謝 陽 劉夢(mèng)蘭 羅思維 孟仁亮 呂志宇 （西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，瀘州646000）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）白質(zhì)的慢性炎性脫髓鞘為主要病變特點(diǎn)的疾病，MS的發(fā)病率在20~40 歲時(shí)最高，是致殘中青年人的主要疾病之一［1］。MS 患者臨床的癥狀多樣，除較為常見的運(yùn)動(dòng)障礙、視覺異常及自主神經(jīng)功能障礙以外，認(rèn)知功能障礙也是常見的癥狀之一［2］。對(duì)MS 的臨床樣本和社區(qū)研究中發(fā)現(xiàn)，約60%的患者存在不同程度的認(rèn)知功能障礙，表現(xiàn)為瞬時(shí)記憶及長(zhǎng)期記憶力的下降，執(zhí)行能力、視覺空間能力、注意力和處理信息速度等認(rèn)知能力的下降［3］。而臨床MS 患者仍以輕度認(rèn)知障礙（cognitive impairment，CI）較為常見。而miRNA 作為真核生物的一類內(nèi)源性非編碼RNA，能夠?qū)RNA 的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，并且研究發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化增殖及凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與一系列生命進(jìn)程，并在多種自身免疫性疾病的進(jìn)展中發(fā)現(xiàn)其可以對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，作為自身免疫性疾病之一的MS，也被證實(shí)存在異常的 miRNA 表達(dá)，其中 miR-146a 及 miR-132 被發(fā)現(xiàn)在 MS 高峰期時(shí)異常表達(dá)［4-5］，同時(shí) miRNA 被證實(shí)在不同疾病引起的認(rèn)知功能障礙中起關(guān)鍵調(diào)控作用，然而在RRMS 中導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的作用尚不清楚。本研究通過對(duì)RRMS 患者血清miR-132 及miR-146a 的水平測(cè)定，分析其與認(rèn)知功能障礙MMSE 評(píng)分的相關(guān)性和獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析，探究RRMS患者認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重程度與miR-132、miR-146a的關(guān)系，為臨床的診治提供理論證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 本研究通過西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象及家屬均簽署知情同意書。納入西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2018年6月至2020年5月期間收治的RRMS患者80 例，其中男 26 例，女 54 例，年齡 20~49 歲，平均（32.19±5.07）歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合MS 診斷與治療的中國(guó)專家共識(shí)［6］；②分型為復(fù)發(fā)緩解型，并正處于急性發(fā)作期；③完善頭顱及脊髓MRI 檢查；④患者均知情同意并簽署知情同意書；⑤意識(shí)清楚，能配合完成研究者；排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重的心肝腎等器質(zhì)性疾?。虎诤喜⒂袗盒阅[瘤、嚴(yán)重感染及意識(shí)障礙不能配合研究者；③本次患病以前已經(jīng)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙者；④其他可能引起認(rèn)知功能障礙或意識(shí)障礙的神經(jīng)系統(tǒng)疾?。虎莺喜⑵渌陨砻庖咝约膊≌?；⑥有長(zhǎng)期精神活性藥物依賴或大量飲酒史。

1.1.2 主要試劑與儀器 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TIANGEN，中國(guó)）；miRNA 熒光檢測(cè)試劑盒（QIA‐GEN，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 分組及認(rèn)知功能測(cè)定 所有納入的患者在入院首日采用簡(jiǎn)明精神狀態(tài)量表（mini-mental state examination，MMSE）對(duì)認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)估。其中MMSE 最高為30分，最低為0分，分值越低代表認(rèn)知功能障礙越嚴(yán)重。按國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)：以26 分為界限，21~26 分者為輕度 CI，10~20 分者為中度 CI；<10 分者為重度CI。依據(jù)MMSE 量表結(jié)果將所有納入的RRMS患者分為2組，分別為有認(rèn)知障礙的RRMS患者，即CI 組，和未發(fā)生認(rèn)知障礙的RRMS 患者，即無CI 組。其中 CI 組共 39 例，男 12 例，女 27 例，年齡21~48歲，平均（30.28±5.24）歲，文盲4例，小學(xué)10例，中學(xué)及以上學(xué)歷25 例。而CI 組又根據(jù)MMSE 評(píng)分結(jié)果分為輕度 CI 組 20 例，中度 CI 組 13 例，重度 CI組 6 例。而無 CI 組共 41 例，男 14 例，女 27 例，年齡22~49 歲，平均（31.27±4.88）歲，文盲 5 例，小學(xué)11 例，中學(xué)及以上學(xué)歷25 例。兩組在年齡、性別及文化程度方面相互匹配，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2.2 純化miRNA 和總RNA 提取 所有受檢者在清晨抽取3 ml 靜脈血，室溫自然凝固15 min，4 000/rmin 快速離心5 min，取上層血清置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。TRIpure 試劑提取總mi-RNA。將提取的 miRNA 置于 30 μl DEPC 水中，56℃水浴15 min 加速RNA 溶解。提純后的miRNA使用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成第1 鏈cDNA 合成，并使用miRNA 熒光檢測(cè)試劑盒，采用SYBR Green嵌合熒光法的原理完成miRNA 熒光定量檢測(cè)。以上操作過程均按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μl，引物設(shè)計(jì)使用Primer 5.0 軟件完成，具體引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence

定量PCR 的反應(yīng)條件為：95℃處理5 min，95℃變性10 s，再經(jīng)退火和延伸60℃36 s，重復(fù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。所有的數(shù)據(jù)使用ABI 7300 SDSvl. 2x System該軟件處理，依靠軟件的自動(dòng)分析功能獲取相應(yīng)Ct值，采用2-ΔΔCt計(jì)算出目的基因相對(duì)含量，單樣品進(jìn)行3次測(cè)定后軟件分析獲取出相應(yīng)Ct平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用表示，兩獨(dú)立樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)間的比較采用ANOVA 單因素的方差分析，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)，采用Pearson 檢驗(yàn)對(duì)變量間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析，多因素分析采用二元回歸Logistic 回歸分析，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料對(duì)比 RRMS患者CI組在性別、年齡、病程長(zhǎng)短、發(fā)作次數(shù)、吸煙、飲酒和高血壓、冠心病、糖尿病等合并癥方面與無CI組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表2）。

表2 各組一般資料比較Tab.2 Comparison of general data in each group

2.2 各組miR-132、miR-146a 的相對(duì)表達(dá)量的比較 RRMS 患者CI 組的不同程度CI 亞組外周血清中miR-132 及miR-146a 的表達(dá)水平均明顯高于無CI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CI組中各亞組比較，重度CI 組患者外周血清的miR-132、miR-146a 水平較輕度CI 組和中度CI 組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表3）。

表3 各組外周血清miR-146a、miR-132相對(duì)表達(dá)量Tab.3 Relative expression levels of miR-146a and miR-132 in peripheral blood of each group

2.3 CI 組外周血 miR-132 及 miR-146a 相對(duì)表達(dá)量與MMSE 評(píng)分相關(guān)性分析 CI 組外周血miR-146a和miR-132 水平與MMSE 評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)（r2=0.907 6，P<0.01，r2=0.916 7，P<0.01）。見圖1。

圖1 CI 組 MMSE 評(píng)分與 miR-146a、miR-132 相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性Fig.1 Correlation between MMSE score and relative ex?pression levels of miR-146a and miR-132 in CI group

2.4 Logistic 回歸分析 將RRMS 患者是否合并CI作為因變量，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)miR-146a、miR-132 的相對(duì)表達(dá)量作為自變量進(jìn)行Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，miR-146a、miR-132 為 RRMS 患者合并 CI 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表4。

表4 CI的Logistic回歸分析Tab.4 Logistic regression analysis of CI

3 討論

MS 作為一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘脫失為主要特點(diǎn)的炎性自身免疫性疾病，研究普遍認(rèn)為其屬于自身免疫性疾病，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，MS 伴有認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率高達(dá)65%，CI 通常影響多個(gè)不同的認(rèn)知領(lǐng)域，在臨床上表現(xiàn)出不同形式，比如信息的處理能力、近遠(yuǎn)時(shí)記憶力、執(zhí)行力和注意力等［7］。部分研究者發(fā)現(xiàn)RRMS 患者N-乙酰門冬氨酸和谷氨酸-谷氨酰胺的神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常是引起CI 的原因，也有研究發(fā)現(xiàn)MS 患者的認(rèn)知功能障礙與軸索廣泛損害及神經(jīng)元的變性相關(guān)［8-9］。雖然近年對(duì)MS伴發(fā)的CI研究逐漸深入，但目前就其造成認(rèn)知功能障礙的相關(guān)機(jī)制仍不明確。而miRNAs 是一類內(nèi)源性的有調(diào)控功能的非編碼RNA，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的miRNAs 有潛在的免疫誘導(dǎo)作用［10］。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在神經(jīng)元分化、軸突形成、突觸的可塑性過程及大腦的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并與大腦的記憶學(xué)習(xí)能力和認(rèn)知功能緊密相關(guān)，在一些以記憶損害和進(jìn)行性認(rèn)知障礙為臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病中起關(guān)鍵作用［11-12］。

miR-146a 作為miR-146 家族一員，是一種對(duì)TLR及細(xì)胞因子的受體信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控的內(nèi)源性相關(guān)調(diào)節(jié)因子，能夠通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)多種炎癥信號(hào)通路而參與多種疾病發(fā)生發(fā)展［13］。同時(shí)研究證實(shí)，miR-146a 在阿爾茨海默?。ˋD）等神經(jīng)退行性疾病患者腦部表達(dá)水平上調(diào)，且在患者外周血中發(fā)現(xiàn)miR-146a 的AA 型等位基因相對(duì)表達(dá)量的上調(diào)可增加AD 患者認(rèn)知功能障礙的罹患率［14］。而作為大腦中主要功能物種的miR-132，其受到腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子相應(yīng)的刺激后開始上調(diào)，引起樹突軸突的成長(zhǎng)及突觸的可塑性，從而在MS 及其他多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［15-16］。miR-132 對(duì)靶基因MecP2 的特異性負(fù)向調(diào)節(jié)，其過度表達(dá)會(huì)引起認(rèn)知功能障礙及精神癥狀的出現(xiàn)［17］。已有研究表明，miR-146a、miR-132 在 MS 患者外周血中高表達(dá)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)RRMS 患者CI 組的不同程度認(rèn)知障礙亞組外周血中miR-132及miR-146a表達(dá)水平均明顯高于無CI 組，而CI 組中各亞組進(jìn)行比較，重度CI 組患者外周血清的miR-132、miR-146a 水平較輕度CI組和中度CI 組均明顯升高，提示miR-146a、miR132參與了RRMS疾病進(jìn)展，與既往研究相一致，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)二者可能與RRMS 伴發(fā)的CI 嚴(yán)重程度有關(guān)，對(duì) CI 組外周血 miR-132 及 miR-146a 相對(duì)表達(dá)量與MMSE 評(píng)分相關(guān)性分析，及對(duì)RRMS 患者合并CI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，miR-132、miR-146a 與 MMSE 評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，且高表達(dá)的 miR-132 和 miR-146a 是 RRMS 患者 合并 CI 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示miR-132、miR-146a 的表達(dá)水平與RRMS 患者伴發(fā)的CI 有關(guān)，二者表達(dá)水平越高RRMS患者CI越重。

綜上所述，miR-146a、miR-132 參與了 RRMS 患者CI發(fā)生的過程，可能與其炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)和突觸可塑性等生理功能相關(guān)，推測(cè)miR-146a 及miR-132有作為MS 神經(jīng)行為生物學(xué)標(biāo)志物的可能，為MS 伴發(fā)認(rèn)知功能障礙的病患的診斷提供新的證據(jù)。