游紅琴 王小昆 徐本玲 李鐵鵬 秦 鵬 劉 雪 張夢雨 王 瑤 陳廣玉 高全立

（鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院，河南省腫瘤醫(yī)院，鄭州450008）

γδ T 細胞占外周血CD3+T 細胞的 5%~10%，可被磷酸抗原迅速活化，表達分化抗原簇（cluster of differentiation，CD）69 和 CD25，通過分泌顆粒酶、穿孔素及IFN-γ發(fā)揮抗腫瘤作用［1-2］。在體外經(jīng)磷酸小分子抗原擴增的γδ T 細胞被廣泛用于腫瘤患者的過繼治療［3］。唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素-15（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 15，Siglec-15）是唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素家族成員，最近的研究發(fā)現(xiàn)，Siglec-15 可通過抑制CD4+和CD8+T細胞的增殖及IFN-γ的分泌，直接抑制特異性T 細胞的抗腫瘤免疫應答［4］。但 Siglec-15 對抗原特異性γδ T 細胞的影響尚未見報道，本研究旨在明確Siglec-15 對γδ T 細胞活化、增殖和分泌效應分子的影響，以期為γδ T細胞的臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌血液標本為2019年12月至2020年4月河南省腫瘤醫(yī)院免疫治療科GMP實驗室的臨床檢測標本，其中男性6例，女性7例。唑來膦酸（zole‐dronic acid，ZOL）購自揚子江藥業(yè)集團；IL-2 購自山東泉港藥業(yè)有限公司；淋巴細胞分離液購自美國GE公 司 ；流 式 抗 體 BV510-TCRγδ、FITC-CD3、PECD69、APC-CD3、APC-CD25、PE-顆粒酶 B 和 APCIFN-γ 及同型對照抗體購自美國Biolegend 公司；羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（carboxyfluoresce‐in diacetate succinimidyl ester，CFSE）購自美國Ther‐mo Fisher 公司；Fortessa 流式細胞分析儀和FlowJo V10流式分析軟件購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 γδ T 細胞的體外培養(yǎng) 空腹抽取外周靜脈血 3 ml 于 EDTA 采血管，離心 10 min（2 000/r min，離心半徑10 cm），取離心后的自體血漿備用。全血細胞經(jīng)生理鹽水1∶1稀釋后使用淋巴細胞分離液離心20 min（2 000/r min，離心半徑10 cm）吸取白膜層。用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，離心10 min（1 500/r min，離心半徑10 cm）去除血小板。再次以無血清培養(yǎng)基重懸細胞，離心8 min（1 200/r min，離心半徑10 cm）獲取外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。用含3%自體血漿的 X-VIVO 培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為 1×106個/ml，分別添加 ZOL（濃度為 1 μmo/l L）和 IL-2（濃度為400 U/ml），將細胞懸液移入48孔板（1 m/l 孔），根據(jù)實驗目的，在培養(yǎng)體系中加或不加Siglec-15（5 μg/ml）重組蛋白。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間根據(jù)細胞生長情況進行補液和傳代。

1.2.2 γδ T 細胞活化相關分子的流式檢測 分別取培養(yǎng)前及培養(yǎng)第2 和4 天的γδ T 細胞懸液，離心5 min（1 500/r min，離心半徑10 cm）后，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）重懸，調(diào)整細胞濃度為1×107個/ml，每管200 μl，分別加入FITCCD3、BV510-TCRγδ、PE-CD69 和 APC-CD25 抗體各2 μl，混勻，4℃ 避光孵育 20 min，孵育畢，使用 PBS洗滌1 次，重懸于500 μl PBS 中，進行活化相關分子表達水平的檢測。

1.2.3 CFSE 法檢測γδ T 細胞的增殖 將培養(yǎng)至第10 天的γδ T 細胞（比例≥90%）靜息培養(yǎng)（無IL-2培養(yǎng)）48 h。收集細胞，PBS 洗滌 2 次，用5 μmo/l L的CFSE 工作液重懸細胞，于室溫避光孵育20 min，用5倍體積的冷完全培養(yǎng)基終止染色10 min，離心洗滌2次后，以適量的完全培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞懸液移入48孔板（1 m/l 孔），分別添加ZOL（1 μmo/l L）和IL-2（400 U/ml），根據(jù)實驗目的，在培養(yǎng)體系中加或不加Siglec-15（5 μg/ml）。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)終點收集細胞，以APCCD3 和BV510-TCRγδ 抗體進行表面流式染色，將細胞重懸于 500 μl PBS 中進行 γδ T 細胞增殖的流式檢測。

1.2.4 胞內(nèi)流式分析γδ T 細胞分泌的效應分子 收集靜息培養(yǎng)48 h的γδ T細胞，PBS洗滌后，將細胞懸液移入 48 孔板（1 m/l 孔），分別添加 ZOL（1 μmo/l L）和IL-2（400 U/ml），根據(jù)實驗目的，在培養(yǎng)體系中加或不加Siglec-15（5 μg/ml）。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后，加入布雷菲德菌素A（brefeldin，BFA）阻斷，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。收集上述不同培養(yǎng)條件的細胞，PBS 洗滌1 次，按照流式表面染色方法進行FITC-CD3，BV510-TCRγδ 的表面染色。PBS 洗滌1 次，固定細胞，室溫避光孵育30 min。加入破膜液洗滌2 次，以破膜液重懸細胞，加入PE-顆粒酶 B 抗體，APC-IFN-γ 及同型對照抗體，4℃ 避光孵育30 min。破膜液洗滌2 次后，將細胞重懸于500 μl PBS中上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)為計量資料，服從正態(tài)分布，組間比較采用單因素t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Siglec-15 蛋白對 ZOL 誘導 γδ T 細胞活化的影響不顯著 以ZOL 聯(lián)合或不聯(lián)合重組Siglec-15 蛋白刺激PBMC，在刺激48 h 和96 h 后分別檢測表達活化相關分子 CD69 和 CD25 的 γδ T 細胞比例（圖1A）。結(jié)果表明：ZOL 刺激 48 h 后，CD69+γδ T 細胞的比例由刺激前的（0.159±0.086）%上調(diào)至（85.48±6.605）%，刺激96 h 后，CD69+γδ T 細胞比例上調(diào)至（95.33±1.424）%，CD25+γδ T細胞的比例由（0.005±0.004）%升高至48 h 的（50.94±18.678）%和96 h 的（87.53±2.612）%，差異有統(tǒng)計學意義（圖1B~E），提示 ZOL 可刺激 PBMC 中的 γδ T 細胞活化；聯(lián)合 Si‐glec-15 刺激 48 h，CD69+和 CD25+γδ T 細胞比例分別為（88.64±5.034）%和（62.56±14.951）%，與ZOL 單獨刺激的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.421，P=0.350）；刺激 96 h 的 CD69+和 CD25+γδ T 細胞比例分別為（95.80±1.250）%和（87.60±4.329）%，與ZOL單獨刺激差異無統(tǒng)計學意義（P=0.990，P=0.815）（圖1C、E），提示 Siglec-15 對 ZOL 誘導的 γδ T 細胞活化無顯著影響。

圖1 CD69和CD25在γδ T細胞的表達Fig.1 Expression of CD69 and CD25 in γδ T cells

2.2 Siglec-15 不影響 ZOL 特異性 γδ T 細胞的增殖 收集純度在90%以上的γδ T 細胞進行CFSE 標記，并以 ZOL 聯(lián)合或不聯(lián)合 Siglec-15 刺激 γδ T 細胞，在刺激 72 h 后檢測 γδ T 細胞的分裂 CFSE 標記（圖 2A）。ZOL 刺激后，增殖的 γδ T 細胞比例為（98.67±0.64）%；聯(lián)合 Siglec-15 刺激，增殖的 γδ T細胞比例為（98.2±0.38）%，兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.426，圖2B）。上述結(jié)果表明Siglec-15 不影響ZOL特異性γδ T細胞的增殖。

圖2 γδ T細胞的增殖Fig.2 Proliferation of γδ T cells

2.3 Siglec-15 降低 ZOL 特異性 γδ T 細胞分泌效應分子IFN-γ 和顆粒酶B 的水平 以ZOL 聯(lián)合或不聯(lián)合Siglec-15 刺激γδ T 細胞（純度≥90%），胞內(nèi)流式分析 γδ T 細胞分泌 IFN-γ 和顆粒酶 B 的水平（圖3A）。結(jié)果顯示，ZOL 單獨刺激，使（11.98±1.98）%γδ T 細胞分泌IFN-γ；聯(lián)合 Siglec-15 蛋白刺激，分泌IFN-γ 的 γδ T 細胞比例顯著降低為（7.29±1.17）%（P=0.006，圖3B）。在ZOL 單獨刺激組，有（89.35±2.85）% γδ T 細胞分泌顆粒酶B，聯(lián)合Siglec-15刺激使分泌顆粒酶B 的γδ T 細胞比例降低為（81.53±5.31）%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.041，圖3C）。上述結(jié)果表明Siglec-15 可通過抑制IFN-γ 和顆粒酶B的分泌負向調(diào)控ZOL特異性γδ T細胞發(fā)揮效應。

圖3 γδ T細胞分泌IFN-γ和顆粒酶BFig.3 IFN-γ and granzyme B secretion of γδ T cells

3 討論

腫瘤免疫治療的模式已經(jīng)由激活全身性免疫應答，轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄟ^選擇性糾正有缺陷的免疫應答促使免疫正?；?。例如針對程序性死亡受體-1（pro‐grammed cell death protein 1，PD-1）和細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T lymphocyte associated protein，CTLA-4）的單克隆抗體，就是通過阻斷PD-1和CTLA-4 恢復腫瘤特異性T 細胞的抗腫瘤效應［5］。雖然免疫檢查點抑制劑療法在臨床取得了顯著療效，但目前單用PD-1 和CTLA-4 阻斷劑治療的有效率只有30%左右，提示除了PD-1 和CTLA-4，腫瘤微環(huán)境中還存在未知的能夠誘導腫瘤細胞逃逸的免疫檢查點分子［6］。據(jù)報道，Siglec-15 在多種腫瘤細胞中的表達上調(diào)，但其對T 細胞抗腫瘤免疫應答的影響尚不明確［7］。陳列平團隊的研究發(fā)現(xiàn)，Siglec-15 可通過持續(xù)抑制T 細胞增殖及IFN-γ 分泌進而抑制抗原特異性T 細胞對腫瘤細胞的細胞毒活性，并通過小鼠腫瘤模型進一步證明了Siglec-15 可作為腫瘤免疫治療正常化策略的潛在靶點［4］。

γδ T 細胞是人體發(fā)揮抗腫瘤免疫功能的重要細胞，其T 細胞受體（T cell receptor，TCR）由γ 鏈和δ 鏈組成［8］。γδ T 細胞與經(jīng)典的 αβ T 細胞在活化、增殖及發(fā)揮效應方面有諸多相似之處。兩種細胞在受到TCR 識別的抗原刺激時，均需要通過CD3 分子傳遞活化信號，表達活化標記分子CD69 和CD25［9-10］。兩種 T 細胞在活化后迅速增殖，數(shù)量成倍增加。在效應階段，γδ T 細胞的效應機制與αβ T細胞類似，通過釋放穿孔素、顆粒酶誘導靶細胞死亡；表達Fas配體，通過Fas/FasL 途徑誘導靶細胞凋亡；分泌IFN-γ 等細胞因子，促進腫瘤特異性T 細胞對腫瘤細胞的細胞毒活性［11-12］。基于上述γδ T細胞與αβ T 細胞的相似之處，本研究集中在Siglec-15對ZOL 特異性γδ T 細胞活化、增殖及發(fā)揮效應的影響。

ZOL 是含氮雙磷酸鹽，可抑制哺乳動物甲羥戊酸代謝通路中異戊烯焦磷酸（isopentenyldiphos‐phate，IPP）下游的法呢基焦磷酸合酶促使IPP 在細胞內(nèi)累積，累積的IPP通過TCRγδ激活γδ T細胞［13］。本研究以ZOL 刺激外周血中的γδ T 細胞，無論Siglec-15是否存在，γδ T細胞均可迅速活化與增殖。與文獻報道的Siglec-15 可持續(xù)抑制αβ T 細胞增殖的結(jié)果不同，本研究結(jié)果提示Siglec-15 不影響ZOL誘導的γδ T 細胞的活化與增殖，推測這可能與兩種細胞具備不同的抗原識別特點有關。αβ T 細胞識別抗原的過程受到精細的調(diào)控，除TCR 與抗原肽結(jié)合外，還需要CD80/CD86提供共刺激信號才能觸發(fā)αβ T 細胞的活化與增殖。為了維持免疫自穩(wěn)，活化的αβ T細胞同時上調(diào)免疫抑制分子的表達水平［14］；而γδ T 細胞的抗原識別對共刺激信號的依賴很小，不具有MHC限制性，表達免疫抑制性分子的數(shù)量較αβ T 細胞更少，表達水平更低［15］。在特異性T 細胞的抗腫瘤免疫應答中，Siglec-15 以類似PD-L1 的角色發(fā)揮抑制作用，但T 細胞表面表達的介導Siglec-15 發(fā)揮免疫抑制效應的受體尚不明確，其在T 細胞上的表達特點未知。本研究結(jié)果表明，Siglec-15 對γδ T 細胞的活化與增殖無顯著影響，提示在此階段，γδ T 細胞不表達或低水平表達Siglec-15 的受體。本研究的另一個發(fā)現(xiàn)：與Siglec-15抑制αβ T 細胞分泌 IFN-γ 相似，Siglec-15 可顯著降低 γδ T 細胞產(chǎn)生效應分子IFN-γ 和顆粒酶B 的水平，表明在效應階段γδ T 細胞表達了Siglec-15 受體或受體的表達水平上調(diào)。

綜上，在活化增殖階段，Siglec-15對ZOL特異性γδ T 細胞的抑制作用不顯著，但在效應階段可通過抑制IFN-γ 和顆粒酶B 的分泌負向調(diào)控ZOL 特異性γδ T 細胞發(fā)揮效應。這對探討γδ T 細胞在臨床治療腫瘤患者方面有一定的價值。