蒙 沖 謝 甜 陳永倖 （海南省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，?？?70100）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中最常見的類型之一，占肺癌患者80%以上［1］。NSCLC 早期診斷率低，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，預后不佳［2］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA）是兩類與人類多種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的小分子非編碼RNA，且兩者可相互作用［3-5］。癌易感性候選基因7（CASC7）長度為9.3 kb，屬于lncRNA。研究顯示，CASC7 在直腸癌組織和細胞系中表達降低，其過表達通過靶向抑制miR-21 降低結(jié)腸癌細胞的增殖和遷移［6］。但目前，CASC7 對 NSCLC 發(fā)生發(fā)展的影響機制還未知。DIANA-LncBase v2 在線預測軟件顯示，CASC7與miR-181a-2-3p的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點，提示兩者之間可能存在相互作用。研究顯示，miR-181a-2-3p 在甲狀腺乳頭狀癌中表達上調(diào)，參與該疾病的發(fā)生發(fā)展［7］。但目前，miR-181a-2-3p 在NSCLC 組織中的表達及其對NSCLC 細胞惡性生物學行為的影響也還未知。本研究首先檢測了39 例NSCLC 患者組織和對應(yīng)的癌旁組織中CASC7與 miR-181a-2-3p 的表達，并以 NSCLC 細胞 A549 為研究對象，觀察了CASC7 對A549 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其能否靶向調(diào)控miR-181a-2-3p發(fā)揮作用，以期為NSCLC 的分子治療提供可能的靶點。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 收集2017 年10 月至2018 年12 月于本院行手術(shù)切除的39 例NSCLC 患者的癌組織和對應(yīng)的癌旁組織，并在液氮中保存。其中39例患者中男性患者23 例，女性患者16 例，平均年齡（64.29±8.76）歲。TNM 分期Ⅰ期 6 例，Ⅱ期 12 例，Ⅲ期21例；淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移24例，未轉(zhuǎn)移15例。納入標準：經(jīng)病理診斷確診；手術(shù)前未進行放療、化療等治療。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者；合并肝、腎等重要臟器功能障礙者；合并自身免疫系統(tǒng)疾病患者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準，患者知情同意。

1.1.2 實驗細胞和試劑 NSCLC 細胞A549 購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清（FBS）購自美國Hycolne 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、四甲基噻唑藍（MTT）、胰蛋白酶、LipofectamineTM2000試劑盒、雙熒光素酶活性檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；Trizol試劑購自美國 Invitrogen 公司；PCR 引物、CASC7 過表達載體（pcDNA-CASC7）、miR-181a-2-3p 模擬物（mimics）和抑制劑（anti-miR-181a-2-3p）及各自的對照序列pcDNA、miR-NC 和 anti-miR-NC 均購自廣州銳博生物科技有限公司；細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、活化的半胱天冬酶-3（cleaved-caspase-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶 2（MMP-2）、MMP-9 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測CASC7和 miR-181a-2-3p 的 mRNA 表達 Trizol 試劑提取組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR 擴增。擴增條件：95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40 個循環(huán)。引物序列見表1。CASC7 以GAPDH 為內(nèi) 參 ，miR-181a-2-3p 以 U6 為 內(nèi) 參 ，2-ΔΔCt法 計 算CASC7和miR-181a-2-3p水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復蘇A549 細胞，加含10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。以1×105個/孔將A549 細胞接種于6 孔板，采用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染 pcDNA-CASC7（pcDNACASC7 組）、pcDNA（pcDNA 組）、pcDNA-CASC7 與anti-miR-NC（pcDNA-CASC7 與 anti-miR-NC 組）、pc-DNA-CASC7 與 anti-miR-181a-2-3p（pcDNA-CASC7+anti-miR-181a-2-3p 組）。轉(zhuǎn)染 6 h 后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞備用。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?PCR 擴增含miR-181a-2-3p結(jié)合位點的CASC7的3'UTR 序列，分別構(gòu)建CASC7野生型質(zhì)粒（CASC7-WT）和突變型質(zhì)粒（CASC7-MUT）。將 CASC7-WT、CASC7-MUT 與miR-181a-2-3p mimic、miR-NC 共轉(zhuǎn)染至 A549 細胞。轉(zhuǎn)染6 h 后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞檢測熒光素酶活性。

1.2.4 MTT 實驗 以0.5×104個/孔將各組細胞接種于96 孔板，并以未轉(zhuǎn)染的A549 細胞作為對照組，每組設(shè)3個復孔。培養(yǎng)24 h，加20 μl的MTT（5 g/L）。然后孵育4 h，棄培養(yǎng)基，加150 μl 二甲基亞砜。振蕩混勻，于MB-530型多功能酶標儀490 nm處測光密度（OD）值。實驗重復3次。

1.2.5 Transwell 實驗 調(diào)整各組細胞密度為5×104個/ml。遷移實驗：Transwell 上室加 100 μl 細胞懸液，下室加500 μl 培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.4%結(jié)晶紫染色后，顯微鏡觀察并拍照，對穿膜細胞進行計數(shù)。侵襲實驗：Matrigel 基質(zhì)膠4℃ 融化，鋪于Transwell 上室，自然晾干后再加100 μl 細胞懸液，后續(xù)實驗步驟同遷移實驗。

1.2.6 細胞凋亡檢測實驗 以1×104個/孔將各組細胞接種于24 孔板。培養(yǎng)24 h，收集細胞。參照Annexin V-FITC/PI 試劑盒說明書，采用CytoFLEX型流式細胞儀檢測細胞凋亡。凋亡率（%）=（早期凋亡數(shù)+晚期凋亡數(shù)）/細胞總數(shù)×100%。

1.2.7 Western blot 實驗 以1×104個/孔將各組細胞接種于24 孔板。培養(yǎng)24 h，收集細胞。RIPA 試劑提取總蛋白，BCA 法對蛋白定量。然后進行10%SDS-PAGE 電泳。電泳后，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜。接著置于5%脫脂奶粉中封閉1 h，再分別加入CyclinD1（1∶1 000）、cleaved-caspase-3（1∶1 000）、MMP-2（1∶1 500）和MMP-9（1∶1 500）一抗，4℃ 孵育過夜。加山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。加化學發(fā)光試劑，避光顯影，CSL-MDOCUV 1D 型凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 SPSS22.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。Pearson 相關(guān)性分析NSCLC 患者癌組織中CASC7 和miR-181a-2-3p 表達的相關(guān)性。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CASC7 和 miR-181a-2-3p 在 NSCLC 患者癌組織中的表達 與癌旁組織比較，NSCLC 患者癌組織中 CASC7 表達水平降低（P＜0.05），miR-181a-2-3p水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 CASC7 和miR-181a-2-3p 在NSCLC 患者癌組織中的表達水平（，n=39）Tab.2 Expression levels of CASC7 and miR-181a-2-3p in cancer tissues of NSCLC patients（，n=39）

表2 CASC7 和miR-181a-2-3p 在NSCLC 患者癌組織中的表達水平（，n=39）Tab.2 Expression levels of CASC7 and miR-181a-2-3p in cancer tissues of NSCLC patients（，n=39）

Note：Compared with adjacent tissues，1）P＜0.05.

miR-181a-2-3p 1.04±0.08 2.59±0.111）71.167＜0.001 Groups Adjacent tissues Cancer tissues t P CASC7 1.01±0.09 0.31±0.061）40.415＜0.001

2.2 NSCLC患者癌組織中CASC7和miR-181a-2-3p表達的相關(guān)性 Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NSCLC 患者癌組織中 CASC7 與 miR-181a-2-3p 的表達呈負相關(guān)（r=-0.694，P＜0.001）。見圖1。

圖1 NSCLC 患者癌組織中CASC7 與miR-181a-2-3p 表達的相關(guān)性Fig.1 Correlation between CASC7 and miR-181a-2-3p expression in cancer tissues of NSCLC patients

2.3 CASC7 靶向負調(diào)控 miR-181a-2-3p CASC7 與miR-181a-2-3p 的核苷酸的結(jié)合位點見圖2。miR-181a-2-3p 可降低 CASC7-WT 的熒光素酶活性（P＜0.05），而對CASC7-MUT 的熒光素酶無顯著影響（P＞0.05），表明 CASC7 可與 miR-181a-2-3p 靶向結(jié)合，見表 3。與 pcDNA 組比較，pcDNA-CASC7 組細胞中CASC7表達水平升高，miR-181a-2-3p表達水平降低，進一步說明CASC7 負調(diào)控miR-181a-2-3p，見表4。

表3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果（，n=9）Tab.3 Experimental results of dual luciferase reporter genes（，n=9）

表3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果（，n=9）Tab.3 Experimental results of dual luciferase reporter genes（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

CASC7-MUT 1.02±0.05 0.99±0.03 1.543＜0.001 Groups miR-NC miR-181a-2-3p t P CASC7-WT 1.03±0.06 0.37±0.051）25.351＜0.001

表4 過表達 CASC7 對 miR-181a-2-3p 表達的影響（，n=9）Tab.4 Effect of overexpressing CASC7 on expression of miR-181a-2-3p（，n=9）

表4 過表達 CASC7 對 miR-181a-2-3p 表達的影響（，n=9）Tab.4 Effect of overexpressing CASC7 on expression of miR-181a-2-3p（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05.

miR-181a-2-3p 1.05±0.03 0.25±0.021）66.564＜0.001 pcDNA pcDNA-CASC7 t P 1.03±0.05 2.90±0.141）37.737＜0.001 GroupsCASC7

圖2 CASC7與miR-181a-2-3p的核苷酸序列的結(jié)合位點Fig.2 Binding site of CASC7 and miR-181a-2-3p nucleo?tide sequence

2.4 CASC7負調(diào)控miR-181a-2-3p對細胞增殖和凋亡的影響 與pcDNA 組比較，pcDNA-CASC7 組細胞OD 值降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05）。與pcDNA-CASC7+miR-NC 組 比 較 ，pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p 組細胞OD 值升高（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05）。對照組與pcDNA 組比較及pcDNACASC7 組與pcDNA-CASC7+miR-NC 組比較細胞OD值和凋亡差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3和表5。

表5 各組細胞OD值和凋亡率（，n=9）Tab.5 OD value and apoptosis rate of each group of cells（，n=9）

表5 各組細胞OD值和凋亡率（，n=9）Tab.5 OD value and apoptosis rate of each group of cells（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；compared with pcDNACASC7+miR-NC group，2）P＜0.05.

Groups OD490 nm Apoptosis rate（%）2.42±0.32 2.60±0.41 29.15±3.771）27.85±3.39 6.04±0.742）317.275＜0.001 Control pcDNA pcDNA-CASC7 pcDNA-CASC7+miR-NC pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p F P 0.61±0.05 0.63±0.06 0.35±0.051）0.32±0.03 0.56±0.042）88.500＜0.001

圖3 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡Fig.3 Flow cytometry detection of apoptosis in each group

2.5 CASC7負調(diào)控miR-181a-2-3p對細胞遷移和侵襲的影響 與pcDNA 組比較，pcDNA-CASC7 組細胞 遷 移 和 侵 襲 數(shù) 降 低（P＜0.05）。 與 pcDNACASC7+miR-NC 組比較，pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p 組細胞遷移和侵襲數(shù)升高（P＜0.05）。對照組與pcDNA 組比較及pcDNA-CASC7 組與pcDNACASC7+miR-NC組比較細胞遷移和侵襲數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4和表6。

表6 各組細胞遷移和侵襲數(shù)（，n=9）Tab.6 Number of cell migration and invasion in each group（，n=9）

表6 各組細胞遷移和侵襲數(shù)（，n=9）Tab.6 Number of cell migration and invasion in each group（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；compared with pcDNACASC7+miR-NC group，2）P＜0.05.

Number of invasion cells 84.89±6.69 84.44±5.79 36.56±2.911）34.33±2.67 78.44±3.242）290.545＜0.001 Groups Control pcDNA pcDNA-CASC7 pcDNA-CASC7+miR-NC pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p F P Number of migrating cells 110.78±7.57 113.44±6.11 58.44±5.041）58.11±4.15 97.67±6.222）193.501＜0.001

圖4 Transwell檢測各組細胞遷移和侵襲（×200）Fig.4 Transwell detects cell migration and invasion in each group（×200）

2.6 CASC7 負調(diào)控 miR-181a-2-3p 對細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達的影響 與pcDNA 組比較，pcDNA-CASC7 組細胞中 CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋白水平降低（P＜0.05），cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05）。與pcDNA-CASC7+miRNC 組比較，pcDNA-CASC7+miR-181a-2-3p組細胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平升高（P＜0.05），cleaved-caspase-3 蛋白水平降低（P＜0.05）。對照組與 pcDNA 組及 pcDNA-CASC7 組與 pcDNA-CASC7+miR-NC 組比較細胞中CyclinD1、cleaved-caspases-3、MMP-2和MMP-9蛋白水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組細胞中 CyclinD1、cleaved-caspase-3、MMP-2 和MMP-9蛋白表達水平Fig.5 Protein expression levels of CyclinD1，cleaved-cas?pase-3，MMP-2 and MMP-9 in each group of cells

3 討論

作為近年來新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，CASC7在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究顯示，CASC7 低表達的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預后不良，過表達CASC7 可抑制Wnt/β-catenin 信號通路降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖能力并誘導細胞凋亡［8］；上調(diào)CASC7可靶向下調(diào)miR-10a抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖［9］。但目前，CASC7 對NSCLC 發(fā)生發(fā)展的影響機制還未知。

本研究顯示，NSCLC 癌組織中CASC7 的表達明顯低于癌旁組織，過表達CASC7 抑制了A549 細胞增殖、遷移和侵襲，且誘導了A549 細胞凋亡，說明CASC7 在NSCLC 的發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮抑癌基因作用，可作為NSCLC 治療的分子靶點。CyclinD1 參與調(diào)控細胞周期，其表達增加促進細胞增殖。Caspase家族是一組天門冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡途徑中起核心作用［10-11］。caspase-3是Caspase家族的關(guān)鍵調(diào)控分子，其活化后可直接切割細胞內(nèi)蛋白底物，誘導細胞凋亡［12］。MMP-2 和MMP-9 可降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲［13-14］。本研究顯示，過表達CASC7 降低了A549細胞中 CyclinD1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表達，而促進了化的caspase-3 蛋白表達，與相關(guān)報道結(jié)果一致，進一步表明過表達CASC7 抑制了A549 細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡［15-16］。

生物信息學在線軟件預測顯示，CASC7 可能靶向結(jié)合miR-181a-2-3p。本研究利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了CASC7 可與miR-181a-2-3p 靶向結(jié)合，且過表達CASC7 抑制了A549 細胞中miR-181a-2-3p的表達，進一步說明了CASC7靶向負調(diào)空miR-181a-2-3p 表達，這與 NSCLC 組織中 CASC7 與miR-181a-2-3p 的表達呈負相關(guān)一致。有報道稱，甲狀腺癌中miR-181a-2-3p 的表達升高，且miR-181a-2-3p高表達的患者預后不佳［17］。本研究還顯示，下調(diào)miR-181a-2-3p 表達逆轉(zhuǎn)了過表達 CASC7 對 A549 細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及凋亡促進作用，提示過表達CASC7 通過靶向負調(diào)控miR-181a-2-3p來抑制A549 細胞增殖、遷移和侵襲及誘導細胞凋亡。

綜上所述，NSCLC 組織中CASC7 表達降低，而miR-181a-2-3p 表達升高，兩者呈負相關(guān)；過表達CASC7 可靶向負調(diào)控miR-181a-2-3p 有效降低NSCLC 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，且促進細胞凋亡，CASC7/miR-181a-2-3p 軸可能為 NSCLC 的靶向分子治療提供了新靶點。本研究尚存在不足之處，接下來將進一步探究miR-181a-2-3p的下游靶基因和信號通路在NSCLC 發(fā)生發(fā)展中的作用及通過動物實驗在體內(nèi)驗證CASC7/miR-181a-2-3p 軸對NSCLC發(fā)生發(fā)展的影響。