王兆建 （青海大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，西寧810001）

小兒肺炎是一種下呼吸道病原體感染的炎癥性疾病，可累及心臟、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)，是我國小兒住院死亡率最高的疾病。因此，探究小兒肺炎的發(fā)病機(jī)制已成為目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。MicroRNA（miRNA）是一類非編碼內(nèi)源性的小RNA，它們通過與靶基因的3'端非編碼區(qū)結(jié)合，下調(diào)靶基因的表達(dá)水平，對(duì)生物體中許多基本生命過程起到重要的調(diào)控作用。miR-9-5p 作為一種炎癥相關(guān)miRNA，通過調(diào)控炎癥反應(yīng)在關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化等多種疾病的生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用［1-2］。但對(duì)miR-9-5p 是否參與調(diào)控肺炎的炎癥反應(yīng)研究較少。趨化因子配體11（chemokine C-X-C motif ligand 11，CXCL11）是CXC 趨化因子家族中的一員，通過介導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到組織損傷部位參與重癥肺炎的發(fā)?。?］。生物信息學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)，CXCL11可能是 miR-9-5p 的靶基因。miR-9-5p 與 CXCL11 在肺炎發(fā)病過程中是否具有調(diào)控作用，有待于進(jìn)一步探究。本研究以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的幼年小鼠肺炎為模型，初步探討了miR-9-5p 靶向調(diào)控CXCL11 對(duì)幼年肺炎模型小鼠的作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗小鼠Bax、CXCL11、TLR4、p-p65、p-I-κB 和 GAPDH 單克隆抗體及 HRP 標(biāo)記山羊抗兔的二抗、IL-1β（ab216165）、TNF-α（ab208348）的ELISA 試劑盒均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Trizol 試劑、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒、蛋白雙染marker、顯影液、脫脂奶粉、LPS、miR-9、CXCL11及內(nèi)參基因引物均購自上海生工生物科技有限公司；雙熒光素酶檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)試劑盒、miR-9-5p agomir 及其對(duì)照（agomir-NC）、miR-9-5p mimic 及其對(duì)照（mimic-NC）、pcDNA3.1-CXCL11 及其對(duì)照（pcDNA3.1）均購自美國Promega 公司；293T 細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及LPS 誘導(dǎo)的幼年小鼠肺炎模型的建立 健康雄性C57BL/6J 幼年小鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2019-0011。飼養(yǎng)條件為：12 h 光/12 h 暗周期、溫度23~25℃，相對(duì)濕度40%~70%。

將36 只小鼠分為對(duì)照組、模型組、miR-9-5p agomir組、agomir-NC組、miR-9-5p agomir+pcDNA3.1組、miR-9-5p agomir+pcDNA3.1-CXCL11 組，每組6 只。除對(duì)照組外，其余小鼠腹腔注射5 mg/kg LPS［4］，然后分別將 1 nmol miR-9-5p agomir、agomir-NC、miR-9-5p agomir+pcDNA3.1、miR-9-5p agomir+pcDNA3.1-CXCL11 用 20 μl PBS 溶 解 ，采 用 Lipofectamine 2000 將上述質(zhì)粒通過尾靜脈注射到對(duì)應(yīng)分組小鼠體內(nèi)［5］，對(duì)照組注射等量生理鹽水。連續(xù)處理7 d后取出肺組織。

1.2.2 RT-qPCR 檢測(cè)各組小鼠肺組織中miR-9-5p和CXCL11 mRNA 表達(dá)水平 Trizol 抽提各組小鼠肺組織的RNA，分別按照一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒說明書檢測(cè)miR-9-5p 和CXCL11 mRNA 的表達(dá)。以U6 和GAPDH 為內(nèi)參。RT-qPCR 反應(yīng)體系：2×onestep RT-qPCR Master Mix 10 μl、0.5 μmo/lL上/下游引物、0.5 μl RNA、RT enzyme Mix 0.65 μl、用 ddH2O 補(bǔ)足 20 μl。RT-qPCR 反應(yīng)程序，反轉(zhuǎn)錄50℃ 5 min，1 個(gè)循環(huán)，95℃ 預(yù)變性 5 min，1 個(gè)循環(huán)，95℃ 變性 10 s，59℃ 退火 10 s，72℃ 延伸 15 s，45 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品進(jìn)行 3 次重復(fù)，2-ΔΔCt的方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。miR-9-5p 正向5'-GAAATGTCGTTCGAATTAGTGAG-3'，反 向 5'-GAAAAAAACCGACCTCACGA-3'，U6正向：5'-GCTTCGGCAGCACA-3'，反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。CXCL11 正向 5'-GACGCTGTCTTTGCATAGGC-3'，反向：5'-GGATTTAGGCATCGTTGTCCTTT-3'；GAPDH 正向：5'-AGGAGCGAGATCCCTCCAAA-3'，GAPDH 反向：5'-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。

1.2.3 HE 染色觀察各組小鼠肺組織病理變化 各組肺組織按1.5 cm×1.5 cm×0.4 cm 大小取材，采用10%甲醛固定，石蠟包埋后HE 染色進(jìn)行病理學(xué)檢驗(yàn)。

1.2.4 ELISA 試劑盒檢測(cè)各組小鼠肺組織IL-1β、TNF-α 含量 取各組0.1 g組織按1∶9（V/V）的比例加入預(yù)冷PBS 緩沖液，研磨后制備成10%的組織勻漿，將組織勻漿以3 000/rmin 離心5 min，收集上清，具體操作步驟按照ELISA法檢測(cè)試劑盒說明書，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。

1.2.5 TUNEL 檢測(cè)各組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況 各組肺組織分別用100 g/L 中性甲醛固定，石蠟包理，5 μm 厚連續(xù)切片。然后按照TUNEL 法檢測(cè)組織細(xì)胞凋亡試劑盒說明操作，檢測(cè)小鼠肺組織凋亡情況。

1.2.6 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-9-5p 與CXCL11的靶向關(guān)系 構(gòu)建野生型（CXCL11-W）和突變型（CXCL11-M）的CXCL11 3'-UTR 雙熒光報(bào)告質(zhì)粒。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T 細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種至12 孔細(xì)胞板上，將CXCL11-W、CXCL11-M 與miR-9-5p mimics 或 mimics NC 共轉(zhuǎn)染至 293T 細(xì)胞。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置6 個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h 后，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒步驟檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)各組小鼠肺組織CXCL11、Bax、TLR4、p-p65、p-I-κB 蛋白表達(dá)水平 各組肺組織中分別加入RIPA 裂解液，冰上裂解20 min，蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉。用兔抗CXCL11（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、TLR4（1∶1 000）、p-p65（1∶1 000）、p-I-κB（1∶1 000）、GAPDH 單克隆抗體（1∶10 000）在室溫下孵育2 h、洗膜；用羊抗兔HRP 二抗（1∶10 000）在室溫下孵育1 h、洗膜，ECL顯影。化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用表示，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05（雙側(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 miR-9-5p 和CXCL11 在肺炎小鼠中的表達(dá) 對(duì)照組肺炎小鼠miR-9-5p 和CXCL11 mRNA 表達(dá)水平 分 別 為 3.09±0.15、1.01±0.06，模 型 組 0.99±0.08、3.40±0.30，agomir-NC 組 1.06±0.09、3.36±0.35，miR-9-5p agomir 組 4.88±0.84、0.34±0.05。小鼠肺組織中miR-9-5p 表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下降，CXCL11 mRNA 表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高（均P＜0.05）；小 鼠 肺 組 織 中 miR-9-5p 表 達(dá) 水 平 較agomir-NC 組顯著升高，CXCL11 mRNA 表達(dá)水平較agomir-NC組顯著下降（均P＜0.05）。

2.2 各組小鼠肺組織病理變化 對(duì)照組小鼠肺組織無炎性浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔正常；模型組和agomir-NC組小鼠肺組織出現(xiàn)大量炎性浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)受損，肺泡壁增厚。與agomir-NC 組比，miR-9-5p agomir組小鼠肺組織炎性浸潤(rùn)肺泡結(jié)構(gòu)受損和肺泡壁增厚情況得到改善，見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理切片（×100）Fig.1 Pathological sections of lung tissues of mice in each group（×100）

2.3 各組小鼠IL-1β、TNF-α 含量變化 模型組和agomir-NC 組小鼠肺組織中 IL-1β、TNF-α 含量較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），miR-9-5p agomir 組小鼠肺組織中 IL-1β、TNF-α 含量較 agomir-NC 組顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠IL-1β、TNF-α含量（，n=6，pg/ml）Tab.1 Contents of IL-1β and TNF-α in each group of mice（，n=6，pg/ml）

表1 各組小鼠IL-1β、TNF-α含量（，n=6，pg/ml）Tab.1 Contents of IL-1β and TNF-α in each group of mice（，n=6，pg/ml）

Note：1）P＜0.05 vs control；2）P＜0.05 vs agomir-NC.

TNF-α 38.46±2.10 145.89±3.531）145.77±3.941）95.27±6.092）Groups Control Model agomir-NC miR-9-5p agomir IL-1β 15.12±0.73 45.89±3.531）45.77±3.941）29.44±1.762）

2.4 各組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況 模型組和agomir-NC 組小鼠肺組織陽性細(xì)胞數(shù)和Bax 蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高（均P＜0.05），miR-9-5p agomir 組小鼠肺組織細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)和Bax 蛋白表達(dá)水平較agomir-NC組顯著下降（均P＜0.05），見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Cell apoptosis in lung tissue of mice in each group

2.5 miR-9-5p 調(diào)控 TLR4/NF-κB 信號(hào)通路 與對(duì)照組比，模型組和agomir-NC 組TLR4、p-p65、p-I-κB蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），與agomir-NC組比，miR-9-5p agomir組TLR4、p-p65、p-I-κB蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 miR-9-5p調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路Fig.3 miR-9-5p regulates TLR4/NF-κB signaling pathway

2.6 miR-9-5p 靶 向 CXCL11 Targetscan 網(wǎng) 站 預(yù)測(cè)到miR-9-5p 與CXCL11 存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-9-5p agomir 顯著抑制野生型CXCL11 3'UTR 熒光素酶活性，對(duì)突變型CXCL11 3'UTR 熒光素酶活性無作用，Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-9-5p agomir 組 CXCL11蛋白表達(dá)水平較agomir-NC組顯著升高，見圖4。

圖4 miR-9-5p靶向CXCL11Fig.4 miR-9-5p targets CXCL11

2.7 CXCL11 回 補(bǔ) miR-9-5p 的 作 用 miR-9-5p agomir+pcDNA3.1-CXCL11組IL-1β、TNF-α 含量、肺組織陽性細(xì)胞數(shù)、Bax 蛋白以及TLR4、p-p65、p-I-κB表達(dá)水平均顯著高于miR-9-5p agomir+pcDNA3.1組（P＜0.05），見表2、圖5。

表2 各組小鼠IL-1β、TNF-α含量（，n=6，pg/ml）Tab.2 Contents of IL-1β and TNF-α in each group of mice（，n=6，pg/ml）

表2 各組小鼠IL-1β、TNF-α含量（，n=6，pg/ml）Tab.2 Contents of IL-1β and TNF-α in each group of mice（，n=6，pg/ml）

Note：1）P＜0.05 vs miR-9-5p agomir+pcDNA3.1.

TNF-α 95.27±6.09 145.77±3.94 96.68±4.87 160.84±3.811）Groups miR-9-5p agomir agomir-NC miR-9-5p agomir+pcDNA3.1 miR-9-5p agomir+pcDNA3.1-CXCL11 IL-1β 29.44±1.76 45.77±3.94 30.01±1.24 58.12±2.241）

圖5 CXCL11回補(bǔ)miR-9-5p的作用Fig.5 Effect of CXCL11 rescue miR-9-5p

3 討論

miRNA作為小RNA中的一種，與糖尿病、腫瘤、心血管疾病、人類遺傳疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］。GUO 等［7］研究表明miR-1247可以抑制LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞急性肺炎；PODSIAD 等［8］研究表明miR-155通過IL-23/IL-17途徑調(diào)節(jié)宿主對(duì)細(xì)菌性肺炎的免疫應(yīng)答；WANG 等［9］研究表明在支原體肺炎小鼠中上調(diào)miR-143-3p 表達(dá)，可以改善肺部炎癥。因此，miRNA 在肺炎發(fā)病機(jī)理中可能起關(guān)鍵作用。

miR-9-5p 起初發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)系統(tǒng)，目前已被證實(shí)能夠參與神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育過程，同時(shí)還被證實(shí)在不同類型的腫瘤中可以發(fā)揮抑癌或者促癌作用［10-12］。值得注意的是，OU 等［13］研究指出過度表達(dá)miR-9-5p 通過下調(diào) p50 抑制 NF-κB 信號(hào)通路，從而減輕深靜脈血栓（DVT）大鼠的炎癥和血栓形成。YI等［14］研究發(fā)現(xiàn) miR-9-5p 通過靶向 CXCR4 減輕高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)炎癥反應(yīng)。以上研究提示miR-9-5p 是一個(gè)抗炎因子。本研究發(fā)現(xiàn)miR-9-5p 在LPS 誘導(dǎo)的幼年肺炎小鼠肺組織中表達(dá)下調(diào)。由此推測(cè)miR-9-5p 可能在調(diào)控肺炎的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用?；诖私Y(jié)果，本研究將miR-9-5p agomir注射到肺炎小鼠體內(nèi)，肺組織中IL-1β、TNF-α明顯降低，肺組織炎癥細(xì)胞滲出和浸潤(rùn)減輕，進(jìn)一步證實(shí)miR-9-5p在肺炎中發(fā)揮抗炎作用。

CXCL11 稱為干擾素誘導(dǎo)的T 細(xì)胞α 趨化因子，位于人類第4 號(hào)染色體上，主要表達(dá)在白細(xì)胞、胰腺、肝臟。在小鼠甲型H1N1 流感病毒介導(dǎo)小鼠肺炎中CXCL11 的表達(dá)量隨著炎癥程度的增加而增加，且與其受體CXCR3結(jié)合參與肺炎的免疫調(diào)節(jié)過程，與炎癥細(xì)胞趨化游走密切相關(guān)［3，15］。本研究在Targetscan 網(wǎng)站預(yù)測(cè)查詢發(fā)現(xiàn)，CXCL11 3'UTR 中存在miR-9-5p 的目標(biāo)堿基序列，且發(fā)現(xiàn)CXCL11 在LPS 誘導(dǎo)的幼年肺炎小鼠肺組織中表達(dá)量升高。RT-qPCR 和 Western blot 分析結(jié)果顯示，CXCL11 在miR-9-5p agomir 注射后下調(diào)，由此推測(cè)miR-9-5p 對(duì)CXCL11 有靶向調(diào)控作用。本研究應(yīng)用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了此推測(cè)。且通過回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明miR-9-5p 通過調(diào)控CXCL11 的表達(dá)參與肺炎發(fā)生發(fā)展。Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）是先天免疫受體，參與機(jī)體免疫調(diào)控和炎癥反應(yīng)。LPS 作為革蘭氏陰性菌的主要致病成分能夠特異激活TLR4信號(hào)通路，引發(fā)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化和促炎癥因子產(chǎn)生，從而損傷肺組織［16-17］。目前越來越多研究表明在多種疾病中miRNA 調(diào)控炎癥反應(yīng)與TLR4/NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)［18-19］。在肺炎中，WANG等［9］研 究 表 明 miRA-143-3p 調(diào) 控 TLR4/MyD88/NF-κB通路降低小鼠肺部炎癥因子。本研究結(jié)果表明，miR-9-5p agomir 注射后，TLR4、p-p65、p-I-κB 蛋白表達(dá)水平均顯著降低。由此得出miR-9-5p 在肺炎中發(fā)揮抗炎作用可能與抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。

在肺炎的發(fā)展中，細(xì)胞凋亡與肺炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，且激活凋亡通路可加重肺組織炎癥反應(yīng)［20］。CHEN 等［21］研究表明上調(diào) microRNA-9-5p 通過下調(diào)固生蛋白C（Tnc）抑制脛骨平臺(tái)骨折后骨關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨細(xì)胞凋亡；YI 等［14］研究表明在高糖誘導(dǎo)損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)miR-9-5p 能降低細(xì)胞凋亡率。本研究發(fā)現(xiàn)miR-9-5p agomir 注射到肺炎小鼠體內(nèi)，肺組織細(xì)胞凋亡率和Bax 蛋白明顯降低，提示miR-9-5p 通過抑制細(xì)胞凋亡對(duì)肺炎具有保護(hù)作用。

綜上所述，miR-9-5p 靶向CXCL11 可能通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路降低炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡對(duì)幼年肺炎模型小鼠具有保護(hù)作用，提示miR-9-5p 有可能成為小兒肺炎治療的新靶點(diǎn)。但值得注意的是，miRNA 對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜，一個(gè)miRNA 可能調(diào)控了若干個(gè)靶基因。因此，需要進(jìn)一步探究miR-9-5p在幼年小鼠肺炎的具體機(jī)制。