許文蓓

（九江市檢驗檢測認證中心食品分中心，江西九江 332000）

當前，食源性病原菌的預防和控制已引起全球關(guān)注。食源性病原菌是引起食物中毒，或者以食品為媒介進行傳播的一類致病菌，可以在入侵宿主后產(chǎn)生致病性，常見的有沙門氏菌、大腸桿菌、結(jié)核菌等。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國在2015年共出現(xiàn)了3 181起食源性病原菌中毒事件，占食物中毒總例數(shù)的53.7%。多數(shù)情況下，食品中的病原菌濃度較低，傳統(tǒng)的檢測需要進行多個步驟，如增菌、分離等，大概需要花費4～7 d的時間，有一定的局限性[1]。隨著時代的不斷進步，檢測方法越來越先進，先后興起了PCR技術(shù)、免疫層析技術(shù)等，即便進行選擇性的增菌培養(yǎng)后，快速檢測仍受到各種因素的影響。本文對食源性病原菌的常見類型及檢測技術(shù)進行介紹，希望能夠為食源性病原菌的快速檢測提供參考。

1 食源性病原菌

所謂食源性病原菌，是指在食品加工、流通過程中引入的病原菌。位于食品中的病原菌，經(jīng)過一段時間的生長，會使食品出現(xiàn)變質(zhì)、受損的情況。同時，含有有毒物質(zhì)的病原菌，還會使人們患病。

基于食源性病原菌的危害分析，多數(shù)情況下會引起急性中毒，輕者表現(xiàn)為急性胃腸炎，重者出現(xiàn)循環(huán)、呼吸等系統(tǒng)癥狀。有部分變質(zhì)食品中含有少量的有毒物質(zhì)，或由于本身毒性作用的特點，并不會引起急性中毒，但是長時間食用，會造成慢性中毒，甚至表現(xiàn)為致突變、致畸、致癌的作用。食用霉變、腐敗的食物，不僅會引起急性中毒，而且還有嚴重的潛在危害。近幾年，伴隨著工業(yè)化的不斷發(fā)展，食源性疾病事件發(fā)生率持續(xù)上漲，食源性疾病也成為世界廣泛關(guān)注的一個公共衛(wèi)生問題，面對如此嚴峻的食品安全問題，全世界對于食品中病原菌的檢測越來越重視，并出臺了相關(guān)標準來保障食品安全[2]。更重要的是，提出在食品生產(chǎn)、加工、流通等環(huán)節(jié)強化對食源性病原菌的檢測。

2 常見的幾種食源性病原菌

2.1 沙門氏菌

沙門氏菌是一種無莢膜、無芽孢的革蘭氏陰性直桿菌，有菌毛，血清型多。目前，全球共發(fā)現(xiàn)血清型2 523個，我國有300個，均會引發(fā)食源性疾病，癥狀常于感染12～72 h后出現(xiàn)，表現(xiàn)為腹痛、頭痛、發(fā)燒、嘔吐等。

2.2 致病性大腸埃希菌

大腸埃希氏菌是一種無芽孢、可以運動，有鞭毛的革蘭陰性桿菌，分為多種類型，比如腸出血性大腸埃希氏菌、擴散粘附性大腸埃希氏菌等，其中腸出血性大腸埃希氏菌（0157∶H7）最為常見，其引發(fā)的腸道疾病多表現(xiàn)為出血性腹瀉。對于此種病原菌，雖然國家明確規(guī)定：食品中不能檢出大腸桿菌0157∶H7，但其污染已成為國際性問題，應引起高度重視。

2.3 單核細胞增生李斯特氏菌

單核細胞增生李斯特氏菌是一種革蘭氏陽性短桿菌，有16個血清型，其中8個血清型是有致病特性的病原菌。報告顯示，此類病原菌是人畜共患病的病原菌，可引起動物、人的敗血癥、腦膜炎等疾病，致死率高達20%～70%[3]。

2.4 志賀氏菌

志賀氏菌是一種無鞭毛、無莢膜的兼性厭氧菌，基于血清學分型分為福氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌等4個種群。

2.5 溶血性鏈球菌

溶血性鏈球菌呈現(xiàn)橢圓形或球形，對營養(yǎng)有著很高的要求?；阪溓蚓?jīng)血液培養(yǎng)后是否出現(xiàn)溶血，及溶血性質(zhì)等情況，通常分為3種類型。人體受溶血性鏈球菌感染后，會引起皮膚化膿性炎癥、新生兒敗血癥、呼吸道感染等反應。

2.6 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌是一種無芽孢、無鞭毛的需氧或兼性厭氧菌，當人感染此類病原菌后，會出現(xiàn)胃腸道癥狀，表現(xiàn)為嘔吐、惡心、血性腹瀉等，重者出現(xiàn)局部化膿感染，甚至出現(xiàn)全身性感染。近年來，金黃色葡萄球菌污染已成為國際性的衛(wèi)生問題，美國疾控中心表明，由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占全部細菌性食物中毒的第2位。2005—2009年，我國每年都會發(fā)生由其引發(fā)的食物中毒事件，例如，2009年9月某學校和周邊居民因食用受金黃色葡萄球菌感染的米粉，造成50多人中毒[4]。

3 食源性病原菌的檢測技術(shù)

3.1 傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)技術(shù)

在食品微生物的檢測中，傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)技術(shù)可謂是“金標準”，在食源性病原菌的檢測中占據(jù)著重要地位?，F(xiàn)階段，國家食品安全標準中均有病原菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定要求，其技術(shù)原理是從食品中抽取部分待測樣品，通過細菌液培養(yǎng)，對菌落的形態(tài)進行觀察，從中提取典型菌落進行鏡檢、生化鑒定和分型（血清學）。伴隨著生物技術(shù)的發(fā)展，特異性強、靈敏度高的培養(yǎng)基被用于檢測中，提高了篩選效率。然而，由于傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)技術(shù)時間長、步驟多，在突發(fā)性的衛(wèi)生事件中很難進行高通量的檢測，更無法起到精準監(jiān)測和預防的效果。另外，對于個別食品加工中受損的致病菌、休眠菌而言，該技術(shù)會出現(xiàn)漏檢的現(xiàn)象。

3.2 免疫熒光標記技術(shù)

在標記免疫技術(shù)中，免疫熒光標記技術(shù)發(fā)展最早，其以熒光素為標記抗體，根據(jù)熒光素檢測出來的熒光，在顯微鏡定位抗原，明確抗原性質(zhì)，同時借助定量技術(shù)對病原菌含量進行測定。該技術(shù)集熒光光素、血清學的敏感性和特異性于一體，因此其具有速度快、敏感度高等優(yōu)勢。但也有缺點，即無法徹底解決非特異性的染色問題，檢測結(jié)果不客觀，技術(shù)程序復雜[5]。而且，對于有目標菌的競爭性物質(zhì)進行檢測時，可能會出現(xiàn)假陽性的情況，因此很少在食源性病原菌的檢測中應用。

3.3 免疫磁珠分離技術(shù)

免疫磁珠分離技術(shù)是當前的一種新免疫學方法，其由磁珠磁性、免疫學特異性相結(jié)合的一種免疫學技術(shù)。通過包被于對磁珠表面的抗體、目標物的相互結(jié)合，產(chǎn)生抗體和抗原復合物。在外力磁場的作用下，此類復合物會產(chǎn)生定向運動，促使目標物、雜質(zhì)分離，從而達到富集、濃縮目標物的效果。在磁珠富集技術(shù)中，不管是磁珠粒徑，亦或者其分散性，都會影響到磁珠對病原菌的富集效果。免疫磁珠分離技術(shù)包括裸磁珠、功能化磁珠兩種技術(shù)，其中功能化磁珠又分為無機材料修飾法、適配體修飾法和抗體修飾法，現(xiàn)以無機材料修飾法為例進行介紹。

無機材料修飾法是指為磁珠表層覆蓋無機材料，為磁珠提供官能團。受外力磁場影響，致病菌可以和官能團偶聯(lián)而富集。曾有研究對磁珠表面進行羧基修飾，以此吸附食品中的致病菌，比如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等。同時，借助PCR檢測對不同濃度下的混合菌液的磁珠吸附能力進行研究。結(jié)果顯示，果汁中的磁珠捕獲率為57%～66%，奶粉中的磁珠捕獲率為40%～54%，鴨肉中的磁珠捕獲率為44%～64%。PCR檢測發(fā)現(xiàn)，羧基修飾后的磁珠在不同的環(huán)境下，都能夠富集目標菌，為PCR檢測提供保障。因為無機材料在各領(lǐng)域都得以應用，故而其比較容易獲取。但是，用于修飾用途的無機材料，其厚度、形態(tài)等相關(guān)要素，可能會給富集性能產(chǎn)生一定的影響?；诖?，選用的無機材料應具備干擾物少、富集量大等性能?，F(xiàn)階段，通常會將免疫磁珠分離技術(shù)和其他技術(shù)結(jié)合，對食源性致病菌進行精準且快速的檢測，如免疫學技術(shù)、PCR技術(shù)等，既可以節(jié)約檢測時間，又能高通量的篩檢樣品。伴隨著免疫磁珠分離技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)人員已研發(fā)了一些無需擴增培養(yǎng)，就可以對目標菌進行檢測的方法，能夠?qū)z測時間控制在3 h內(nèi)，真正實現(xiàn)了快速檢測致病菌的目標。

3.4 電泳技術(shù)

3.4.1 介電電泳

介電電泳技術(shù)源自電泳，是一種基于Max-well經(jīng)典電磁場理論的技術(shù)，主要原理是中性粒子在不均勻的電場受到電場力的影響，進行定向運動。伴隨著電泳技術(shù)的發(fā)展，介電電泳阻抗技術(shù)成為病原菌捕獲、檢測的有效技術(shù)。通過對懸浮液電場頻率、電導率的改變，電泳阻抗發(fā)生也隨之變化，可以真實反映病原菌的富集量。

3.4.2 毛細管凝膠電泳

毛細管凝膠電泳，是一種以毛細管為通道，直流電場（高壓）為驅(qū)動力，有機結(jié)合毛細管、柱富集的技術(shù)。在直流電場的影響下，帶電粒子向相反的方向位移，由于其位移速度不同，可以對組分進行分離，達到分離、富集目標菌的效果。實踐證實，在目標菌的分離中，毛細管凝膠電泳技術(shù)可以實現(xiàn)快速分離，可在數(shù)秒或幾十分鐘內(nèi)完成，而且需要的樣本也不大。但是，在靈敏度、結(jié)果方面仍需進一步改進。

3.5 生物傳感技術(shù)

生物傳感技術(shù)，是一種由物理、生物、電子技術(shù)、醫(yī)學等多學科組成的技術(shù)手段。生物傳感器由信號轉(zhuǎn)換元件、生物分子識別元件組成，其原理是待檢測物和分子識別元件結(jié)合后，產(chǎn)生的熱、光或復合物等，會經(jīng)由信號轉(zhuǎn)換元件轉(zhuǎn)為光、電信號，以此來進行分析和檢測。生物傳感技術(shù)的應用，可以快速檢出食品中濃度比較低的病原菌。目前，生物傳感技術(shù)已廣泛用于食源性致病菌的檢測中。曾有學者借助該技術(shù)檢測大腸桿菌0157∶H7，不僅在10 min內(nèi)完成了檢測，且精度達10 CFU/mL。該技術(shù)的優(yōu)勢是使用樣本量少、重復性好、靈敏度高。但是由于當前尚處于研究階段，再加上檢測費用高，推廣難度比較大。

3.6 微流控技術(shù)

3.6.1 光學檢測

有研究基于激光誘導熒光檢測微流控芯片系統(tǒng)，對4種病原菌進行檢測，包括志賀氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、溶血性弧菌，結(jié)果顯示檢測限菌為102CFU/mL，標準偏差為0.7%～2.0%。該方法也可以用在人工接種食品中的多重PCR產(chǎn)物分析中。

3.6.2 電化學檢測

相較于光學檢測，電化學的作用不只體現(xiàn)在可移植性和微型化兩方面，更突出的是在檢測過程中，不會受樣品渾濁度的影響。有研究結(jié)合了3種技術(shù)，包括微流體、脲酶催化和電化學阻抗分子，采用“三明治”方法對李斯特氏菌進行捕獲，借助微流控檢測芯片對李斯特氏菌的數(shù)量進行測定。結(jié)果顯示，在30 min內(nèi)，捕獲率為93.0%；1 h內(nèi)，李斯特氏菌檢出限為 1.6×102CFU/mL。

4 結(jié)語

總的來講，每種檢測技術(shù)都有優(yōu)缺點，但隨著各種學科的共同進步與發(fā)展，聯(lián)合使用多種檢測技術(shù)勢必會提高檢測準確性，節(jié)約檢測時間，在食源性病原菌的控制、預防方面發(fā)揮重要作用。