王小明，蔣婷奇，譚躍浪，方 蕾

（1.浙江巨泰藥業(yè)有限公司，浙江 衢州 32400；2.普洛藥業(yè)股份有限公司，浙江金華 322199）

阿莫西林是一種β-內(nèi)酰胺類的青霉素類抗菌素，臨床上廣泛使用?？芍委煻喾N細菌感染引起的疾病，包括喉炎、肺炎、皮膚感染、泌尿道感染等[1]。我國有207 個阿莫西林膠囊批準文號。某公司產(chǎn)品自獲批以來，一直執(zhí)行《中國藥典》標準[2]。根據(jù)《國務院辦公廳關于開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價的意見》（國辦發(fā)〔2016〕8 號）要求，進行阿莫西林膠囊一致性評價質(zhì)量研究[3]。以2015 年版《中國藥典》（二部）（ChP2015）收載質(zhì)量標準為依據(jù)，參考美國藥典40 版（USP40）、《日本藥典（17版）》（JP17）、《英國藥典2017 版》（BP2017）等質(zhì)量標準，對有關物質(zhì)的分析方法進行優(yōu)化[4-6]。

1 實驗部分

1.1 儀 器

Agilent 1260 高效液相色譜儀，包括Agilent VWD、Agilent Openlab CDS 工作站；XS 105 電子天平，精度1/105；XPE26電子天平，精度1/106。

1.2 試 劑

實驗所用對照品請見表1。

表1 實驗品對照Tab 1 List of reference substances

阿莫西林膠囊，自制產(chǎn)品，批號分別為Q02171201、 Q02171202、 Q02171203， 規(guī) 格 為0.25 g；參比制劑：持證商為Beecham Group plc，批號2368，規(guī)格為0.25 g。

磷酸二氫鉀、氫氧化鉀，分析純；甲醇，色譜純；水，超純。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法篩選

阿莫西林膠囊質(zhì)量標準在《中國藥典》2015 年版（二部）（ChP2015）、美國藥典40 版（USP40）、《日本 藥 典（17 版）》（JP17）、《英 國 藥 典2017 版》（BP2017）均有收載，其中USP40中只收載了阿莫西林有關物質(zhì)，膠囊未收載有關物質(zhì)檢查項；BP 阿莫西林原料和膠囊的質(zhì)量標準均包含有關物質(zhì)檢測項，檢測方法基本相同；EP 收載了阿莫西林原料的質(zhì)量標準，與BP標準基本一致。

2.1.1 不同有關物質(zhì)方法比較

分別配制雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)I、雜質(zhì)J、雜質(zhì)L溶液及阿莫西林與以上各雜質(zhì)的混合溶液作為系統(tǒng)適用性溶液，使用ChP2015、EP9.0 及USP40 有關物質(zhì)方法分別進樣，色譜見圖1～圖3。

圖1 《中國藥典》系統(tǒng)適用性溶液色譜Fig 1 Applicable solution chromatogram of Chinese Pharmacopoeia system

圖2 EP系統(tǒng)適用性溶液色譜Fig 2 Applicable solution chromatogram of EP system

由圖1～圖3 可知，《中國藥典》及EP 雜質(zhì)F均為負峰，且雜質(zhì)D、雜質(zhì)E 及雜質(zhì)J 均有未檢出情況，USP 各雜質(zhì)均能檢出并且能夠有效分離?！吨袊幍洹芳癊P 的檢測波長均為254 nm，該波長為阿莫西林的最低吸收波長，不利于有關物質(zhì)的檢測。

圖3 USP系統(tǒng)適用性溶液色譜Fig 3 Applicable solution chromatogram of USP system

綜上所述，選擇USP 有關物質(zhì)分析方法為本品的有關物質(zhì)分析方法。

2.1.2 色譜柱選擇

采用不同廠家的色譜柱，以USP有關物質(zhì)分析方法對系統(tǒng)適用性溶液進行考察，Ultimeate AQC18 4.6 mm×100 mm，5 μm色譜柱，雜質(zhì)A與雜質(zhì)B重合；Spursil C18 4.6 mm×100 mm，5 μm色譜柱，雜質(zhì)A 與雜質(zhì)B 分離不佳，雜質(zhì)E2 與雜質(zhì)C 重合；Pack ODS-AQ 4.6 mm×100 mm，5 μm 色譜柱，雜質(zhì)A 與主峰重合；ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm色譜柱，各雜質(zhì)分離良好，見圖4。

圖4 ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm系統(tǒng)適用性溶液色譜Fig 4 Applicable solution chromatogram of Thermo(ODS HYPERSIL 4.6×100 mm,5 μm)system

故使用色譜柱ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm訂入質(zhì)量標準。

2.1.3 3批樣品檢測結(jié)果比較

對工藝驗證3 批樣品使用變更前《中國藥典》、變更后的有關物質(zhì)方法分別進行檢測，考察雜質(zhì)檢出個數(shù)及雜質(zhì)檢出量，變更后方法在雜質(zhì)檢出個數(shù)上優(yōu)于變更前的方法，結(jié)果見表2。

表2 阿莫西林膠囊有關物質(zhì)分析方法變更前后比較Tab 2 Comparison before and after the change of analytical methods for related substances in amoxicillin capsules

2.2 分析方法的驗證

待驗證的方法為：取樣品適量，精密稱量，加流動相A 溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含阿莫西林（按C16H19N3O5S計）1.25 mg的溶液，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；另取阿莫西林對照品適量，精密稱量，加流動相A溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含阿莫西林（按C16H19N3O5S計）12.5 μg的溶液，作為對照溶液。照高效液相色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0512）測定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm）；以2.72 g/L磷酸二氫鉀溶液（以1 mol/L的氫氧化鉀或質(zhì)量分數(shù)20%磷酸調(diào)節(jié)pH 至5.0）為流動相A；甲醇為流動相B；檢測波長為210 nm；體積流量1.5 mL/min；柱溫40 ℃，樣品溫度4 ℃。按表3線性梯度洗脫。

表3 梯度洗脫程序Tab 3 Table of gradient elution procedures

精密量取供試品溶液及對照品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜，供試品溶液中如有雜質(zhì)峰，按外標法以峰面積計算，雜質(zhì)A（相對保留時間為0.78）的質(zhì)量分數(shù)不得大于0.5%，其他單個雜質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)不得大于1.0%，總雜的質(zhì)量分數(shù)不得大于5.0%，供試品溶液色譜中小于對照溶液主峰面積0.03倍的峰忽略不計。

參照文獻[7]等，對本樣品的有關物質(zhì)測定方法進行了方法學驗證。

2.2.1 系統(tǒng)適用性及儀器精密度

取系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)進樣6針，計算保留時間及峰面積的相對標準偏差（RSD）。結(jié)果表明，雜質(zhì)與雜質(zhì)、雜質(zhì)與主峰之間分離度均≥1.5，6 針保留時間RSD≤1.0%，主峰、雜質(zhì)峰面積的RSD分別≤2.0%、≤5.0%。表明該方法系統(tǒng)的影響及儀器精密度良好。

2.2.2 濾膜吸附

將系統(tǒng)適用性溶液及供試品溶液用0.45 μm的水相膜過濾。分別棄去不同初濾液進樣，與未過濾或離心樣品進行峰面積的比較，記錄色譜。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性溶液及供試品溶液濾膜均無吸附。

2.2.3 專屬性

分別進樣雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)I、雜質(zhì)J、雜質(zhì)L、雜質(zhì)M、阿莫西林、阿莫西林與各雜質(zhì)混合溶液、空白溶劑、空白輔料，記錄色譜。結(jié)果表明，各雜質(zhì)及阿莫西林單獨進樣與混合進樣保留時間一致，空白溶劑及空白輔料無干擾。

2.2.4 定量限

精密稱取各雜質(zhì)對照品及阿莫西林對照品適量，用稀釋劑依次稀釋進樣，直至信噪比（S/N）至10～20，作為定量限溶液。再平行配制6 份定量限含量溶液，進樣，計算精密度。定量限的質(zhì)量濃度ρ和相當于樣品的質(zhì)量濃度的分數(shù)w如表4所示。

表4 定量限結(jié)果匯總Tab 4 Summary of limits of quantitation results

由表4可知，各雜質(zhì)及阿莫西林保留時間精密度RSD符合規(guī)定。

2.2.5 檢測限

精密移取定量限含量溶液3 mL 置10 mL 容量瓶中，加稀釋劑至刻度，搖勻，配制成檢測限溶液，進樣，檢測結(jié)果如表5。

表5 檢測限結(jié)果匯總Tab 5 Summary of detection limit results

2.2.6 線性與范圍

以阿莫西林對照品及各雜質(zhì)對照品分別配制對照含量的30%、50%、80%、100%、120%及雜質(zhì)含量限的溶液分別進樣。以質(zhì)量濃度ρ為橫坐標，響應因子為縱坐標，以定量限濃度到120%含量進行線性回歸計算，r≥0.990、響應因子RSD≤10%、y0/y100≤25%（y為縱軸，y0/y100表示在y軸上的截距），并計算校正因子。結(jié)果見表6。

表6 線性與范圍結(jié)果Tab 6 Summary of linear and range results

由表6可知，各雜質(zhì)及阿莫西林在實驗濃度范圍內(nèi)與峰面積均呈顯著線性關系。

2.2.7 準確度

采用加樣回收。配制供試品含量的樣品溶液，分別加入雜質(zhì)含量限度的50%、100%、120%的雜質(zhì)溶液，每個含量平行配制3 份，分別計算9份樣品的回收率并計算平均回收率及RSD。結(jié)果表明，各雜質(zhì)回收率均在92%～105%，RSD≤2%。

2.2.8 精密度、重復性

配制對照品溶液1份，供試品溶液6份分別進樣，計算6份供試品的雜質(zhì)質(zhì)量。結(jié)果表明，重復性各樣品雜質(zhì)個數(shù)與雜質(zhì)質(zhì)量無明顯差異，即重復性良好。

2.2.9 溶液穩(wěn)定性

精密稱取阿莫西林對照品、樣品約14.5、29 mg，置20 mL 量瓶中，用稀釋劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，4 ℃放置，分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h 進樣，考察主成分峰面積的變化情況。結(jié)果表明：對照品溶液在4 ℃條件下，8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.10 耐用性

取對照品溶液及供試品溶液，適當?shù)恼{(diào)節(jié)柱溫、流動相A 的pH 及不同色譜柱，考察色譜條件變化后的有關物質(zhì)結(jié)果情況。結(jié)果表明。通過考察柱溫（±2 ℃）、流動相A 的pH（4.98～5.10）、色譜柱的改變，供試品雜質(zhì)個數(shù)與雜質(zhì)量均無明顯差異，本法耐用性良好。

3 結(jié) 論

1）通過對不同國家藥典中阿莫西林膠囊有關物質(zhì)方法進行對比研究，《中國藥典》及EP雜質(zhì)F均為負峰且雜質(zhì)D、雜質(zhì)E 及雜質(zhì)J 均有未檢出情況，USP各雜質(zhì)均能檢出并且能夠有效分離?！吨袊幍洹芳癊P的檢測波長均為254 nm，該波長為阿莫西林的最低吸收波長，不利于有關物質(zhì)的檢測。故參照USP 阿莫西林原料有關物質(zhì)方法建立本產(chǎn)品的有關物質(zhì)測定方法。

2）通過對不同批號色譜柱的考察，將色譜柱廠家及型號規(guī)格訂入質(zhì)量標準（色譜柱為ODS HYPERSIL 4.6 mm×100 mm，5 μm）。

3）進行系統(tǒng)適用性與儀器精密度、濾膜吸附、專屬性、定量限、檢測限、線性與范圍、準確度、精密度、溶液穩(wěn)定性、耐用性實驗，結(jié)果均符合要求，表明本研究中建立的方法準確、真實，對本品雜質(zhì)能更有效分離。新建方法每針運行時間為31 min，比ChP2015少24 min，且流動相組成中有機相比例更低，對阿莫西林膠囊有關物質(zhì)測定方法提供借鑒。