蔡根深 張 晶 王汝朋 （首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，北京100038）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以結(jié)直腸黏膜彌漫性炎癥為特征的慢性疾病，其典型臨床癥狀為血腥黏液便，并具有明顯的緩解期與加重期，病程較長，遷延不愈［1］。隨著近年來飲食結(jié)構(gòu)的改變和生活節(jié)奏的加快，我國UC 發(fā)病率正逐年上升。盡管UC 的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腸道免疫異常及腸黏膜屏障功能障礙在炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的發(fā)病過程中起著重要作用。異常黏膜免疫反應(yīng)導(dǎo)致炎癥因子及氧化應(yīng)激的失衡，而后者又進(jìn)一步加劇腸黏膜免疫功能的紊亂，進(jìn)而誘發(fā)腸上皮的慢性持續(xù)性損傷，最終導(dǎo)致UC的發(fā)生發(fā)展［2］。

MicroRNAs（miRNAs）是一類能夠在轉(zhuǎn)錄后參與調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼RNA［3］。近年來越來越多的數(shù)據(jù)表明miRNAs 與UC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。WU 等［4］通過 miRNAs 芯片等技術(shù)對比分析UC 患者與健康人群的結(jié)腸黏膜組織發(fā)現(xiàn)，miR-192 在UC 患者中的表達(dá)顯著降低。VALMIKI等［5］同樣發(fā)現(xiàn)在UC患者腸黏膜組織中包括miR-192在內(nèi)的多種miRNAs 的表達(dá)顯著下降，并推測這些異常表達(dá)的miRNAs 可能與結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。而國內(nèi)學(xué)者吳一峰等［6］最新研究發(fā)現(xiàn)miR-192在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著降低，且與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期相關(guān)。

Nrf2/HO-1 是機(jī)體重要的抗氧化信號通路，廣泛存在于機(jī)體的各個(gè)組織器官中。核因子E2（nu‐clear factor E2 related factor，Nrf2）是體內(nèi)抗氧化調(diào)節(jié)的重要蛋白，在細(xì)胞受到氧化刺激時(shí)，Nrf2迅速從位于胞漿的復(fù)合物中解離出來，活化后進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而激活下游基因如血紅素加氧酶（heme oxy‐genase 1，HO-1）的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)抗氧化劑的表達(dá)以增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，抑制活性氧及炎癥等有害物質(zhì)的釋放并最終發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞功能的作用［7］。最近有研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/HO-1 信號通路能夠通過影響巨噬細(xì)胞的活化，從而發(fā)揮抗炎或抑炎的作用［8］。而巨噬細(xì)胞作為腸黏膜免疫環(huán)境中含量豐富的細(xì)胞，在UC 的發(fā)展過程中具有重要地位［2］。最近在肺炎相關(guān)的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，miR-192 能夠通過影響巨噬細(xì)胞的功能成為肺炎治療新型靶點(diǎn)［9］。鑒于以上機(jī)制，本課題旨在探討miR-192在UC 中表達(dá)及其對疾病進(jìn)展的作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6~8周SPF級健康雄性C57BL/6小鼠40 只，體重19~23 g，購于北京維通利華生物公司，飼養(yǎng)于室溫22~28℃，濕度為55%的SPF 級清潔動(dòng)物房，自由攝食、水，12 h 晝夜周期。本實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行，并獲得本院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)審核通過。

1.1.2 細(xì)胞系及主要試劑 293T 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；葡聚糖硫酸鈉（DSS）（美國Biosharp 公司）；DMEM/HG（美國 Hyclone 公司）；胎牛血清 FBS（杭州四季青生物公司）；Trizol、Lipo‐fectamine2000、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（美國Invitrogen 公司）；逆轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa公司）；HE染色試劑盒（北京索萊寶公司）；SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒、HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（廣州晶彩生物公司）；丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成公司）；ECL 發(fā)光試劑盒（美國Thermo 公司）；GFP 標(biāo)記的過表達(dá)miR-192 慢病毒載體及慢病毒空載體（上海吉?jiǎng)P生物公司）；pmirGLO HO-1-WT、pmirGLO HO-1-MUT 的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、miR-192 mimic 及mimic-NC序列（上海吉瑪）；熒光酶檢測試劑盒（Pro‐mega 公司）；IL-1β、IL-6、TNF-α 酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物公司）；抗小鼠F4/80-APC、抗小鼠CD86-FITC、抗小鼠CD206-PE/Cy5.5（美國BD公司）；兔抗Lamin A、HO-1、Nrf2、β-actin 抗體（美國Bioworld 公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物（上海生工公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 40 只C57BL/6 小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，正常對照組（Control組）、DSS 誘導(dǎo)的UC 模型組（DSS 組）、過表達(dá)miR-192 慢病毒組（miR-192 組）、慢病毒對照組（Negative con‐trol組，即NC 組），每組10只。實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，于造模前24 h 禁食不禁水。參考相關(guān)文獻(xiàn)［10］制作UC 模型，簡述如下：實(shí)驗(yàn)前對小鼠禁食不禁水24 h后，使用4%的水合氯醛經(jīng)腹麻醉（0.1 ml/10 g），miR-192組及NC組小鼠分別經(jīng)肛門輕柔緩慢的注射50 μl（1×109TU/ml）對應(yīng)的慢病毒液進(jìn)入腸內(nèi)，注射部位距肛門約 6 cm 處，Control 組與 DSS 組小鼠注射等量的生理鹽水。注射完畢后將小鼠倒立放置，并注意保暖，直至小鼠蘇醒并正常進(jìn)食。除Control 組以外的各組小鼠2.5%的DSS 作為飲用水連續(xù)飼養(yǎng)7 d，Control組小鼠以普通飲用水作為對照。實(shí)驗(yàn)開始后每天記錄每只小鼠的體重、糞便性狀及便血情況，參考文獻(xiàn)［10-11］將小鼠的上述指標(biāo)的評分總和用以評估小鼠的炎癥活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI），其中體重變化評分為：0 分=無下降，1分=下降<5%，2分=下降5%~10%，3分=下降11%~15%，4 分=體重下降>15%；糞便性狀評分為：0 分=糞便正常，2 分=糞便松散，4 分=水樣稀便；便血情況評分為：0 分=無血便，2 分=輕度血便，4 分=大量出血。第8 天脫臼后處死各組小鼠，收集各組小鼠的新鮮結(jié)腸組織部分用于流式細(xì)胞術(shù)，其余部分保存于-80℃冰箱以備后續(xù)使用。

1.2.2 HE 染色觀察小鼠結(jié)腸組織病理變化 取各組小鼠結(jié)腸組織固定于4%多聚甲醛溶液中24 h后，進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，切片后應(yīng)用HE 試劑盒進(jìn)行染色，每只小鼠隨機(jī)選取3 張切片，光鏡下觀察其組織學(xué)變化。

1.2.3 ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)腸黏膜組織中炎癥因子表達(dá)水平 刮取各組小鼠結(jié)腸黏膜組織后進(jìn)行勻漿，按照 IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10 的 ELISA 試劑盒使用方法檢測各組小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10表達(dá)水平。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.4 結(jié)腸組織中SOD及MDA活性檢測 取各組小鼠適量結(jié)腸組織進(jìn)行勻漿，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀測定結(jié)腸組織中SOD及MDA水平。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.5 分離結(jié)腸固有層單核巨噬細(xì)胞（lamina pro‐pria mononuclear cells，LPMCs） 參考文獻(xiàn)［12］進(jìn)行分離各組小鼠LPMCs，簡述如下：將小鼠結(jié)腸組織置于含 5 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT 的 HBSS溶液中，37℃振蕩消化20 min，室溫下1 000 r/min離心5 min，取下層沉淀再次重復(fù)上述消化步驟以充分去除腸上皮細(xì)胞。100 μm 的濾網(wǎng)過濾上述組織液，取未過濾出的組織置于含0.05%膠原酶D、0.05% DNaseⅠ與 0.3%Diapase Ⅱ的 PBS 溶液中，37℃振蕩消化1 h。40 μm 的濾網(wǎng)過濾上述組織液，1 500/rmin離心10 min，取下層細(xì)胞重懸于4 ml PBS溶液中，并緩慢加入等體積的Ficoll 溶液表面上，并使其形成界面。20℃下2 400/rmin 離心20 min，下層細(xì)胞沉淀即為所需LPMCs。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測LPMCs 中巨噬細(xì)胞極化 取各組小鼠的LPMCs 進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，其中M1 型巨噬細(xì)胞使用 F4/80-APC 與 CD86-FITC 進(jìn)行標(biāo)記，M2 型巨噬細(xì)胞使用F4/80-APC 與CD206-PE/Cy5.5 進(jìn)行標(biāo)記。流式步驟簡述如下：用PBS 將細(xì)胞密度調(diào)整至 1×105個(gè)/ml，取 2 ml 至流式管中，800/rmin 離心 5 min，棄上清后加入 100 μl 的 PBS重懸細(xì)胞，依次加入F4/80-PE、CD16/32-PerCP/Cy5.5、CD206-Alexa 647，于 4℃ 避光孵育30 min 后加入 2 ml PBS 洗滌細(xì)胞，800/rmin 離心 10 min ，棄上清，再加入 0.2 ml PBS 重懸細(xì)胞，0.22 μm 濾膜過濾后上機(jī)進(jìn)行檢測分析。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 將293T細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后用含有10%FBS與1%青鏈霉素的DMEM/HG 培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合至80%時(shí)用0.25%的胰酶進(jìn)行消化傳代。應(yīng)用miRNA 靶基因在線預(yù)測網(wǎng)站TargetScan 對miR-192 作用的靶基因進(jìn)行預(yù)測，篩選HO-1 作為其可能的靶分子。將處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞常規(guī)消化后接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/孔，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染前3 h將DMEM/HG培養(yǎng)基更換為 Opti-MEM 培養(yǎng)基，根據(jù) Lipofectamine 2000 說明書將 pmirGLO HO-1-WT、pmirGLO HO-1-MUT 的熒光素酶基因報(bào)告質(zhì)粒及miR-192 mimic 及mimic-NC分別轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，并將細(xì)胞分為pmirGLO-HO-1-WT+miR-192 mimic、pmirGLO-HO-1-WT+mimic-NC、pmirGLO-HO-1-MUT+miR-192 mimic、pmirGLO-HO-1-MUT+mimic-NC，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后換為含10%FBS的DMEM/HG 常規(guī)培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h 后，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測HO-1 啟動(dòng)子的熒光強(qiáng)度。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR） 將小鼠結(jié)腸組織組織置于液氮中研磨為組織勻漿后按照Trizol法提取組織中總RNA，分光光度計(jì)檢測濃度與純度后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再按照RT-PCR試劑說明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的反應(yīng)時(shí)間與溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)定量，RT-PCR 反應(yīng)條件為：95℃（30 s）預(yù)變性后，變性95℃（7 s），退火60℃（30 s），72℃（15 s），40 個(gè)循環(huán)周期。RT-PCR 引物序列為：miR-192-F：5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3'，miR-192-R：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6-F：5'-GTGTTCCTACCCCCAATGTG-3'，U6-R：5'-CATCGAAGGTGGAAGAGTGG-3'。以 U6 為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt方法分析miR-192的表達(dá)水平。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.9 Western blot 檢測結(jié)腸相關(guān)蛋白表達(dá) 取適量結(jié)腸組織加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上研磨后離心提取總蛋白。BCA 法進(jìn)行蛋白定量，按照1∶4 向上清液中加入5×蛋白上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取50 μg 的蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳進(jìn)行蛋白分離，采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2 h 后，分別加入 Nrf2（1∶500）、HO-1（1∶1 000）、Lamin A（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）一抗，4℃ 搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育 1 h，以 TBST 溶液清洗 3 次，5 min/次。最后均勻滴加ECL 發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照。Image J 軟件測定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β-actin 的比值作為其相對含量。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0 和GraphPad Prism 5.0方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的Dunnett's 或Bonferroni's多重比較進(jìn)行分析；顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-192 在各組小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá) RTPCR 結(jié)果顯示，與 Control 組小鼠相比，DSS 組、NC組、miR-192組小鼠的結(jié)腸組織中miR-192均顯著下降，而與DSS 組相比，miR-192 組小鼠結(jié)腸組織中的miR-192 表達(dá)顯著升高，NC 組無顯著性差異。這表明DSS 能夠誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織中miR-192 表達(dá)下調(diào)，而在小鼠體內(nèi)注射過表達(dá)miR-192 慢病毒能明顯緩解miR-192下降的趨勢。見圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織中miR-192的表達(dá)情況Fig.1 Expression of miR-192 in colon tissue of each group of mice

2.2 過表達(dá)miR-192 對DSS 誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥影響 采用體重變化、DAI評分及結(jié)腸HE染色來評估小鼠腸道炎癥，結(jié)果顯示，從第4 天開始，DSS 組、NC 組、miR-192 組小鼠的體重較 Control 組顯著減輕（P<0.01），而在第 6、7 天時(shí) miR-192 組小鼠體重下降趨勢較DSS 與NC 組明顯緩解（P<0.05，圖 2A）；DAI 評分顯示，從第 2 天開始，DSS 組、NC 組、miR-192 組小鼠的DAI 評分較Control 組顯著升高，而在第 5、6、7 天時(shí) miR-192 組小鼠 DAI 分值較 DSS 與 NC組明顯降低（圖2B）。HE 染色結(jié)果顯示，Control 組小鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，腺體排列整齊，絨毛輪廓清晰；DSS 組、NC 組小鼠腸黏膜上皮明顯受損，腺體結(jié)構(gòu)紊亂或消失，黏膜下伴大量炎癥細(xì)胞浸潤，隱窩消失；miR-192 組小鼠結(jié)腸黏膜基本完整，部分上皮細(xì)胞脫落，腺體結(jié)構(gòu)排列欠規(guī)則，伴少量炎癥細(xì)胞浸潤，腸黏膜損傷程度較DSS組與NC組明顯減輕（圖2C）。

圖2 各組小鼠的體重、DAI變化及結(jié)腸病理改變Fig.2 Body weight，DAI changes and colon pathological changes of mice in each group

2.3 過表達(dá)miR-192 對DSS 誘導(dǎo)小鼠腸黏膜炎癥因子表達(dá)水平的影響 ELISA 結(jié)果顯示，與Control組小鼠相比，DSS 組、NC 組、miR-192 組小鼠的結(jié)腸組織中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10 表達(dá)均顯著增加；與DSS 組相比，miR-192 組小鼠結(jié)腸黏膜IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)均明顯減少，而IL-10表達(dá)卻顯著增加，NC組無顯著性差異。見圖3。

圖3 各組小鼠的結(jié)腸黏膜炎癥因子表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of colonic mucosa inflammatory factors in each group of mice

2.4 過表達(dá)miR-192對小鼠結(jié)腸組織MDA、SOD表達(dá)水平的影響 MDA、SOD 活性檢測結(jié)果顯示，與Control 組小鼠相比，DSS 組、NC 組、miR-192 組小鼠的結(jié)腸組織中MDA水平顯著升高，而SOD的活性明顯降低；與DSS 組相比，miR-192 組小鼠結(jié)腸組織中MDA 水平明顯降低，SOD 的活性顯著增加，NC 組無顯著性差異。見圖4。

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織MDA、SOD的表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of MDA and SOD in colon tissue of mice in each group

2.5 過表達(dá)miR-192 對腸道單核巨噬細(xì)胞極化的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與Control 組小鼠相比，DSS 組、NC 組、miR-192 組小鼠 LPMCs 中 M1 型巨噬細(xì)胞所占比例顯著增加，且DSS 組、NC 組小鼠LPMCs中M2型巨噬細(xì)胞明顯減少，而miR-192組小鼠LPMCs 中M2 型巨噬細(xì)胞無明顯變化；與DSS 組相比，miR-192組小鼠LPMCs中M1型巨噬細(xì)胞所占比例明顯減少，但M2型巨噬細(xì)胞卻顯著增加，NC組無顯著性差異。見圖5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠體內(nèi)過表達(dá)miR-192后對巨噬細(xì)胞極化的影響Fig.5 Flow cytometric detection of effect of overexpres?sion of miR-192 on polarization of macrophages in mice

2.6 miR-192 靶向抑制 HO-1 的表達(dá) miRNA 靶基因在線預(yù)測網(wǎng)站TargetScan 預(yù)測結(jié)果表明HO-1 基因的3'-UTR 存在能與miR-192 的結(jié)合位點(diǎn)，這提示HO-1 可能為miR-192 的目標(biāo)靶基因。利用雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染mim‐ic-NC+HO-1-WT 的293T 細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-192 mimic+HO-1-WT 的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低，而轉(zhuǎn)染mimic-NC+HO-1-MUT 及miR-192 mimic+HO-1-MUT 的細(xì)胞熒光素酶活性無顯著性差異，這證實(shí)HO-1 是miR-192 的目標(biāo)靶基因，且其表達(dá)能夠被miR-192所抑制。見圖6。

圖6 miR-192靶向調(diào)控HO-1表達(dá)Fig.6 miR-192 targets and regulates HO-1 expression

2.7 過表達(dá) miR-192 對 LPMCs 中 Nrf-2/HO-1 信號通路表達(dá)的影響 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control 組小鼠相比，DSS 組、miR-192 組、NC 組小鼠LPMCs 中，Nrf-2、HO-1 蛋白表達(dá)均顯著增加；與DSS 組相比，miR-192 組小鼠 LPMCs 中 Nrf-2、HO-1蛋白表達(dá)明顯增加，NC組無顯著性差異。見圖7。

圖7 過表達(dá)miR-192 對LPMCs 中Nrf-2/HO-1 信號通路表達(dá)Fig.7 Overexpression of miR-192 affects expression of Nrf-2/HO-1 signaling pathways in LPMCs

3 討論

UC作為炎癥性腸病的一種，其具體發(fā)病機(jī)制未完全清楚，而近年來，我國UC 的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前臨床針對UC現(xiàn)有治療方法的效果均不理想，UC的治療依賴于對其機(jī)制的研究。

異常的先天性或適應(yīng)性免疫反應(yīng)促進(jìn)UC 的進(jìn)展，其中包括促炎因子（如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12等）的表達(dá)水平升高及抑炎因子（如IL-10）的表達(dá)水平降低［13-14］。此外，腸黏膜組織氧化-抗氧化系統(tǒng)的失衡也是導(dǎo)致UC 發(fā)生的重要原因。在正常情況下，機(jī)體內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）（如H2O2、超氧陰離子、NO 等）受超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化物酶和一些抗氧化分子的精確調(diào)控，使活性氧的生成與清除維持在動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)下［15］。而當(dāng)機(jī)體受到有害刺激時(shí)ROS 濃度急劇升高并超出抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)代償能力時(shí)就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，刺激細(xì)胞生成多種傷害性物質(zhì)作用于腸上皮細(xì)胞，引起上皮細(xì)胞的功能障礙，損傷腸黏膜屏障［16-17］。

miRNAs 作為長度約為20~25 個(gè)核苷酸組成的短鏈非編碼RNA，近年來在腫瘤、心腦血管、內(nèi)分泌代謝及病毒感染等多種疾病領(lǐng)域的作用已受到越來越多學(xué)者的關(guān)注［18］。而在炎癥性腸病中，國內(nèi)外多數(shù)學(xué)者發(fā)現(xiàn)UC 患者的腸黏膜組織存在異常表達(dá)的miRNAs譜，其中miR-192在多個(gè)研究的結(jié)果中均表現(xiàn)為異常降低的現(xiàn)象［4-5，19］。miR-192由13號染色體長臂所編碼，研究發(fā)現(xiàn)其在不同的器官或組織中發(fā)揮著不同的作用，如在腎臟中，miR-192 能夠調(diào)控TGF-β/Smad3 通路參與調(diào)控腎臟的纖維化［20］。在肺癌中，miR-192-5p 能夠在姜黃素的作用下上調(diào)其表達(dá)，通過PI3K/AKT 信號通路抑制肺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡［21］。在本研究中通過DSS建立小鼠UC 模型發(fā)現(xiàn)，miR-192 在UC 小鼠的結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)異常降低，這與既往的研究結(jié)果相同。同時(shí)，通過慢病毒過表達(dá)小鼠腸道黏膜組織中miR-192 發(fā)現(xiàn)，miR-192 能夠顯著改善 UC 小鼠的體重下降、黏液膿血便等癥狀。結(jié)腸黏膜的HE 染色也證實(shí)，過表達(dá)miR-192能夠減輕UC 小鼠結(jié)腸組織的病理損傷。此外，檢測過表達(dá)miR-192對UC 小鼠結(jié)腸組織炎癥因子的表達(dá)及氧化應(yīng)激的影響，結(jié)果miR-192 能夠顯著降低結(jié)腸黏膜組織對促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌，上調(diào)抑炎因子IL-10的表達(dá)，同時(shí)增加 SOD 活性，減少 MDA 的產(chǎn)生。SOD 作為機(jī)體重要的抗氧化物酶，能夠清除組織內(nèi)過度釋放的氧自由基。腸道黏膜組織的SOD 抗氧化活性功能減低可導(dǎo)致局部的自由基清除能力受限，加重UC病情的進(jìn)展。而MDA則是由ROS誘發(fā)而產(chǎn)生不飽和脂肪酸，其常被作為氧化應(yīng)激對組織損傷的標(biāo)志［22］。為進(jìn)一步明確miR-192發(fā)揮上述保護(hù)性作用的相關(guān)機(jī)制，應(yīng)用生物信息學(xué)進(jìn)行深入探究，miR‐NA靶基因預(yù)測結(jié)果表明，HO-1存在能夠與miR-192結(jié)合的序列，隨后雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩者的靶向調(diào)控關(guān)系。

HO-1是近年來發(fā)現(xiàn)的一種應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，可由ROS 和炎癥信號誘導(dǎo)產(chǎn)生，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)作用［23］。因而，HO-1的表達(dá)被認(rèn)為是對抗炎癥反應(yīng)和氧化損傷的適應(yīng)性細(xì)胞反應(yīng)［24］。在體內(nèi)HO-1 與Nrf2 形成Nrf2/HO-1 信號通路，通過調(diào)控體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。而近年來有研究發(fā)現(xiàn)Nrf2/HO-1能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞的分化參與多種病理生理過程［25］。巨噬細(xì)胞作為腸道黏膜的固有免疫細(xì)胞，能通過多種炎癥因子調(diào)控結(jié)腸炎，特別是急性期結(jié)腸的進(jìn)展。既往研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在不同的刺激下可分為M1 型與M2 型巨噬細(xì)胞，而這兩種類型在UC 的發(fā)生發(fā)展中起著相反的作用［26］。M1 型巨噬細(xì)胞主要通過 INF-γ、TNF-α 等信號誘導(dǎo)激活，分泌大量IL-1β、TNF-α 等促炎因子，損傷黏膜結(jié)構(gòu)及功能，加劇UC 的進(jìn)展。而M2 型巨噬細(xì)胞又稱抗炎癥巨噬細(xì)胞，其主要通過IL-4、IL-10 等誘導(dǎo)激活，穩(wěn)定高水平表達(dá) IL-10 以促進(jìn)黏膜損傷的修復(fù)［2，27］。最近有研究證實(shí)，HO-1 通過促進(jìn)IL-10 的表達(dá)激活巨噬細(xì)胞的 M2 型極化，并抑制促炎因子 IL-6、TNF-α 等表達(dá)［28-29］。本研究發(fā)現(xiàn)在UC 小鼠體內(nèi)過表達(dá)miR-192同樣能夠通過Nrf2/HO-1信號通路調(diào)控結(jié)腸黏膜巨噬細(xì)胞向M2 型極化，這可能是miR-192 在UC 小鼠體內(nèi)發(fā)揮上述腸黏膜保護(hù)功能的作用機(jī)制。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)在DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中miR-192 可靶向調(diào)控Nrf2/HO-1 信號通路的表達(dá)，促進(jìn)腸黏膜巨噬細(xì)胞M1 型極化，發(fā)揮抗炎、抗氧化作用，改善結(jié)腸炎癥狀從而發(fā)揮保護(hù)作用，為結(jié)腸炎的治療提供了新的策略與方向。