徐鳳敏 陳昱伶 任 玲 蒙春梅 李倩倩 胡為民 （川北醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，南充637100）

食管癌是世界上常見的癌癥之一，主要包括食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌，鱗癌是我國食管癌最主要的病理類型。我國是食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，并且發(fā)病率有明顯的地區(qū)分布特點(diǎn)，其中，川北地區(qū)的鹽亭、南部、閬中等是高發(fā)地區(qū)之一［1-2］。食管癌因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)晚、進(jìn)展快，導(dǎo)致預(yù)后較差［3］。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展與1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）/1 型 1-磷酸鞘氨醇受體（sphingosine 1-phosphate receptor 1，S1PR1）通路密切相關(guān)：胞漿S1PR1 蛋白在食管鱗癌細(xì)胞中表達(dá)明顯高于癌旁正常上皮細(xì)胞，在低分化的ESCC 組織中比在高分化的組織中表達(dá)更高；胞漿S1PR1 促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S 期過渡，增強(qiáng)Eca109細(xì)胞的遷移能力［4］。課題組也采用有參轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌Eca109細(xì)胞中過表達(dá)S1PR1 導(dǎo)致補(bǔ)體 B 因子（complement factor B，CFB）表達(dá)增加。本研究將進(jìn)一步探究S1P/S1PR1 通路對CFB 的調(diào)節(jié)，以及CFB 對ESCC 細(xì)胞增殖和遷移的影響，為食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制、診斷、治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人食管鱗癌Eca109 細(xì)胞、TE-1 細(xì)胞、KYSE150 細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，并由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 包含人S1PR1 全長與EGFP 融合表達(dá)的載體S1PR1-EGFP 及其對照載體Control-EGFP由美國麻省總醫(yī)院Dr.Wu MX教授惠贈(zèng)。RPMI1640 培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco 公司。胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司。無脂肪酸牛血清白蛋白（fatty acid-free bovine serum albumin，F(xiàn)AF-BSA）購自Sigma 公司。CCK8 試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。LipofectamineTM2000 購自Invitrogen 公司。總RNA 提取試劑盒SV Total RNA Isolation System 購自Promega 公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、定量 PCR 試劑盒 TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）購自寶生物工程（大連）有限公司。ELISA 試劑盒Human CFB（Complement factor B）ELISA Kit 購自武漢菲恩生物科技有限公司。引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。siRNA 合成于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 CFX Connect 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、Imark 酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad 公司，CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Shellab公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人食管鱗癌細(xì)胞株Eca109、TE-1、KYSE150用含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素 100 μg/ml 的 RPMI1640 培養(yǎng)液，于 37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 RT-qPCR 按照說明書提取細(xì)胞的總RNA，測定RNA 濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將得到的cDNA以HPRT為內(nèi)參，按照試劑盒操作方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測目的基因表達(dá)情況。PCR 擴(kuò)增條件為：95℃ 預(yù)變性2 min；95℃ 變性15 s，57℃ 退火20 s，72℃ 延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。65~95℃溶解循環(huán)。相應(yīng)的引物序列如下：S1PR1上游引物：5'-GCTGCTCAAGACCGTAATTATCG-3'，下游引物：5'-ACCAGGAAGTACTCCGCTCTGA-3'；CFB 上游引物：5'-CTGGAGCACCCTGAAGACTC-3'，下游引物：5'-CCGGAGAGTGTAACCGTCAT-3'；HPRT 上 游 引物：5'-TGAGGATTTGGAAAGGGTGT-3'，下游引物：5'-GAGCACACAGAGGGCTACAA-3'。

1.2.3 ELISA 收集細(xì)胞的培養(yǎng)上清于-80℃凍存，按照ELISA 試劑盒說明書操作，標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋。在酶標(biāo)儀450 nm 處測得OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出蛋白濃度，并進(jìn)行相應(yīng)計(jì)算。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.2.4.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Eca109細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后換成含0.1%FAF-BSA RPMI1640培養(yǎng)液，用 LipofectamineTM2000 分別 轉(zhuǎn)染 S1PR1-EGFP 與Control-EGFP 載體，操作按說明書進(jìn)行。6 h 后再次換含0.1%FAF-BSA RPMI1640培養(yǎng)液，48 h收集細(xì)胞。

1.2.4.2 siRNA 轉(zhuǎn)染 TE-1 細(xì)胞接種于 6 孔板、12 孔板或 96 孔板，培養(yǎng) 24 h 后換成含 0.1%FAFBSA RPMI1640 培養(yǎng)液，用 LipofectamineTM2000 按照說明書分別轉(zhuǎn)染NC siRNA、CFB siRNA1 與CFB siRNA2。6 h 后再次換含0.1%FAF-BSA RPMI1640培養(yǎng)液，在不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行相應(yīng)檢測。CFB siRNA1 正義鏈序列：5′-GCGGCGAACGUGUCAGGAATT-3′，反義鏈序列：5′-UUCCUGACACGUUCGCCGCUG-3′；CFB siRNA2 正 義 鏈 序 列 ：5′-AGAUGACGUCCCUCCUGAATT-3′，反義鏈序列：5′-UUCAGGAGGGACGUCAUCUGG-3′；陰性對照NC siRNA 正 義 鏈 序 列 ：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2.4.3 共轉(zhuǎn)染 Eca109 細(xì)胞接種于12 孔板或96 孔板，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后按照共轉(zhuǎn)染說明書以LipofectamineTM2000 分別轉(zhuǎn)染Control-EGFP+NC siRNA、S1PR1-EGFP+CFB siRNA1、S1PR1-EGFP+CFB siRNA2、S1PR1-EGFP+NC siRNA。6 h 后均換液為含0.1%FAF-BSA RPMI1640 培養(yǎng)液，后在不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行相應(yīng)檢測。

1.2.5 CCK8 法檢測細(xì)胞增殖 TE-1 細(xì)胞或Eca109 細(xì)胞接種于96 孔板，24 h 后分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)siRNA、siRNA+質(zhì)粒。第0、1、2、3 天每孔加入10 μl CCK8試劑，酶標(biāo)儀450 nm處檢測OD值。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 取12孔板底部用碳素筆畫三道橫線，TE-1細(xì)胞或Eca109細(xì)胞接種于12 孔板中，24 h 細(xì)胞貼壁后用 100 μl 槍頭垂直于孔內(nèi)劃一道豎痕，換含0.1%FAF-BSA RPMI1640 培養(yǎng)液，進(jìn)行0 h 拍照，后按照說明書在各孔分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)siRNA、siRNA+質(zhì)粒。72 h 時(shí)對同一視野進(jìn)行拍照，得到的圖片通過Image J 軟件進(jìn)行處理，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS23.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Eca109、TE-1、KYSE150 細(xì)胞中S1PR1、CFB 的表達(dá)情況 采用RT-qPCR 方法檢測食管鱗癌細(xì)胞株中 S1PR1、CFB mRNA 表達(dá)量，結(jié)果如圖 1 所示，S1PR1 mRNA 在TE-1 細(xì)胞中表達(dá)量遠(yuǎn)高于Eca109和 KYSE150 細(xì)胞（P＜0.001），CFB mRNA 在 TE-1 細(xì)胞中表達(dá)量最高，在Eca109、KYSE150 細(xì)胞中表達(dá)量低（P＜0.001）。結(jié)果顯示在3 種細(xì)胞中，TE-1 細(xì)胞 高 表 達(dá) S1PR1、CFB；Eca109 細(xì) 胞 中 低 表 達(dá)S1PR1、CFB，因此選擇 Eca109 細(xì)胞過表達(dá) S1PR1，TE-1細(xì)胞敲低CFB來進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 Eca109、TE-1、KYSE150 細(xì)胞中 S1PR1、CFB mRNA的表達(dá)情況Fig.1 Expressions of S1PR1 and CFB mRNA in Eca109，TE-1 and KYSE150 cells

2.2 S1PR1過表達(dá)對Eca109細(xì)胞中CFB的影響 對Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染S1PR1-EGFP、Control-EGFP 48 h后，結(jié)果證實(shí)過表達(dá)S1PR1 的Eca109 細(xì)胞的S1PR1表達(dá)水平顯著升高，明顯高于對照組（P＜0.001，圖2A），此外，相比于對照組，過表達(dá)S1PR1 后Eca109 細(xì)胞的CFB mRNA 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01，圖2B），與有參轉(zhuǎn)錄組高通量測序的結(jié)果吻合。

圖2 S1PR1過表達(dá)Eca109細(xì)胞中CFB mRNA表達(dá)情況Fig.2 Expression of CFB mRNA in S1PR1-overexpress?ing Eca109 cells

2.3 TE-1 細(xì)胞中敲低CFB 表達(dá) 高表達(dá)CFB 的TE-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 CFB siRNA1 或 CFB siRNA2 后，48 h收集細(xì)胞做RT-qPCR，結(jié)果如圖3A 所示。48 h收集細(xì)胞上清做ELISA，結(jié)果如圖3B 所示。相比于NC siRNA組，轉(zhuǎn)染了CFB siRNA1或CFB siRNA2的TE-1細(xì)胞的CFB mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001），分泌CFB水平明顯降低（P＜0.05）。

圖3 TE-1細(xì)胞中敲低CFB表達(dá)Fig.3 Knockdown of CFB in TE-1 cells

2.4 S1PR1-EGFP 與 CFB siRNA 共轉(zhuǎn)染對 Eca109細(xì)胞CFB 分泌的影響 S1PR1-EGFP 與CFB siRNA共轉(zhuǎn)染Eca109 細(xì)胞，于72 h 時(shí)收集細(xì)胞上清做ELISA，結(jié)果如圖 4 所示，S1PR1-EGFP+NC siRNA 的CFB 分泌水平高于 Control-EGFP+NC siRNA（P＜0.01）。 而 S1PR1-EGFP+CFB siRNA1 和 S1PR1-EGFP+CFB siRNA2 的CFB 分泌水平低于S1PR1-EGFP+NC siRNA 組（P＜0.001）。

圖4 S1PR1-EGFP 和 CFB siRNA 共 轉(zhuǎn) 染 對 Eca109 細(xì) 胞CFB分泌的影響Fig.4 Effects of S1PR1-EGFP and CFB siRNA cotrans?fection on secretion of CFB in Eca109 cells

2.5 S1PR1-EGFP 與 CFB siRNA 共轉(zhuǎn)染對 Eca109細(xì)胞增殖和遷移的影響 S1PR1-EGFP 與CFB siRNA 共轉(zhuǎn)染 Eca109 細(xì)胞，于第 0、1、2、3 天分別用CCK8 法測定各組 OD 值，結(jié)果如圖 5 所示，S1PR1-EGFP+NC siRNA 增殖能力大于Control-EGFP+NC siRNA（P＜0.001）。而S1PR1-EGFP+CFB siRNA1 和S1PR1-EGFP+CFB siRNA2 的增殖能力小于S1PR1-EGFP+NC siRNA 組（P＜0.001）。 S1PR1-EGFP 與CFB siRNA 共轉(zhuǎn)染 Eca109 細(xì)胞，72 h 后拍照并計(jì)算細(xì)胞遷移率，結(jié)果如圖6 所示，轉(zhuǎn)染72 h 后，S1PR1-EGFP+NC siRNA 組遷移率大于Control-EGFP+NC siRNA 組（P＜0.001）。而S1PR1-EGFP+CFB siRNA1組和S1PR1-EGFP+CFB siRNA2 組的遷移率均小于S1PR1-EGFP+NC siRNA 組（P＜0.001）。

圖5 S1PR1-EGFP 和 CFB siRNA 共轉(zhuǎn)染對 Eca109 細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of S1PR1-EGFP and CFB siRNA cotransfec?tion on proliferation of Eca109 cells

圖6 S1PR1-EGFP 和 CFB siRNA 共轉(zhuǎn)染對 Eca109 細(xì)胞遷移的影響Fig.6 Effect of S1PR1-EGFP and CFB siRNA cotransfec?tion on migration of Eca109 cells

2.6 敲低CFB 對TE-1 細(xì)胞增殖和遷移的影響 CCK8 結(jié)果顯示，與陰性對照相比，TE-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染CFB siRNA1、CFB siRNA2 后，在第2 天開始，其增殖能力受到抑制，于第3 天時(shí)更加明顯（P＜0.05；P＜0.001，圖 7）。轉(zhuǎn)染了 CFB siRNA1、CFB siRNA2 的TE-1 細(xì)胞，通過 Image J 分析劃痕，發(fā)現(xiàn) 72 h 后其遷移率小于陰性對照組細(xì)胞（P＜0.001，圖8）。

圖7 敲低CFB對TE-1細(xì)胞增殖的影響Fig.7 Effect of CFB knockdown on proliferation of TE-1 cells

圖8 敲低CFB對TE-1細(xì)胞遷移的影響Fig.8 Effect of CFB knockdown on migration of TE-1 cells

3 討論

目前已鑒定的S1P 的高親和力受體有5 型，即S1PR1~5，S1P 受體均可與S1P 以較高的親和力結(jié)合參與增殖、遷移和血管生成等關(guān)鍵的細(xì)胞過程［5］。S1P 主要為鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SPHK）活化鞘氨醇（sphingosine，SPH）而產(chǎn)生，目前，SPHK1和SPHK2 是已知磷酸化SPH 產(chǎn)生S1P 的兩個(gè)激酶，能被包括多種細(xì)胞因子在內(nèi)的生物活性分子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和活化，產(chǎn)生 S1P［6-10］。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的 S1P 經(jīng)過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分泌到細(xì)胞外，以自分泌、旁分泌和/或內(nèi)分泌方式作用于受體而發(fā)揮其功能。S1P/S1PRs通路在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮重要作用，包括胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移［11-12］。S1PR1 參與腫瘤發(fā)生，與多種腫瘤的遷移、增殖和侵襲有關(guān)［13］。在低表達(dá) S1PR1 和 CFB 的Eca109 細(xì)胞中過表達(dá)S1PR1，結(jié)果顯示誘導(dǎo)CFB 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，并且干擾CFB 表達(dá)可抑制Eca109 細(xì)胞的增殖和遷移；在高表達(dá)S1PR1 和 CFB 的 TE-1 細(xì)胞中單獨(dú)敲低 CFB 的表達(dá)，TE-1 細(xì)胞的增殖和遷移也會(huì)受到明顯抑制，說明S1P/S1PR1 通路能誘導(dǎo)CFB 表達(dá)，促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移，CFB 可能在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

CFB 為補(bǔ)體系統(tǒng)重要組分之一，參與補(bǔ)體激活的旁路途徑和正反饋放大環(huán)。在腫瘤患者和小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)幾種補(bǔ)體基因的表達(dá)增加，導(dǎo)致血漿或其他體液中補(bǔ)體的濃度高于正常。早期的研究認(rèn)為，補(bǔ)體可以通過細(xì)胞毒作用參與抗腫瘤免疫效應(yīng)機(jī)制。針對腫瘤細(xì)胞表面抗原的抗體與其結(jié)合，通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，形成攻膜復(fù)合物（membrane attack complex，MAC）導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞溶解，即補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒（complement-dependent cytotoxicity，CDC）作用。然而，近年來研究顯示，越來越多的證據(jù)似乎支持相反的觀點(diǎn)：補(bǔ)體不僅沒有起到抑制腫瘤的作用，反而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。在卵巢癌模型中，腫瘤細(xì)胞中補(bǔ)體活化產(chǎn)生的補(bǔ)體片段C3a 和C5a，以自分泌方式調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲［14］。沉積在幾種人類惡性腫瘤和小鼠腫瘤中的C1q通過其促血管生成和直接調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞動(dòng)力和增殖來加速腫瘤生長［15］。RIIHILA 等［16］發(fā)現(xiàn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞表達(dá) C3、CFB 促進(jìn)腫瘤的生長。BOIRE 等［17］用4 種不同的人類腫瘤細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的C3可能有助于其存活和軟腦膜轉(zhuǎn)移。此外，補(bǔ)體也在腫瘤微環(huán)境以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用［18-20］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)S1P/S1PR1 通路能誘導(dǎo)CFB表達(dá)，促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移，CFB可能在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。CFB或可作為腫瘤免疫治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)，并開發(fā)針對性的抗體和抑制劑。本研究對S1P/S1PR1 通路調(diào)控CFB 的初步探索也為后續(xù)的機(jī)制研究和臨床治療提供了一個(gè)新的思路。