林靜霞, 張芳菲, 張澤喬, 鐘遠(yuǎn)秋, 陳永鋒

南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091

銀屑病(psoriasis)是一種有遺傳背景的由免疫異常介導(dǎo)的慢性紅斑鱗屑性皮膚病[1]，主要表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)激活引起的細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖和分化[2]，目前其發(fā)病機(jī)制研究仍不完善。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，大量的易感基因座位于人類基因組的非編碼區(qū)[3]，表明非編碼區(qū)在銀屑病的進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類新的具有調(diào)控功能的RNA，可參與包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、發(fā)育和免疫反應(yīng)在內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程[4],在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平等多方面影響疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。目前基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的差異表達(dá)研究，利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)，可發(fā)現(xiàn)大量lncRNA在銀屑病患者皮損組織中異常表達(dá)，并可能作為銀屑病的新易感位點(diǎn)[6]。lncRNA在調(diào)控銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵通路中發(fā)揮著重要作用，具有潛在的研究意義[7]。因此，本研究通過(guò)分析銀屑病轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，探討細(xì)胞周期的lncRNA異常與銀屑病發(fā)病的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示lncRNA在銀屑病細(xì)胞周期中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 本研究分析數(shù)據(jù)均來(lái)源于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，包括兩個(gè)數(shù)據(jù)集GSE54456和GSE63979，其中正常對(duì)照組90個(gè)，銀屑病皮損組99個(gè)，共189個(gè)樣本。

1.1.2 試劑和儀器 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Thermo Fisher)，PBS緩沖液(Thermo Fisher)，胰酶(Thermo Fisher)，siRNA(銳博生物)，轉(zhuǎn)染試劑盒(銳博生物)，細(xì)胞周期試劑盒(聯(lián)科生物)。生物安全柜(新加坡ESCO公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司)，離心機(jī)(Thermo)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 信號(hào)通路富集分析 通過(guò)DEseq2分析來(lái)自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的銀屑病皮損組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，篩選銀屑病組與健康對(duì)照組差異表達(dá)的基因。篩選條件為log2FC絕對(duì)值>2、P<0.05，并構(gòu)建基因表達(dá)矩陣[8]。采用DAVID功能注釋對(duì)在銀屑病中差異表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行基因功能富集分析，KEGG信號(hào)通路設(shè)定P<0.05，并采用GSEA 軟件包進(jìn)行分析[9]。

1.2.2 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 利用WGCNA構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[10]，去除弱共表達(dá)基因?qū)Γ徑娱撝蹈哂?.02，并與至少一個(gè)lncRNA分子相互作用，形成lncRNA-蛋白編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[11]。

1.2.3 siRNA干擾 將HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)至30%～50%的濃度，然后用50 nM siRNA轉(zhuǎn)染48 h。操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 將HaCaT細(xì)胞接種到6孔板中，培養(yǎng)至30%～50%的濃度，然后轉(zhuǎn)染siRNA 48 h。收集細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌，在4 ℃的70%乙醇中固定過(guò)夜。在37 ℃下用RNase A去除RNA 30 min。最后，在室溫下用碘化丙啶(PI)染色30 min，并在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。siRNA干擾LINC01206的HaCaT細(xì)胞與對(duì)照組HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞周期中G0/G1期、G2/M期和S期等的細(xì)胞數(shù)比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病差異表達(dá)基因富集于細(xì)胞周期通路

通過(guò)整合分析銀屑病轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集與健康對(duì)照組的差異表達(dá)基因，篩選出1 319個(gè)在銀屑病中差異表達(dá)上調(diào)的基因(圖1A)。對(duì)銀屑病皮損中表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，表明其主要富集在趨化因子信號(hào)通路以及細(xì)胞周期通路等(圖1B)。基因集合富集分析結(jié)果顯示，銀屑病皮損中細(xì)胞周期通路表達(dá)升高，且P<0.01(圖1C)，說(shuō)明銀屑病中存在細(xì)胞周期的失調(diào)。

圖1 細(xì)胞周期的失調(diào)與銀屑病有關(guān) 1A：銀屑病差異表達(dá)基因火山圖；1B：銀屑病中表達(dá)上調(diào)基因KEGG信號(hào)通路富集分析；1C: 在GSEA基因集合富集分析中，細(xì)胞周期通路信號(hào)升高

2.2 lncRNA與細(xì)胞周期相關(guān)基因共表達(dá)

篩選與銀屑病細(xì)胞周期通路相關(guān)的差異表達(dá)的lncRNA(圖2A)，利用WGCNA構(gòu)建lncRNA與蛋白編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示在細(xì)胞周期通路中，有9個(gè) lncRNA與14個(gè)蛋白編碼基因有關(guān)聯(lián)(圖2B)。通過(guò)提取細(xì)胞周期相關(guān)lncRNA在對(duì)照組及銀屑病皮損組的表達(dá)量，分析結(jié)果顯示LINC01206在銀屑病皮損組織中表達(dá)倍數(shù)最高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。結(jié)合共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，LINC01206可通過(guò)與細(xì)胞周期通路中的關(guān)鍵基因CCNB1和CCNE1等的相互作用參與銀屑病進(jìn)程。

表1 細(xì)胞周期通路相關(guān)的差異表達(dá)的lncRNA

圖2 lncRNA參與銀屑病細(xì)胞周期進(jìn)程 2A：熱圖顯示對(duì)照組與銀屑病皮損中與細(xì)胞周期通路有關(guān)聯(lián)的lncRNA的差異表達(dá)情況；2B：加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析構(gòu)建細(xì)胞周期通路中l(wèi)ncRNA與蛋白編碼基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

2.3 siRNA敲低LINC01206的表達(dá)引起細(xì)胞周期G2/M期的阻滯

通過(guò)在HaCaT細(xì)胞中轉(zhuǎn)染50 nM siRNA干擾LINC01206的表達(dá)，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)48 h后HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，結(jié)果顯示siRNA敲低HaCaT細(xì)胞中LINC01206的表達(dá)，會(huì)引起細(xì)胞周期G2/M期的阻滯(圖3A～3C)，提示lncRNA可以調(diào)控HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞周期過(guò)程。

圖3 siRNA敲低LINC01206的表達(dá)引起細(xì)胞周期G2/M期的阻滯 3A、3B: 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組(3A)及siRNA干擾LINC01206組(3B)的HaCaT細(xì)胞周期;3C: 細(xì)胞周期各時(shí)期細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)

3 討論

lncRNA參與了從基因表達(dá)到蛋白質(zhì)翻譯和保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定等細(xì)胞生命過(guò)程，在發(fā)育、機(jī)體內(nèi)平衡和維持細(xì)胞命運(yùn)中發(fā)揮重要作用[4]。本研究結(jié)果證實(shí)了lncRNA失調(diào)與多種細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)，并在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[12]。銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析研究表明，銀屑病病變與免疫反應(yīng)、細(xì)胞角質(zhì)化及細(xì)胞周期等多種途徑有關(guān)[13]。細(xì)胞周期對(duì)于細(xì)胞生命過(guò)程至關(guān)重要，其參與分裂細(xì)胞中的增殖、分化和凋亡[14]。細(xì)胞的正常分裂依賴于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期階段時(shí)間順序的檢查點(diǎn)，包括 G1/S、G2/M和中期/后期轉(zhuǎn)變[15]。目前已有多項(xiàng)研究表明，lncRNA通過(guò)多種途徑參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控[16]。如lncRNA DLEU2通過(guò)抑制p53表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程并抑制Notch信號(hào)通路的活性，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖[17]；而lncRNA PLAC2可通過(guò)抑制STAT1核轉(zhuǎn)移降低RP36表達(dá)，從而阻斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的細(xì)胞周期進(jìn)程[18]。同時(shí)也有研究顯示，通過(guò)敲低lncRNA MIR31HG可導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞G2/M期的細(xì)胞周期停滯，影響細(xì)胞增殖[19]。這提示lncRNA可通過(guò)調(diào)控銀屑病細(xì)胞周期來(lái)發(fā)揮功能。

本研究通過(guò)KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，銀屑病上調(diào)的基因富集在細(xì)胞周期通路中；lncRNA與細(xì)胞周期蛋白編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，LINC01206、LINC01269、LINC01215和LINC02159等通過(guò)與細(xì)胞周期信號(hào)通路關(guān)鍵基因CCNA2、CCNB1和CCNE1的相互作用調(diào)控銀屑病進(jìn)程。表明lncRNA可能通過(guò)與RNA結(jié)合蛋白相互作用來(lái)參與銀屑病細(xì)胞周期的調(diào)控[20]。同時(shí)，lncRNA與蛋白編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果提示，LINC01206通過(guò)作用于細(xì)胞周期檢查點(diǎn)相關(guān)基因CCNB1和CCNE1來(lái)調(diào)控銀屑病進(jìn)程。為深入了解lncRNA在銀屑病細(xì)胞周期中的功能，本研究通過(guò)小干擾RNA在HaCaT細(xì)胞中敲低細(xì)胞周期通路中差異表達(dá)最明顯的LINC01206，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，結(jié)果顯示，LINC01206表達(dá)的降低將引起HaCaT細(xì)胞周期G2/M期的阻滯，表明lncRNA可能通過(guò)介導(dǎo)HaCaT細(xì)胞周期、調(diào)控細(xì)胞生命過(guò)程參與銀屑病發(fā)病。

綜上所述，銀屑病病變引起lncRNA的差異表達(dá)，而lncRNA的表達(dá)變化能夠作用于細(xì)胞周期，并導(dǎo)致細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的失調(diào)，從而影響銀屑病的進(jìn)程。因此，對(duì)銀屑病細(xì)胞周期中差異表達(dá)lncRNA的研究，將有助于解釋銀屑病發(fā)病過(guò)程中角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖的機(jī)制，為進(jìn)一步闡明lncRNA在銀屑病中的生物學(xué)功能以及在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用提供新的理論依據(jù)，提示細(xì)胞周期中的lncRNA將有望成為銀屑病治療的新藥物靶點(diǎn)。