張賢平， 陳菲菲， 張 衡， 陳俊毅， 王銳英， 何 鵬， 高 峰， 黃昌釗

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541000)

近年來，周圍神經(jīng)損傷的病例數(shù)逐年增加，相關(guān)的診治成為了一大熱點及難點。手術(shù)的修復(fù)只是為神經(jīng)再生提供了基礎(chǔ)，人們還采取各種方法促進后續(xù)的功能恢復(fù)，其中藥物首當其沖[1]。如今臨床上常用的藥物有各類神經(jīng)生長因子，但是其昂貴的價格難以成為患者的首選。本實驗以家兔用鉗夾法[2]造模，模擬人周圍神經(jīng)擠壓傷，以期探索天麻素對外周神經(jīng)擠壓傷的療效及對神經(jīng)損傷的修復(fù)作用，為臨床治療周圍神經(jīng)損傷提供新的藥物選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 40只健康雄性新西蘭白兔(編號1107261911000699，動物生產(chǎn)許可證號SCXX(湘)2019-0015；級別為普通級)，體質(zhì)量1.5～2 kg，平均1.8 kg，由長沙市天勤生物科技有限公司提供，已經(jīng)過桂林醫(yī)學院動物實驗倫理審查。

分組，將40只實驗兔采用隨機數(shù)字表的方法分為模型對照組(生理鹽水5 mL/kg)、天麻素低劑量組(200 mg/kg肌注)、天麻素高劑量組(400 mg/kg肌注)、陽性藥組(甲鈷胺0.5 μg/kg肌注)，每組10只，分籠專人飼養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 天麻素注射液(中國陜西博森生物制藥有限公司，批號20099312)。甲鈷胺注射液(中國衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號396200652)；注射用青霉素鈉(哈藥集團制藥六廠，批號0171909310)；GAP43 抗體(英國Abcam公司，貨號33-5000)；辣根過氧化酶標記的抗兔IgG抗體(英國Abcam公司，貨號ZB-2301)；免疫熒光二抗(美國Affinity公司，貨號S0017)。

1.3 儀器 16 cm全齒血管彎鉗(上海鑫閔生物科技有限公司)；石蠟切片機、超薄切片機(德國Leica公司)；分析天平、游標卡尺(北京第二精密量具廠)；Biolap98智能型生物信號系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1 動物造模 以3.6%水合氯醛(10 mL/kg)沿兔耳緣靜脈注射麻醉后，將兔子呈俯臥位固定。依次備皮，消毒，鋪巾。從髂后上棘下縱行切開實驗兔左大腿后外側(cè)皮膚,逐層分離肌肉，找到并暴露坐骨神經(jīng),在距梨狀肌下緣約1.5 cm處用塑料膜覆蓋的16 cm全齒血管彎鉗的尖端鎖致全扣夾住神經(jīng)5 min，可見神經(jīng)纖維變薄但未離斷。在夾傷處神經(jīng)外膜用8-0顯微外科縫線做1標記，然后用3-0絲線逐層縫合皮膚，碘伏消毒，包扎傷口。術(shù)后繼續(xù)分籠專人飼養(yǎng)，術(shù)后連續(xù)3 d予注射青霉素鈉及碘伏消毒傷口預(yù)防感染，7 d后拆除縫線。

2.2 給藥與飼養(yǎng) 造模成功后，低劑量組予天麻素200 mg/kg，高劑量組予天麻素400 mg/kg，陽性藥組予肌注甲鈷胺注射液50 μg/kg，模型對照組予0.9%氯化鈉注射液5 mL/kg。連續(xù)給藥4周，期間動物由專人喂養(yǎng)，喂養(yǎng)條件相同。

2.3 檢查方法與指標

2.3.1 大體觀察 術(shù)后每日觀察實驗兔的步態(tài)，傷口愈合情況，是否感染；是否出現(xiàn)自嗜現(xiàn)象；足趾與足底是否有潰瘍，肌肉萎縮情況。

2.3.2 坐骨神經(jīng)功能評分 ①趾張反射，提起實驗兔頸部皮膚，使其下落卻不著地。正常兔的反應(yīng)為放射性腳趾打開，而坐骨神經(jīng)受損的表現(xiàn)則減弱甚至消失。以腳趾開合程度分級為1級, 腳趾完全沒分開；2級, 稍微分開；3級, 明顯分開, 但低于傷前水平；4級, 恢復(fù)至傷前水平，分別記1～4分。②改良Tarlov評分，0級, 肢體完全癱瘓, 對針刺無反應(yīng)；1級, 針刺僅可見有輕微反應(yīng)；2級, 損傷側(cè)后肢所有關(guān)節(jié)有自主運動, 但不存在抵抗能力；3級, 具有抵抗手壓能力, 步態(tài)仍不穩(wěn)；4級, 步態(tài)恢復(fù)至傷前水平，分別記0～4分。以上2項之和為每只實驗兔的坐骨神經(jīng)功能評分。

2.3.3 神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢查 術(shù)后第1、2、3、4周將實驗兔麻醉后暴露患側(cè)坐骨神經(jīng)，使用Biolap98智能型生物信號顯示與處理系統(tǒng)進行電生理檢測，使用游標卡尺計算兩電極間的距離，記錄傳導(dǎo)時間，計算神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

2.3.4 組織學檢查 術(shù)后第4周取實驗兔坐骨神經(jīng)鉗夾處神經(jīng)標本，進行常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE staining)，在光學顯微鏡下觀察病理情況及拍照。

2.3.5 靶肌肉恢復(fù)率 處死實驗兔后完整取下兩側(cè)小腿三頭肌并稱定質(zhì)量，計算其恢復(fù)率(恢復(fù)率=患側(cè)肌濕重/健側(cè)肌濕重×100%)。

2.3.6 神經(jīng)生長相關(guān)蛋白GAP-43的表達及累計吸光度 處死后取各組實驗兔坐骨神經(jīng)受損處橫斷面，按試劑盒說明書操作行GAP-43免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，用Image Plus 6.0進行累吸光度分析。

3 結(jié)果

3.1 大體觀察 手術(shù)過程中實驗兔因麻醉死亡3只，補齊后實驗順利。術(shù)后各組兔子未見明顯感染跡象。術(shù)后個別實驗兔傷口出現(xiàn)潰瘍情況，少部分出現(xiàn)自嗜現(xiàn)象。模型對照組實驗兔傷口處潰瘍較其余組大，自嗜現(xiàn)象更為嚴重。術(shù)后1周實驗兔肌力差，刺激無明顯反應(yīng)，后肢拖地現(xiàn)象嚴重，四組之間未見明顯差異；術(shù)后第2周，模型對照組和低劑量組未見明顯好轉(zhuǎn)，高劑量組和陽性藥組實驗兔肌力有所恢復(fù)，偶見縮足與舔足行為，但仍有跛足現(xiàn)象；術(shù)后4周高劑量組和陽性藥組組實驗兔步態(tài)較前明顯好轉(zhuǎn)，手握其后腿感受后蹬力明顯強勁，刺激反應(yīng)也更加明顯，見圖1～2。

圖1 術(shù)后1周開始模型對照組實驗兔出現(xiàn)嚴重的自嗜現(xiàn)象

注：模型對照組和低劑量組可見受損神經(jīng)菲薄，外膜出血現(xiàn)象仍明顯。高劑量組和陽性藥組可見受損神經(jīng)近乎正常形態(tài)，外膜血腫也基本消退，但仍然可見局部粘連。

3.2 坐骨神經(jīng)功能評分 本實驗根據(jù)趾張反射與改良Tarlov評分標準對各組實驗兔進行了客觀的評分及統(tǒng)計，計算出了坐骨神經(jīng)功能評分值，可見高劑量和陽性藥組評分在各個時間段均優(yōu)于模型對照組(P<0.05，P<0.01)，而低劑量組在各個時間段較模型對照組無明顯變化(P>0.05)，見表1。

表1 不同時間點各組實驗兔的坐骨神經(jīng)指數(shù)

3.3 神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測 術(shù)后第1、2、3、4周分別將各組實驗兔麻醉后暴露患側(cè)坐骨神經(jīng)，以Biolap98生物信號系統(tǒng)進行神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測。結(jié)果顯示，在4個時間段，高劑量組和陽性藥組神經(jīng)傳導(dǎo)速度均大于模型對照組(P<0.05，P<0.01)，低劑量組與模型對照組比較無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 電生理統(tǒng)計圖

3.4 組織病理學檢查 術(shù)后4周取各組實驗兔左側(cè)坐骨神經(jīng)沿神經(jīng)長軸切片行HE染色，于光鏡下觀察顯示，高劑量組和陽性藥組神經(jīng)損傷處神經(jīng)纖維排列較整齊且致密，雪旺細胞增殖較多，模型對照組和低劑量組神經(jīng)纖維排列凌亂切疏松，且雪旺細胞較少，炎癥細胞較多，見圖3。

圖3 4周后處死實驗兔取得坐骨神經(jīng)行HE染色結(jié)果(×40，標尺50 μm)

3.5 靶肌肉恢復(fù)率 處死實驗兔后完整取下其兩側(cè)小腿三頭肌，計算其靶肌肉恢復(fù)率，得出高劑量組和陽性藥組恢復(fù)率均大于模型對照組(P<0.05)，低劑量組較模型對照組無明顯變化(P>0.05)，見表3。

表3 靶肌肉恢復(fù)率

3.6 神經(jīng)生長相關(guān)蛋白GAP-43的表達水平及累計吸光度 4周后處死取各組實驗兔坐骨神經(jīng)受損處橫斷面，行GAP-43免疫熒光染色并進行累計吸光度分析，可見，高劑量組和陽性藥組組神經(jīng)生長相關(guān)蛋白GAP-43表達量遠多于模型對照組，低劑量組相較模型對照組卻無明顯差異。累計吸光度高劑量組和陽性藥組均高于模型對照組(P<0.05，P<0.01)，低劑量組對比模型對照組無明顯變化(P>0.05)，見圖4～5。

圖4 受損神經(jīng)橫斷面GAP-43免疫熒光染色(×100)

注：與模型對照組比較，#P<0.05,##P<0.01。

4 討論

神經(jīng)擠壓傷是臨床傷常見的致殘性疾病，常由外傷、腫瘤壓迫、炎癥等所致。本實驗所采取的神經(jīng)鉗夾傷是目前被廣泛認可且被應(yīng)用的一種造模方法，很好地模擬了人周圍神經(jīng)擠壓傷的病理生理，主要表現(xiàn)為損傷后軸索斷裂，而神經(jīng)外膜，內(nèi)膜及束膜依舊保持著連續(xù)性，神經(jīng)傳導(dǎo)軸漿流經(jīng)過受損處時受阻，神經(jīng)傳導(dǎo)速度即下降[3]。隨后鈣離子聚集，激活相關(guān)的蛋白酶，導(dǎo)致受損部位髓鞘崩解，發(fā)生脫髓鞘反應(yīng)。接著炎性細胞聚集，吞噬崩解產(chǎn)物[4]。起到關(guān)鍵因素的雪旺細胞開始增殖，它一方面協(xié)助吞噬細胞清理破裂的軸突碎片，另一方面形成為Bungner帶，為新生的軸突“搭橋”，同時還分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子[5]。然后，新生軸芽沿著Bungner帶通向靶器官，再次髓鞘化，神經(jīng)得到新生[6]。

天麻素為天麻的主要有效成分之一，被廣泛運用于治療頭痛、癲癇、頭暈等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[7]，在現(xiàn)代藥理學中，天麻素被證明了具有保護神經(jīng)元與抗氧化性損傷的功效[8-15]，同時能降低炎性因子的表達[16-19]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的運用中已較為廣泛。近年來在對周圍神經(jīng)損傷的研究中，天麻素被發(fā)現(xiàn)可以促進雪旺細胞的增殖[20]，還可以刺激腦源性生長因子的分泌[21]。甲鈷胺是現(xiàn)在臨床上常見的用于治療周圍神經(jīng)損傷的藥物，將其作為本實驗的陽性藥物作為對比。在正式實驗開始前本實驗組就天麻素的用量進行了預(yù)實驗，實驗分別設(shè)置了100、200、400、800 mg/kg梯度劑量組，結(jié)果顯示最低劑量組療效甚微，而最高劑量組出現(xiàn)了數(shù)只實驗兔精神狀況萎靡，進食差甚至死亡的情況，考慮為藥物濃度過大所致，因此本實驗天麻素選擇的劑量梯度為200、400 mg/kg。通過組織學染色發(fā)現(xiàn)天麻素高劑量組及陽性藥組受損神經(jīng)處炎性細胞浸潤較少，雪旺細胞增殖更甚及新生軸突較多且排列更致密；電生理是反應(yīng)神經(jīng)功能恢復(fù)的客觀指標，其結(jié)果也同樣顯示高劑量組的神經(jīng)傳導(dǎo)速度較優(yōu)，這意味著受損部位的軸索得到了相對較好的修復(fù)；小腿三頭肌作為坐骨神經(jīng)的靶肌肉，其恢復(fù)率也表明支配其的坐骨神經(jīng)功能得到了改善；GAP-43作為周圍神經(jīng)損傷后再連接的標志性蛋白可以很好地反應(yīng)神經(jīng)的修復(fù)與新生，天麻素高劑量組及陽性藥組的免疫熒光及吸光度皆優(yōu)于低劑量及模型對照組，意味著前者對受損神經(jīng)的再生起著良好的推動作用；同時也觀察到了隨著治療，高劑量組的實驗兔在行為學上的表現(xiàn)也有顯著的好轉(zhuǎn)。通過以上結(jié)果可以表明一定劑量的天麻素對損傷后多種因素的正向調(diào)節(jié)促進著神經(jīng)的修復(fù)。

本實驗證明了天麻素對實驗兔神經(jīng)擠壓傷的恢復(fù)具有積極意義，并且有著一定的量效關(guān)系。天麻素作為中藥提取物，有著不良反應(yīng)小，吸收與代謝較快并且價格較為低廉的特點，相信隨著進一步的研究，這些特點可能會成為天麻素在治療周圍神經(jīng)損傷領(lǐng)域的優(yōu)勢所在。但是天麻素促進神經(jīng)修復(fù)地分子機制還尚不明確，這也是本課題組下一步會努力的方向。