩(wěn)定性。SMC1A表達(dá)失調(diào)可引起染色體不穩(wěn)定，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［6-7］。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織中SMC1A表達(dá)明顯升高，且SMC1A高表達(dá)與腫瘤大小、T分期及UICC分期正相關(guān)（均P＜0.05）；同時(shí)SMC1A表達(dá)是影響胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。已有研究顯示，SMC1A依據(jù)腫瘤類型不同發(fā)揮不同生物學(xué)作用。ZHANG等［5］研究顯示在78例肝癌組織中SMC1A呈明顯高表達(dá)，并且與肝癌患者臨床分期及不良預(yù)后密切相關(guān)。WANG等［8］在427例大腸癌組織中同樣發(fā)現(xiàn)SMC1A高表達(dá)，其高表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后顯著正相關(guān)。H?MME等［9］在116例急性髓性白血病患者中發(fā)現(xiàn)SMC1A呈明顯低表達(dá)，并與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)SMC1A表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)SMC1A干擾抑制了胰腺癌細(xì)胞增殖。與以往研究［3，5］結(jié)果一致。已有研究［10］顯示，前列腺癌中SMC1A的干擾抑制了PC-3和DU145細(xì)胞的生長(zhǎng)、菌落形成和細(xì)胞遷移能力?？梢?jiàn)，實(shí)體腫瘤中SMC1A扮演癌基因角色，其表達(dá)失調(diào)可促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。

綜上所述，SMC1A在胰腺癌中呈高表達(dá)，且SMC1A表達(dá)與腫瘤大小、T分期、UICC分期及不良預(yù)后密切相關(guān)，其機(jī)制可能是SMC1A表達(dá)促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞增殖。目前，胰腺癌惡性生物學(xué)行為的分子機(jī)制尚不明確，SMC1A可作為胰腺癌靶向治療的有

效靶點(diǎn)，但有待于進(jìn)一步研究論證。