黃麗莉 夏可輝 唐 榮 鄭林媚 （海口市婦幼保健院產(chǎn)科，海口570203）

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有疾病，全球發(fā)病率為5%~7%，每年導致全世界7 萬多例孕產(chǎn)婦和50萬例胎兒死亡［1］。重度PE作為PE嚴重階段，伴有至少1種嚴重并發(fā)癥，嚴重威脅孕婦和胎兒健康，是產(chǎn)科ICU中38%孕產(chǎn)婦死亡原因，但其病因和發(fā)病機制尚未闡明［2］。目前免疫調(diào)節(jié)和遺傳易感性機制在國內(nèi)外備受關(guān)注，認為PE是一種母胎間免疫失衡疾病，攜帶父源性基因的胎兒視為同種半異體移植物被母體排斥，從而導致疾病發(fā)生［3］。

主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）基因是人類基因組中最具多態(tài)性的位點，在各類人群和民族中均有廣泛研究。人類MHC 又稱為人類白細胞抗原（human leucocyte anti‐gen，HLA），其編碼分子表達于白細胞，主要功能是誘導免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及選擇適當T細胞庫。過去幾十年人群研究已確定HLA 與多種人類疾病相關(guān)，在攜帶特定HLA 等位基因（包括炎癥、自身免疫性疾病和惡性腫瘤）個體中更為常見。因此，HLA基因和蛋白研究已成為人類學、移植和疾病相關(guān)性研究重要工具，HLA-疾病關(guān)聯(lián)的潛在機制是目前研究熱點。

HLA-G 作為非經(jīng)典HLAⅠb 類分子，由絨毛外滋養(yǎng)細胞特異性表達，促進滋養(yǎng)細胞侵襲，抑制蛻膜NK細胞功能，維持母胎間免疫平衡［4］。已有報道提示 HLA-G 基因多態(tài)性與 PE 發(fā)病相關(guān)［5］。最近研究表明，HLA-G 基因外顯子8 3'-UTR 14 bp 缺失/插入多態(tài)性影響HLA-G 轉(zhuǎn)錄并導致HLA-G 蛋白表達異常或下降，增加PE 發(fā)病風險［6］。母體和胎兒遺傳因素均影響PE 發(fā)病率，且一半胎兒基因來自父親，因此父源性基因在PE 發(fā)病中起重要作用［7］。張展等［8］研究顯示，父源性HLA基因14 bp缺失多態(tài)性可能與早發(fā)型重度PE 發(fā)病相關(guān)。目前國內(nèi)外不同民族PE 間父兒HLA-G 14 bp 多態(tài)性比較研究尚未見報道。

本研究通過檢測海南地區(qū)漢、黎族重度PE患者父、兒HLA-G 基因14 bp 多態(tài)性，并聯(lián)合父、兒基因型配伍分析，探討在海南地區(qū)HLA-G 基因14 bp 插入/缺失多態(tài)性是否為漢、黎族的PE 易患基因，進一步從免疫遺傳學角度探討漢、黎民族PE發(fā)病的遺傳學特征，以及是否存在種族差異。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選擇2017年1月至2019年10月我院和海南省人民醫(yī)院分娩的產(chǎn)婦，選取正常妊娠者漢族父、兒100 對，黎族父、兒80 對為對照組。同期確診為重度PE 的患者漢族父、兒84 對，黎族父、兒74對為病例組。重度PE診斷標準參照第8版《婦產(chǎn)科學》［9］。分別無菌抽取父親外周血和臍靜脈血各2 ml置于EDTA抗凝管，-20℃凍存待檢。所有研究對象（漢、黎族患者）要求三代居住海南地區(qū)，無異族通婚史、無血緣關(guān)系及PE 家族史。4 組均為自然受孕、單胎妊娠、剖宮產(chǎn)分娩、初產(chǎn)婦，并排除其他產(chǎn)科并發(fā)癥及內(nèi)外科并發(fā)癥，所有患者均隨訪至產(chǎn)后12周。所有參與者知情同意。

1.1.2 主要試劑與儀器 DNA 提取試劑盒、100 bp DNA Ladder（北京天根公司）；紫外分光光度計（美國賽默飛世爾）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取及濃度和純度測定 取冰凍全血室溫解凍，采用DNA 提取試劑盒提取樣本DNA，紫外分光光度法測定DNA 濃度和純度。DNA濃度調(diào)整至100 ng/μl，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HLA-G 基因擴增和電泳 采用PCR 對HLA-G 基因進行擴增，引物參照文獻［10］，引物序列 ：F：5'-GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC-3'；R：5'-GGAAGGAATGCAGTTCAGCTGA-3'，由 上 海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 總反應(yīng)體積為 25 μl：12.5 μl Taq PCR Master Mix（2×），2 μl HLA-G 引 物（5 μmo/lL）、1 μl DNA、9.5 μl dH2O。PCR 擴增條件：94℃ 預變性5 min，94℃ 30 s，64℃ 1 min，72℃ 2 min，共 35 個循環(huán)，72℃ 終末延伸10 min。取5 μl PCR 產(chǎn)物進行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（100 V，45 min），溴化乙錠染色20 min，Gel logic 2000圖像系統(tǒng)拍照。

1.2.3 HLA-G 14 bp 缺失插入多態(tài)性分型 PCR產(chǎn)物包括14 bp 插入/缺失雜合子（+14 bp/-14 bp）、14 bp 缺失純合子（-14 bp/-14 bp）、14 bp 插入純合子（+14 bp/+14 bp），采用 100 bp DNA Ladder 作為DNA Marker。選取缺失純合子和插入純合子PCR原液，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化并測序，采用GenBank Blast比較測序結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用卡方檢驗測定各組HLA-G 基因型頻率及基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡，4 組（漢族正常妊娠組、漢族重度PE 組、黎族正常妊娠組、黎族重度PE 組）父親和新生兒HLA-G 等位基因和基因型頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群體代表性。采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗比較病例組和對照組HLA-G 等位基因和基因型頻率。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 漢、黎族父代和子代第8 外顯子14 bp 多態(tài)性等位基因頻率、基因型頻率比較 漢族父代正常對照組與黎族父代正常對照組、漢族子代正常對照組與黎族子代正常對照組HLA-G 14 bp 等位基因和基因型頻率差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表1、2）。

表1 父代漢、黎族正常妊娠組HLA-G 14 bp等位基因及基因型頻率（%）Tab.1 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fathers of Han and Li in control group（%）

2.2 父代HLA-G 基因第8 外顯子14 bp 多態(tài)性等位基因頻率、基因型頻率比較 漢族父代重度PE組等位基因+14 bp 頻率為52.4%（88/168），-14 bp為47.6%（80/168），正常妊娠組分別為49%（98/200）、51%（102/200），差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.418，P=0.518）；兩組間基因型頻率差異也均無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表3）。黎族重度PE 組和正常妊娠組父親HLA-G 14 bp 缺失等位基因分布雖無顯著差異，但有差異性趨勢（P=0.060），兩組父親基因型分布無統(tǒng)計學差異（表4）。

表3 漢族父代正常妊娠組和重度PE組HLA-G 14 bp等位基因及基因型頻率（%）Tab.3 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fathers Han in control group and severe PE group（%）

表4 黎族父代正常妊娠組和重度PE組HLA-G 14 bp等位基因及基因型頻率（%）Tab.4 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fathers Li in control group and severe PE group（%）

2.3 子代HLA-G 基因第8 外顯子14 bp 多態(tài)性等位基因與基因型頻率比較 漢族子代重度PE 組等位基因+14 bp 頻率為51.2%（86/168），-14 bp 為48.8%（82/168），正常妊娠組分別為46%（92/200）、54%（108/200），差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.985，P=0.321）；兩組間基因型頻率差異也無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表5）。黎族重度PE 組新生兒HLA-G-14 bp 頻率為37.8%，明顯低于正常妊娠組的 55%（χ2=9.096，P=0.003），且重度 PE 組新生兒-14 bp/-14 bp 基因型頻率為18.9%，顯著低于正常妊娠組的43.8%（χ2=10.926，P=0.001，表6）。

表2 子代漢、黎族正常妊娠組HLA-G 14 bp等位基因及基因型頻率（%）Tab.2 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fetuses of Han and Li in control group（%）

表5 漢族子代正常妊娠組和重度PE組HLA-G 14 bp等位基因及基因型頻率（%）Tab.5 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14bp of fetuses of Han in control group and severe PE group（%）

表6 黎族子代正常妊娠組和重度PE組HLA-G 14 bp等位基因及基因型頻率（%）Tab.6 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fetuses of Li in control group and severe PE group（%）

2.4 漢族和黎族父、子HLA-G第8外顯子14 bp多態(tài)性基因型配伍頻率比較 漢族重度PE組父、子均為缺失純合子（-14 bp/-14 bp）的基因型配伍頻率，與正常妊娠組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表7）。黎族重度PE組父、子均為缺失純合子（-14 bp/-14 bp）的基因型配伍，頻率為21.1%（4/19），顯著低于正常妊娠組的65.5%（19/29），兩組差異有統(tǒng)計學意義（P=0.003）。漢族和黎族其他基因型配伍頻率在正常妊娠組和重度PE組間均無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表8）。

表7 漢族正常妊娠組和重度PE 組父、兒HLA-G 基因型配伍頻率［例（%）］Tab.7 HLA-G genotypes frequencies of HLA-G of fa?thers and fetuses of Han in control group and se?vere PE group［n（%）］

表8 黎族正常妊娠組和重度PE 組父、兒HLA-G 基因型配伍頻率［例（%）］Tab.8 HLA-G genotypes frequencies of HLA-G of fa?thers and fetuses of Li in control group and severe PE［n（%）］

3 討論

妊娠是一種成功的同種半異體移植過程，胎兒雖攜帶一半與母體基因無關(guān)的父源性基因，卻不被母體排斥，母胎免疫耐受是天然同種異體免疫耐受現(xiàn)象［11］。HLA-G 屬于介導母胎間免疫抑制的非經(jīng)典HLA-Ⅰ類分子，參與抑制子宮和外周血NK 細胞和CD8+T 細胞毒活性，CD4+T 細胞的同種異體增生反應(yīng)抑制樹突狀細胞成熟和激活調(diào)節(jié)性T細胞。除免疫抑制活性外，HLA-G 還參與絨毛外滋養(yǎng)細胞浸入母體子宮蛻膜過程，確保胎盤正常發(fā)育。

研究發(fā)現(xiàn)，PE 患者HLA-G 表達異常下降，推測HLA-G 與其發(fā)病相關(guān)［12］。進一步研究表明，含有14 bp DNA 序列的HLA-G 等位基因與胎盤HLA-G mRNA 低表達有關(guān)，且這一多態(tài)性與PE 發(fā)生有關(guān)［13］。研究尚未證實母親 HLA-G 14 bp 多態(tài)性與PE 相關(guān)，因此，分析 HLA-G 基因 14 bp 多態(tài)性與 PE是否相關(guān)，僅從母親角度出發(fā)可能存在一定局限性。一組瑞典孕婦分析表明，13%病例中，父親遺傳因素增加PE的患病風險，可能與母親遺傳因素相互作用有關(guān)［14］。李紅等［15］認為不同母/兒 HLA-G 14 bp 多態(tài)性基因型配伍影響母體對同種異體胎兒的接受程度，且胎兒HLA-G-14 bp 與早發(fā)型重度PE風險降低有關(guān)。

流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，初次妊娠、工具避孕或人工授精后妊娠者發(fā)生PE 的風險增加［16］。OLAYEMI 等［17］觀察到孕前性生活時間短也增加PE發(fā)生風險，反之延長母體對精子的暴露時間和頻率可明顯降低PE發(fā)病率，以上現(xiàn)象原因可能為母體未能適應(yīng)胎兒所攜帶的父方抗原所致，推測父本遺傳物質(zhì)在子癇前期發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究表明，父親HLA+14 bp/-14 bp 可增加PE 風險。沈彥婷等［18］通過對母親、父親及胎兒 HLA-G14 bp 多態(tài)性與PE 的關(guān)系進行研究，發(fā)現(xiàn)父（+14 bp/+14 bp）/兒（+14 bp/+14 bp）是子癇前期的危險因素。國外學者HYLENIUS等［19］研究發(fā)現(xiàn)，重度PE初產(chǎn)婦的胎兒優(yōu)先遺傳父親HLA-G+14 bp 等位基因，與PE 易感性相關(guān)。但也有研究比較正常妊娠組和PE 組新生兒HLA-G 14 bp 多態(tài)性等位基因和基因型頻率，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學意義［20］。分析結(jié)果不一致的原因可能是各項研究存在種族差異，對照組和病例組入選標準參差不齊以及PE 嚴重程度不一，導致HLA-G 14 bp多態(tài)性研究難以比較。

本研究通過測定海南地區(qū)漢、黎族人群父、子HLA-G14 bp 基因型、等位基因，并對父、子HLA-G 14 bp 基因型進行配伍分析，進一步闡述其與重度PE的相關(guān)性，以及是否存在種族差異，結(jié)果顯示，漢族正常妊娠組及黎族正常妊娠組父代和子代HLA-G 14 bp的等位基因與基因型頻率差異無統(tǒng)計學意義，表明HLA-G 14 bp 多態(tài)性在正常情況下不存在種族差異。進一步研究不同種族間HLA-G 14 bp 多態(tài)性在疾病狀態(tài)下是否存在差異，研究表明，漢族組父、子代HLA-G 14 bp 插入/缺失的等位基因及基因型分布在重度PE 組和正常妊娠組無統(tǒng)計學差異（P>0.05），聯(lián)合父/兒基因型配伍后未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學意義，提示漢族中該位點對PE發(fā)病意義較小。黎族重度 PE 組父親 HLA-G 14 bp 頻率和-14 bp/-14 bp 基因型頻率分別為40.5%、25.7%，與正常對照組（51.2%、32.3%）差異無統(tǒng)計學意義，但均有低于對照組的趨勢（P=0.060，P=0.157）。而黎族重度PE組新生兒HLA-G-14 bp 頻率和-14 bp/-14 bp 基因型頻率顯著低于黎族正常對照組。聯(lián)合父/兒基因型配伍發(fā)現(xiàn)，重度 PE 組父（-14 bp/-14 bp）/兒（-14 bp/-14 bp）基因型配伍頻率顯著低于正常對照組（P=0.003），提示父兒均為缺失純合子可降低母親患重度PE風險。

綜上所述，HLA-G 14 bp 多態(tài)性的類型、發(fā)生頻率及父兒基因型配伍頻率等在不同地域人群中呈種群差異性分布。漢族HLA-G基因14 bp 缺失多態(tài)性與重度PE 無相關(guān)性。黎族父兒均為缺失純合子可降低母親患重度PE的風險，推測黎族父（-14 bp/-14 bp）/兒（-14 bp/-14 bp）基因型可能與重度PE易感性相關(guān)。