黃天楚，黃琬淇，顧卉，袁正偉

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院衛(wèi)生部小兒先天畸形重點實驗室，沈陽 110004）

神經(jīng)管畸形（neural tube defects，NTDs）是胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)板無法閉合形成神經(jīng)管而造成的，全世界約有3%新生兒患有這種缺陷，是導致圍產(chǎn)期嬰兒死亡的原因之一［1］。NTDs通常分為開放性缺損（顱脊柱裂、無腦畸形和脊髓脊膜膨出）和閉合性缺損（腦膨出、腦膜膨出和隱性脊柱裂）［2］。

細胞遷移是神經(jīng)管閉合過程中重要的生物學功能之一。隨著細胞的遷移會失去其極性和細胞間黏附性，細胞間黏附分子發(fā)生改變，使上皮細胞轉(zhuǎn)變成具有侵襲性的間充質(zhì)細胞，這一過程被稱為上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）［3］。Ⅰ型膠原蛋白α1（collagen type Ⅰα 1，COLIA1）是膠原蛋白家族的成員，廣泛分布于骨骼、軟骨、皮膚、心臟瓣膜、肺以及結(jié)締組織中［4］。研究［5］顯示，COLIA1突變可能會導致胚胎發(fā)育過程中的成骨不全。此外，SUN等［6］研究表明，COLIA1可能通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)惡性星形細胞瘤細胞的侵襲能力，促進腫瘤細胞的遷移。目前，COLIA1與NTDs的關(guān)系研究尚未見報道。本研究探討全反式維甲酸（all-transretinoic acid，ATRA）誘導的小鼠NTDs模型中COLIA1表達對神經(jīng)細胞遷移活動的影響，旨在為闡明NTDs的發(fā)生機制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 NTDs模型制備及組織樣本收集

8～10周齡C57B1/6J雌性小鼠（北京華阜康生物技術(shù)有限公司）30只，飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院SPF級實驗動物房。于前1 d晚合籠，第2天觀察雌性小鼠有無陰道栓存在，有陰道栓雌性小鼠單獨放一籠，標記為孕0 d（E0）。在E8.5將已孕小鼠隨機分為NTDs組［將ATRA（70 mg/kg）溶于橄欖油后，給予一次灌胃處理，n=15）、對照組（給予同體積的橄欖油灌胃，n=15）。于E9.5處死，剖宮取出胎鼠。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

小鼠神經(jīng)干細胞C17.2培養(yǎng)于含10%胎牛血清（美國Gibco公司）、1%MEM NEAA（美國Gibco公司）、1%雙 抗（100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）的EMEM（美國Gibco公司）中，于37 ℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染sh-negative control（sh-NC）、sh-COLIA1 1#、sh-COLIA1 2#、sh-COLIA1 3#（中國吉瑪公司）至C17.2細胞。

1.3 Western blotting檢測

從胚胎和轉(zhuǎn)染后48 h的C17.2細胞中用RIPA提取蛋白質(zhì)。通過8%的SDS-PAGE電泳分離樣品蛋白，然后電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h。一抗 COLIA1（1 ∶1 000，美國Cell Signal Technology公司）、E-cadherin（1 ∶1 000，美國BD公司），Snail（1 ∶1 000，中國萬類公司）、Vimentin（1 ∶1 000，中國 Proteintech公司）、β-actin（1 ∶1 000，中國 Proteintech公司）4 ℃下過夜。第2天用TBST室溫洗膜3次，每次10 min，然后在室溫下與HRP兔和鼠二抗（1 ∶5 000，中國 Proteintech公司）孵育2 h，ECL試劑發(fā)光。

1.4 細胞劃痕實驗

在6孔板中加入約 5×105細胞，第2天用槍頭進行劃痕，PBS 洗滌細胞 3 次去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，在5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后拍照。

1.5 細胞Transwell遷移實驗

轉(zhuǎn)染細胞撤血清饑餓12～24 h后消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，PBS洗1～2次后無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為5×105/mL。取細胞懸液100 μL加入8孔Transwell小室的上室，下室加入600 μL含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)細胞12～48 h。取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，甲醇固定30 min，將小室適當風干。0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，PBS洗3次。顯微鏡（×200）下隨機5個視野計數(shù)細胞。

1.6 統(tǒng)計學分析

利用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析，GraphPad8.0統(tǒng)計軟件作圖，計量資料以表示；組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 COLIA1在ATRA致畸小鼠模型中的表達

Western blotting檢測E9.5小鼠胚胎組織COLIA1的表達結(jié)果顯示，對照組、NTDs組COLIA1表達分別為1.132±0.118，0.875±0.106。與對照組比較，NTDs組COLIA1表達顯著降低（P＜ 0.05），COLIA1的表達對NTDs的形成可能起到抑制作用。見圖1。

圖1 E9.5天小鼠胚胎正常組和NTDs組COLIA1的表達Fig.1 Expression of COLIA1 in E9.5 mice embryos between control and NTDs groups

2.2 對照組和NTDs組E-cadherin、Vimentin 和 Snail表達比較

結(jié)果顯示，與對照組比較，NTDs組Vimentin和Snail表達降低，而E-cadherin表達上升（均P＜ 0.05）。說明在NTDs胚胎中細胞遷移能力降低，EMT進程減慢，推測COLIA1可能抑制神經(jīng)管閉合中遷移活動以及EMT的發(fā)生。見圖2、表1。

表1 對照組和NTDs組E-cadherin、Vimentin 和 Snail 表達比較Tab.1 Comparison of E-cadherin，Vimentin，and Snail protein expression between control and NTDs groups

圖2 對照組和NTDs組E-cadherin、Vimentin 和 Snail 的表達Fig.2 Expression of E-cadherin，Vimentin，and Snail between control and NTDs groups

2.3 COLIA1對神經(jīng)細胞遷移活動的影響

為了探究COL1A對神經(jīng)細胞遷活動的影響，分別在C17.2細胞中轉(zhuǎn)染sh-NC、sh-COLIA1 1#、sh-COLIA1 2#、sh-COLIA1 3#載體48 h后進行Western blotting檢測，結(jié)果顯示沉默COLIA1時，沉默2鏈效果更明顯，因此后續(xù)實驗應用sh-COLIA1 2#載體 。結(jié)果顯示，與對照組比較，sh-COLIA1 2#組E-cadherin表達明顯上升（P＜ 0.05），而Snail、Vimentin表達明顯下降（P＜0.05），提示COLIA1能夠促進EMT的發(fā)生，見表2、圖3。此外，細胞劃痕以及Transwell遷移實驗結(jié)果顯示沉默COLIA1可明顯抑制神經(jīng)細胞的遷移（圖4）。

表2 sh-NC組、sh-COLIA1 2#組E-cadherin、Vimentin 和 Snail表達比較Tab.2 Comparison of E-cadherin，Vimentin，and Snail expression between sh-NC and sh-COLIA1

圖3 轉(zhuǎn)染COLIA1后各組E-cadherin、Vimentin 和 Snail 表達比較Fig.3 Comparison of E-cadherin，Vimentin，and Snail expression after transfecting sh-NC and sh-COLIA1

圖4 遷移和劃痕試驗檢測轉(zhuǎn)染后C17.2細胞遷移功能的改變Fig.4 Effect of migration and scratch test of C17.2 cells after transfection

3 討論

神經(jīng)嵴干細胞具有強大遷移能力和多項分化潛能，是具有遷徙功能的過渡性多能細胞群體［7］。隨著神經(jīng)褶皺開始閉合形成神經(jīng)管，于神經(jīng)外胚層和非神經(jīng)外胚層邊界的神經(jīng)嵴脫層，沿著整個前后體軸廣泛遷移，分化形成其他不同結(jié)構(gòu)［7］。在神經(jīng)板閉合為神經(jīng)管的過程中，EMT進程參與神經(jīng)細胞的遷移、游走和定植的調(diào)控。在EMT進程中，具有上皮特性E-cadherin隨著EMT的發(fā)生表達逐漸降低［8］。E-cadherin主要定位于胚胎表皮外胚層細胞和神經(jīng)板邊界，隨著細胞的遷移，神經(jīng)板內(nèi)陷，中央神經(jīng)板逐漸與外胚層分離，E-cadherin逐漸失去。因此，E-cadherin表達增高，細胞遷移失敗，導致神經(jīng)管閉合失?。?］。Snail作為EMT轉(zhuǎn)錄抑制因子可與編碼E-cadherin基因的啟動子中保守的E-box序列相結(jié)合，使E-cadherin的表達下調(diào)，并且研究［10］證實，Snail高表達可促進了神經(jīng)嵴細胞的遷移，并參與神經(jīng)管的分層。此外，研究顯示在NTDs胎兒中Vimentin表達下調(diào)［11］。由此可見，神經(jīng)細胞的遷移活動對神經(jīng)管的閉合有重要作用，并且EMT標志物會伴隨神經(jīng)管閉合過程變化，與本研究結(jié)果一致。已有研究［12-13］報道轉(zhuǎn)錄因子Pax3對于明確神經(jīng)板邊界和促進神經(jīng)嵴細胞的形成至關(guān)重要，并且調(diào)控EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail可作為Pax3的直接靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)管閉合過程中COLIA1能夠引起EMT標志物E-cadherin、Snail和Vimentin表達的變化，進而調(diào)控細胞遷移，但這些EMT標志物是否為COLIA1的直接靶點以及具體的調(diào)控機制還有待進一步研究論證。

COLIA1可作為成骨標志物參與成骨的形成，還可作為哺乳動物最豐富的細胞外間質(zhì)（extracellular matrix，ECM）之一［14］。而ECM周期性重塑對細胞的遷移活動同樣至關(guān)重要。已有大量研究證實COLIA1調(diào)控細胞遷移活動。COLIA1可促進胃癌細胞的遷移和侵襲，COLIA1過表達誘導TGF-β信號通路激活，進而促進EMT進程［15］。本研究在NTDs模型中發(fā)現(xiàn)COLIA1表達降低且伴隨EMT相關(guān)指標異常。另外，當沉默C17.2細胞的COLIA1表達后，細胞的遷移活動降低，促進EMT進程標志物表達下降。由此表明，COLIA1表達降低可能抑制了神經(jīng)管發(fā)育過程中神經(jīng)細胞的遷移活動。

綜上所述，COLIA1能夠促進細胞的遷移活動以及EMT進程，進而減少NTDs的發(fā)生。COLIA1有望成為治療NTDs的新靶點，然而關(guān)于COLIA1如何具體調(diào)控EMT進程中的關(guān)鍵分子以及EMT上游分子（PAX3等）與COLIA1之間的關(guān)系尚不明確，有待于進一步研究論證。