賴(lài)立川，吳榮才，蒙丹麗，王浜琴△

廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.風(fēng)濕免疫科，廣西南寧 530021

我國(guó)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)發(fā)病率約為70/10萬(wàn)，20～40歲育齡期女性是其高發(fā)人群[1-4]。SLE的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，大量研究證實(shí)，SLE患者體內(nèi)存在多種自身抗體，故自身抗體檢測(cè)已逐漸成為診斷SLE及評(píng)估腎功能損害的參考項(xiàng)目之一[5-7]。其中抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體、抗史密斯(Sm)抗體已被證實(shí)可用于SLE的診斷。而抗核小體抗體(AnuA)與核小體可形成免疫復(fù)合物，參與機(jī)體免疫炎性反應(yīng)，同時(shí)，抗磷脂抗體可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，但關(guān)于酶聯(lián)抗體檢測(cè)上述血清抗體對(duì)SLE疾病活動(dòng)度的評(píng)估價(jià)值研究較少?；诖耍狙芯繎?yīng)用酶聯(lián)抗體檢測(cè)SLE多個(gè)血清抗體，并量化分析各抗體診斷SLE及評(píng)估疾病活動(dòng)度的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年3月本院收治的88例SLE患者(SLE組)及88例體檢健康者(對(duì)照組)為研究對(duì)象。根據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)性指數(shù)(SLEDAI)評(píng)分將SLE組分為輕度活動(dòng)組(46例)、中度活動(dòng)組(27例)、重度活動(dòng)組(15例)，輕度活動(dòng)為臨床穩(wěn)定，無(wú)明顯內(nèi)臟損害，SLEDAI評(píng)分<10分；中度活動(dòng)為SLE明顯累及重要臟器且需治療，SLEDAI評(píng)分為10～14分；重度活動(dòng)為SLE累及重要臟器，SLEDAI評(píng)分≥15分。SLE組男43例，女45例，平均年齡(43.66±12.15)歲，平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(23.49±2.25)kg/m2；對(duì)照組男40例，女48例，平均年齡(45.09±11.86)歲，平均BMI為(23.61±2.14)kg/m2。兩組間年齡、性別、BMI等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)SLE組均符合SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，滿(mǎn)足以下11項(xiàng)中4項(xiàng)或4項(xiàng)以上即可確診，包括頰部紅斑、盤(pán)狀紅斑、光過(guò)敏、口腔潰瘍、關(guān)節(jié)炎、漿膜炎、腎臟病變、神經(jīng)病變、血液學(xué)疾病、免疫學(xué)異常、抗核抗體陽(yáng)性；(2)對(duì)照組無(wú)自身免疫性疾病、血栓事件等。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)急慢性感染者；(2)處于妊娠期、產(chǎn)褥期或哺乳期等特殊時(shí)期的女性；(3)合并類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或其他風(fēng)濕性疾病者；(4)合并肝、腎等重要臟器器質(zhì)性病變者；(5)伴有再生障礙性貧血、白血病或其他血液系統(tǒng)疾病者；(6)近14 d內(nèi)服用過(guò)激素、免疫抑制劑等影響檢測(cè)結(jié)果的藥物；(7)合并嚴(yán)重聽(tīng)力障礙、失語(yǔ)或精神行為異常者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2方法 兩組研究對(duì)象入院后24 h內(nèi)于清晨8:00空腹抽取靜脈血5 mL，1 000×g離心20 min(離心半徑10 cm)，分離取血清，置于-20 ℃低溫保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、抗β2糖蛋白1(β2GP1)抗體、抗心磷脂抗體(ACA)，嚴(yán)格參照南京賽泓瑞生物科技有限公司提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，具體過(guò)程如下。(1)準(zhǔn)備工作：將所需試劑及標(biāo)本均平衡放置在20～26 ℃室溫下，充分混勻，以1∶40對(duì)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)清洗濃縮液進(jìn)行稀釋?zhuān)⒃O(shè)置復(fù)孔。(2)標(biāo)本檢測(cè)：將預(yù)先稀釋的抗dsDNA抗體(1 mL)、AnuA(1 mL)、抗Sm抗體(1 mL)及抗磷脂抗體ELISA低值陽(yáng)性對(duì)照、高值陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及稀釋后血清標(biāo)本分別置入微孔板，室溫條件下孵育30 min。棄去孔內(nèi)液體，并于各孔內(nèi)加入稀釋后洗滌液(300 μL)，吸除液體。重復(fù)上述清洗步驟2次后，于各孔內(nèi)均加入HRP IgG酶結(jié)合物(100 μL)，室溫條件下孵育30 min，重復(fù)上述清洗步驟。各孔內(nèi)均加入3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺底物液(100 μL)，室溫條件下避光孵育30 min。最后各孔內(nèi)均加入HRP終止液(100 μL)，終止反應(yīng)后60 min內(nèi)于450 nm處讀取各孔吸光度值。

1.3觀察指標(biāo) (1)比較兩組血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平。(2)分析血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA對(duì)SLE的診斷效能。(3)比較SLE組不同疾病活動(dòng)度患者血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平。(4)分析血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平與SLEDAI評(píng)分的相關(guān)性。(5)分析血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA評(píng)估SLE疾病活動(dòng)度的效能。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清抗體水平比較 SLE組抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清抗體水平比較

2.2各血清抗體診斷SLE的效能 ROC曲線分析顯示，抗Sm 抗體、IgG-β2GP1、AnuA、IgG-ACA、抗dsDNA 抗體、IgM-ACA、IgM-β2GP1診斷SLE 的曲線下面積(AUC)分別為0.839、0.837、0.831、0.811、0.809、0.761、0.741，特異度分別為87.50%、90.91%、90.91%、94.32%、90.91%、90.91%、93.18%。見(jiàn)圖1。

注：A為AnuA、抗dsDNA抗體、抗Sm抗體診斷SLE的ROC曲線；B為IgG-ACA 、IgG-β2GP1、IgM-ACA、 IgM-β2GP1診斷SLE的ROC曲線。

2.3SLE組不同疾病活動(dòng)度患者血清抗體水平比較 抗dsDNA抗體、AnuA、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平比較，重度活動(dòng)組高于中度、輕度活動(dòng)組，中度活動(dòng)組高于輕度活動(dòng)組(P<0.05)；抗Sm抗體在不同疾病活動(dòng)度患者間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 SLE組疾病不同活動(dòng)度患者各血清抗體水平比較

2.4各血清抗體與SLEDAI評(píng)分的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，抗dsDNA抗體(r=0.782)、AnuA(r=0.752)、IgG-β2GP1(r=0.913)、IgM-β2GP1(r=0.938)、IgG-ACA(r=0.940)、IgM-ACA(r=0.975)均與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)。

2.5各血清抗體評(píng)估SLE疾病活動(dòng)度的效能 ROC曲線分析顯示，抗dsDNA抗體評(píng)估輕、中度活動(dòng)的AUC為0.780，重度活動(dòng)的AUC為0.819；AnuA評(píng)估輕、中度活動(dòng)的AUC為0.791，重度活動(dòng)的AUC為0.801；IgG-β2GP1評(píng)估輕、中度活動(dòng)的AUC為0.744，重度活動(dòng)的AUC為0.792；IgM-β2GP1評(píng)估輕、中度活動(dòng)的AUC為0.708，重度活動(dòng)的AUC為0.750；IgG-ACA評(píng)估輕、中度活動(dòng)的AUC為0.771，重度活動(dòng)的AUC為0.792；IgM-ACA評(píng)估輕、中度活動(dòng)的AUC為0.783，重度活動(dòng)的AUC為0.815。見(jiàn)圖2、3。

注：A為AnuA、抗dsDNA抗體評(píng)估輕、中度活動(dòng)的ROC曲線； B為IgG-ACA 、IgG-β2GP1、IgM-ACA、 IgM-β2GP1評(píng)估輕、中度活動(dòng)的ROC曲線。

注：A為AnuA、抗dsDNA抗體評(píng)估重度活動(dòng)的ROC曲線； B為IgG-ACA 、IgG-β2GP1、IgM-ACA、 IgM-β2GP1評(píng)估重度活動(dòng)的ROC曲線。

3 討 論

SLE的發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明，研究顯示，SLE的發(fā)病過(guò)程中往往伴有T細(xì)胞參與和B細(xì)胞活化，一定程度上會(huì)侵犯多個(gè)器官與組織，產(chǎn)生多種免疫復(fù)合物，引起機(jī)體免疫調(diào)節(jié)紊亂，導(dǎo)致局部或全身性損傷[9-10]。同時(shí)，SLE患者外周血凋亡淋巴細(xì)胞會(huì)過(guò)度釋放自身抗原，產(chǎn)生一系列自身抗體[11-12]。因此，早期檢測(cè)自身抗體水平對(duì)輔助診治SLE具有積極作用。

抗Sm抗體是公認(rèn)的SLE標(biāo)記性抗體，在臨床應(yīng)用較為廣泛。本研究經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，抗Sm抗體診斷SLE的效能優(yōu)于抗dsDNA抗體、AnuA及抗磷脂抗體，特異度可達(dá)87.50%，與張樹(shù)君[13]研究結(jié)果一致。但SLE患者中抗Sm抗體陽(yáng)性者僅約30%，故抗Sm抗體陰性時(shí)無(wú)法排除SLE診斷，且單純檢測(cè)抗Sm抗體具有一定局限性，靈敏度較低[14-15]。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示抗Sm抗體與SLE患者疾病活動(dòng)度無(wú)關(guān)，與張宗瑋等[16]研究結(jié)果不一致，可能與納入患者數(shù)量及SLE病情有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

抗dsDNA抗體是SLE的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)之一，2012年通過(guò)SLE國(guó)際臨床協(xié)作組(SLICC)驗(yàn)證成為獨(dú)立診斷SLE的血清免疫學(xué)指標(biāo)，并作為監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)[17]。AnuA是SLE診斷的標(biāo)記性抗體，國(guó)內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，核小體能刺激機(jī)體產(chǎn)生AnuA，并誘導(dǎo)抗dsDNA抗體與組蛋白抗體生成[18]。本研究結(jié)果顯示，SLE患者血清抗dsDNA抗體、AnuA水平升高，與王之青等[19]、邢紅宇等[20]研究觀點(diǎn)相似，分析機(jī)制在于，抗dsDNA抗體通過(guò)與腎小球系膜細(xì)胞結(jié)合，參與細(xì)胞核內(nèi)成分反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，損傷腎臟，誘發(fā)狼瘡性腎炎，同時(shí)SLE患者機(jī)體免疫系統(tǒng)異常，導(dǎo)致核小體在體內(nèi)異常堆積，繼而刺激機(jī)體產(chǎn)生AnuA，從而引起腎組織損傷。進(jìn)一步經(jīng)Pearson相關(guān)性分析可知，抗dsDNA抗體、AnuA均與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)，結(jié)合孫佳瑩等[21]、麻貞貞等[22]研究推測(cè)機(jī)制在于，細(xì)胞死亡過(guò)程中會(huì)促使碎片結(jié)構(gòu)釋放，產(chǎn)生免疫逃逸，而抗原可刺激自身免疫淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生并形成免疫復(fù)合物，隨血液循環(huán)在腎小球基底膜及系膜區(qū)大量沉積，進(jìn)而刺激補(bǔ)體系統(tǒng)釋放大量相關(guān)細(xì)胞因子，過(guò)度消耗補(bǔ)體，從而增加急性腎功能衰竭的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，加重病情。因此，早期明確SLE患者血清抗dsDNA抗體、AnuA水平，可為臨床制訂個(gè)性化診療方案、控制疾病活動(dòng)度提供有效輔助手段。最后，本研究經(jīng)ROC曲線還發(fā)現(xiàn)，抗dsDNA抗體、AnuA診斷SLE的特異度均為90.91%，與李和軍等[23]采用免疫印跡法檢測(cè)的研究結(jié)果具有一致性，有力佐證了ELISA應(yīng)用于抗dsDNA抗體、AnuA檢測(cè)與免疫印跡法具有相似的特異度，但ELISA更加簡(jiǎn)便，易于批量操作，獲取客觀結(jié)果。

另外，由于抗磷脂抗體臨床表現(xiàn)缺乏特異性，故診斷依賴(lài)于ACA、抗β2GP1抗體等實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。根據(jù)2006年抗磷脂綜合征(APS)悉尼國(guó)際分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，IgG、IgM亞型的ACA、抗β2GP1抗體均為APS的診斷標(biāo)志物[24]。本研究通過(guò)對(duì)比研究可知，與體檢健康者比較，SLE患者IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平更高，這可能是由于SLE患者存在廣泛血管病變，血管壁損傷會(huì)刺激凝血系統(tǒng)，增強(qiáng)纖溶酶原激活抑制物活性，改變血栓調(diào)節(jié)蛋白活性，抑制蛋白C活化，引發(fā)獲得性抗活化蛋白C現(xiàn)象[25-26]。同時(shí)，本研究結(jié)果還表明，隨著SLE疾病活動(dòng)度加重，血清IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平出現(xiàn)升高趨勢(shì)，這與廖永強(qiáng)等[27]觀點(diǎn)相似，可能歸因于SLE患者體內(nèi)存在較強(qiáng)的補(bǔ)體活化，補(bǔ)體C3、C4水平顯著降低，從而參與炎性反應(yīng)，上調(diào)體內(nèi)多種炎癥因子表達(dá)，引發(fā)內(nèi)皮損傷，加重凝血-纖溶系統(tǒng)紊亂，引起繼發(fā)性APS，表現(xiàn)為反復(fù)形成動(dòng)靜脈血栓、紅細(xì)胞功能異常等，加重組織與器官損傷[28]。進(jìn)一步經(jīng)ROC曲線分析可知，ACA、抗β2GP1抗體對(duì)SLE疾病活動(dòng)度具有較高的評(píng)估價(jià)值。說(shuō)明早期采用酶聯(lián)抗體檢測(cè)抗磷脂抗體水平，對(duì)評(píng)估SLE疾病活動(dòng)度、預(yù)防臟器損傷具有指導(dǎo)意義。但其是否能作為反映SLE患者疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的生物標(biāo)志物，今后仍需進(jìn)行大樣本量、多中心的研究。

綜上所述，SLE患者血清抗dsDNA抗體、AnuA、抗Sm抗體及抗磷脂抗體水平明顯升高，且抗dsDNA抗體、AnuA及抗磷脂抗體水平與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)，早期采用酶聯(lián)抗體檢測(cè)上述自身抗體水平，對(duì)SLE的診斷、疾病活動(dòng)度評(píng)估具有重要意義。