胡婭南 劉 欣 賀 勤 胡 爽 申 琳 張 馳 李卓穎 楊作成

（中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院兒科，長(zhǎng)沙410013）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一種影響嬰幼兒的中小型血管的炎性疾病，臨床上又稱(chēng)皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征［1］。KD 通常表現(xiàn)為發(fā)熱、皮膚黏膜變化和淋巴結(jié)腫大，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，部分病例預(yù)后并不理想［2］。有研究認(rèn)為，KD 是由免疫功能障礙引起的急性血管炎，伴有細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞病變。輔助性T細(xì)胞（T helper cell，Th）-17是一種可通過(guò)產(chǎn)生IL-17、IL-22 等細(xì)胞因子在自身免疫炎癥發(fā)展中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞亞群［3］。其中IL-17家族的成員A 和F 可作用于多種細(xì)胞，以誘導(dǎo)IL-6、TNF-α、IL-8、趨化因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等的表達(dá)，并可使組織炎癥持續(xù)存在［4-5］。也有研究表明，KD 患者急性期血清IL-17 及其誘導(dǎo)的細(xì)胞因子水平明顯增加［6］。彭茜等［7］研究表明，KD 與CD40、B 淋巴細(xì)胞激酶和 Fcγ 受體Ⅱα 基因、主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，HLA）的基因多態(tài)性有關(guān)［7］。目前未見(jiàn) IL-17F 基因rs763780 位點(diǎn)多態(tài)性與KD 關(guān)聯(lián)性的有關(guān)報(bào)道。為此，本研究探討IL-17F 基因rs763780 位點(diǎn)多態(tài)性與KD 及其 KD 合并冠脈損傷（coronary artery injury，CAI）的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 資料 選取2015 年至2018 年在湖南省中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院兒科住院治療的100 例KD 兒童為KD 組，入選標(biāo)準(zhǔn)：①均符合 KD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］；②年齡范圍為3 個(gè)月~8 歲；③入院前均未接受過(guò)丙種球蛋白和阿司匹林治療。且按照心臟彩超的檢查結(jié)果，根據(jù)有無(wú)合并CAI將KD 組進(jìn)一步分為CAI亞組和非CAI 亞組（NCAI 亞組）。其中CAI 亞組的診斷指標(biāo)［8］為：①≤3 歲患兒，冠脈內(nèi)徑>2.5 mm；②3 歲<患兒≤9 歲，冠脈內(nèi)徑>3 mm；③9 歲<患兒≤14 歲，冠脈內(nèi)徑>3.5 mm；④冠脈中有某一節(jié)段的內(nèi)徑是相鄰段的1.5 倍以上；⑤管壁出現(xiàn)明顯的不規(guī)則。選擇同期在湖南省中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院兒童健康管理中心體檢的100 例健康兒童作為對(duì)照組，入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡、性別和KD 組相匹配；②既往無(wú)KD 病史；③排除心血管疾病、風(fēng)濕性疾病以及感染性疾病等。

以上兩組研究對(duì)象均為漢族人群。所有入組兒童家長(zhǎng)均已簽署知情同意書(shū)，研究在中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行。

入選 KD 組共 100 例，其中男 64 例，女 36 例，平均年齡（3.4±1.8）歲；對(duì)照組共100例，其中男60例，女40 例，平均年齡（3.8±1.9）歲。兩組兒童的性別和年齡相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05），組間有可比性。臨床資料顯示，100%的KD 組患兒有發(fā)熱表現(xiàn)，口唇充血皸裂、“楊梅舌”及頸部非化膿性淋巴結(jié)腫大是出現(xiàn)較多的臨床癥狀。100 例KD 組中有22 例患兒發(fā)生冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張。KD 組臨床資料見(jiàn)表1。

表1 KD組患兒臨床資料Tab.1 Clinical data of KD

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及基因組DNA 提取 取得入組兒童家屬同意后，EDTA 抗凝采血管采集各組患兒靜脈血標(biāo)本3 ml。依照北京全式金生物技術(shù)有限公司的核酸純化試劑盒（BloodZol）說(shuō)明書(shū)，對(duì)基因組DNA 進(jìn)行提取。經(jīng)分光光度（紫外吸收）法檢測(cè)DNA純度和濃度后，于-80℃保存。

1.2.2 IL-17F 基因多態(tài)性檢測(cè) 基因擴(kuò)增-聚合酶鏈限制性長(zhǎng)片段法（PCR-RFLP）檢測(cè)IL-17F 基因rs763780 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP），引物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司合成。IL-17F/rs763780 位點(diǎn)引物序列：引物F：5'-CCATCCGTGCAGGTCTTATT-3'，引物R：5'-ATGCCTCACCATTGTGCTTT-3'。 PCR 反 應(yīng) 體 系 為25 μl 體系，條件為：①94℃，5 min；②（94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，30 s）×35 個(gè)循環(huán)；③72℃，10 min。行PCR 擴(kuò)增后，其產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。直接測(cè)序法測(cè)定目的基因序列：檢測(cè)目的基因片段存在后，送往上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，使用SnapGene軟件分析測(cè)序結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析使用SPSS20.0 軟件，計(jì)量資料均以表示，計(jì)數(shù)資料使用χ2檢驗(yàn)，各組IL-17F基因rs763780位點(diǎn)基因型和等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各基因型頻率的遺傳平衡性采用遺傳平衡定律（又稱(chēng)Hardy-Weinberg 定律）檢驗(yàn)，P>0.05 表示樣本具有群體代表性。采用在線SHEsis 軟件進(jìn)行IL-17F基因位點(diǎn)的連鎖不平衡和單倍型分析。

2 結(jié)果

2.1 IL-17F/rs763780 位點(diǎn)片段PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果 經(jīng)檢測(cè)，基因組DNA 的OD260/OD280均在1.7～2.0 范圍內(nèi)，符合要求。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，IL-17F基因 rs763780 位點(diǎn) PCR 產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為405 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，見(jiàn)圖1。

圖1 IL-17F基因rs763780位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of locus IL-17F rs763780

2.2 IL-17F基因rs1889570 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布 兩組的基因型頻率經(jīng)Hardy-Weinberg定律檢驗(yàn)，χ2值為2.040 8 和0.001 1，P均>0.05，表明樣本選取有群體代表性。通過(guò)直接測(cè)序法檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，SnapGene 軟件分析測(cè)序結(jié)果，IL-17F基因rs763780位點(diǎn)存在的基因型有3種，分別為T(mén)T、TC和CC，見(jiàn)圖2。

圖2 IL-17F基因rs763780位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測(cè)序圖Fig.2 Direct sequencing graph of PCR products of locus IL-17F rs763780

在 rs763780 位點(diǎn)，KD 組和對(duì)照組均有 TT、TC和CC 三種基因型，且兩組的基因型頻率分布順序由高到低均為T(mén)T 型、TC 型、CC 型。兩組的基因型頻數(shù)分布及T、C 等位基因頻率相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.21、0.92，P均>0.05）。CAI 亞組在rs763780 位點(diǎn)有 TT、TC 和 CC 三種基因型，而 NCAI亞組僅有TT、TC 兩種基因型。但CAI 亞組與NCAI亞組比較，基因型頻數(shù)分布的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.85，P>0.05），且T、C 等位基因頻率的差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.07，P>0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組中IL-17F基因rs763780位點(diǎn)多態(tài)性的基因型分布及等位基因頻率比較［n（%）］Tab.2 Comparison of genotype distribution and allele frequency of locus IL-17F rs763780 polymorphism in each group［n（%）］

3 討論

KD 是一種與心血管后遺癥相關(guān)的急性系統(tǒng)性血管炎。目前認(rèn)為KD 與多基因相關(guān)，并可在急性期患者體內(nèi)觀察到血清中的細(xì)胞因子含量顯著升高［2，9］。SNP 的變化可影響蛋白質(zhì)的表達(dá)及功能，繼而導(dǎo)致個(gè)體對(duì)于某些疾病的易感性出現(xiàn)變化［10］?，F(xiàn)已確定了大量細(xì)胞因子的多態(tài)性與KD 易感性的關(guān)聯(lián)性，并在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)與KD患者發(fā)生CAI的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)的基因，包括IL-10 啟動(dòng)子的多態(tài)性、MMP-13 基因的功能多態(tài)性、炎癥基因CRP 的多態(tài)性和TNF-α基因等［11-14］。

IL-17 是由 Tc17 細(xì)胞、NKT 細(xì)胞和 Th17 細(xì)胞等多種細(xì)胞群體產(chǎn)生的，因其在自身免疫中發(fā)揮的促炎作用而備受關(guān)注［15］。IL-17F 和 IL-17A 的細(xì)胞來(lái)源和功能相似，且有研究提示IL-17F 的功能可能比IL-17A 更重要［15-17］。有研究報(bào)道 KD 患兒的血清 IL-17 水平明顯增加［6，18］，但目前尚未對(duì) IL-17F 基因與KD 的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究。本研究中rs763780 位點(diǎn)位于IL-17F 基因的3'編碼區(qū)，此位點(diǎn)的堿基發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致IL-17F 基因編碼的氨基酸出現(xiàn)替換改變，從而影響其蛋白質(zhì)功能。

本研究未發(fā)現(xiàn)IL-17F 基因的rs763780 位點(diǎn)多態(tài)性與KD 存在關(guān)聯(lián)性，并且亦未發(fā)現(xiàn)其與KD 合并的CAI相關(guān)聯(lián)。但基于KD的遺傳復(fù)雜性，僅使用單基因位點(diǎn)分析和解釋KD 的發(fā)病具有一定的局限性，在未來(lái)的研究中或可進(jìn)行多中心大樣本臨床研究來(lái)進(jìn)一步分析，以期更好地對(duì)KD 人群發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后狀態(tài)進(jìn)行更好的判斷。