張海波 焦 潔 李平平 宋志明 （河南大學第一附屬醫(yī)院，開封 475001）

冠狀動脈硬化性心臟?。ü谛牟。┦峭{人類健康的主要疾病。尤其隨著人口老齡化及城鎮(zhèn)化進程的加速，心血管病危險因素明顯增多，導(dǎo)致冠心病的發(fā)病人數(shù)持續(xù)增加。據(jù)最新發(fā)布的《中國心血管健康與疾病報告2019》顯示，推算心血管病現(xiàn)患人數(shù)約3.3 億，其中冠心病患者1 100 萬，給患者家庭、社會以及國家社保帶來了巨大的經(jīng)濟負擔［1］。內(nèi)皮功能障礙為心血管疾病的始動環(huán)節(jié)，早于動脈粥樣硬化形態(tài)學改變［2］。因此，尋找到針對內(nèi)皮細胞損傷的干預(yù)措施將成為治療動脈粥樣硬化相關(guān)性疾病的關(guān)鍵點。

既往研究證實一氧化氮（NO）系統(tǒng)參與了內(nèi)皮細胞損傷的發(fā)病，而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)硫化氫（H2S）對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用［3］。本研究旨在觀察外源性H2S對H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷的保護作用及其對NO系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 H2O2、MTT 和 NaHS（161527）購自 Sigma-Aldrich；Ⅰ型膠原酶購自Invitrogen；無血清培養(yǎng)基（SFM）、M199 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自Gibco；內(nèi)皮細胞生長因子（ECGS）購自 BD 公司；抗eNOS 抗體（9586）購自Cell Signaling Technology；抗GAPDH 抗體（10494-1-AP）購自Proteintech；小鼠Ⅱ抗（BM3895）及兔Ⅱ抗（BM3894）購自武漢博士德；細胞裂解液和蛋白定量試劑盒（BCA）購自南京凱基；預(yù)染蛋白 marker 購自 Fermentas；NO 測試試劑盒購自南京建成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 本研究采用原代人臍靜脈內(nèi)皮細 胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），其分離培養(yǎng)依據(jù)既往報道進行［3］。研究所用細胞為1~3代。本研究經(jīng)河南大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會討論并批準，符合Helsinki原則。

1.2.2 流式細胞檢測 收取第1代內(nèi)皮細胞，交由河南大學第一附屬醫(yī)院實驗室檢測細胞表面標志物CD31。

1.2.3 內(nèi)皮細胞損傷模型的建立 取對數(shù)生長的細胞按1×104個/孔分別接種于6 孔培養(yǎng)板中，待細胞生長至60%~70%時，換用含不同濃度H2O（20、20、40、80、160 μmo/lL）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后分別進行細胞形態(tài)和活力檢測。

1.2.4 H2S 對H2O2損傷細胞的干預(yù) 取對數(shù)生長的細胞按1×104個/孔分別接種于6 孔培養(yǎng)板中，待細胞生長至60%~70%時，換用含2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基饑餓細胞8 h，加入含不同濃度NaHS（0、50、100、200、500 μmo/lL）的DMEM 培養(yǎng)基作用1 h，添加80 μmo/lL H2O2繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.5 細胞活力的測定 內(nèi)皮細胞接種于96孔板中，4 000 個/孔，24 h 后根據(jù)實驗需要進行不同處理，每個處理因素設(shè)5個復(fù)孔。處理結(jié)束后，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT 培養(yǎng)4 h；去除培養(yǎng)基后，每孔加入150 μl DMSO，用錫箔紙遮蓋后置于搖床上15 min 充分搖勻。最后在490 nm 處，用酶標儀讀取各孔的吸光度值（A490）。

1.2.6 免疫蛋白印跡

1.2.6.1 蛋白提取和定量 細胞經(jīng)過處理后，按照試劑盒說明進行蛋白的提取，大致過程如下：每孔加50 μl 細胞裂解液，冰上孵育10～20 min，細胞裂解液移入1.5 ml EP 管，13 200/rmin 4℃ 離心15 min；吸取上清，分裝保存于-80℃冰箱備用。具體定量過程詳見南京凱基說明書（BCA法）。

1.2.6.2 Western blot 經(jīng)BCA 定量，取等量蛋白進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入抗體，4℃過夜孵育；棄去Ⅰ抗，TBST 洗3 次，加入小鼠或兔Ⅱ抗，室溫孵育1 h，TBST 洗 3 次 ECL 曝光；Quantity One 軟件分析蛋白條帶。

1.2.7 NO 含量測定 采用試劑盒測定細胞培養(yǎng)液中NO含量，操作過程嚴格按照說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，定量資料用表示，均數(shù)比較采用方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HUVECs 鑒定 采用流式細胞儀檢測，第1 代內(nèi)皮細胞CD31 抗原陽性率99.9%，符合內(nèi)皮細胞特性（圖1）。

圖1 流式細胞術(shù)檢測細胞表面CD31Fig.1 Detection of CD31 on surfaces of cells by flow cy?tometry

2.2 H2O2損傷模型的建立 內(nèi)皮細胞生長至60%~70%時，加入不同濃度的H2O2培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含20、40、80、160 μmol/L H2O2培養(yǎng)基加入后細胞生長緩慢，且隨濃度增加，貼壁細胞數(shù)明顯減少（圖 2）。MTT 結(jié)果提示 80 和 160 μmol/L H2O2處理組細胞活力分別減低至（49.7±11.5）%和（18.9±9.4）%，較正常對照組差異有統(tǒng)計學意義（圖3）。以80 μmol/L H2O2作用24 h對總體細胞數(shù)影響較小且能有效誘導(dǎo)細胞損傷，故作為損傷模型濃度繼續(xù)應(yīng)用。

圖2 不同濃度H2O2處理后HUVECs細胞形態(tài)（×100）Fig.2 Representative cell morphology of HUVECs after treatment with various concentrations of H2O2（×100）

圖3 不同濃度H2O2處理對HUVECs細胞活力的影響Fig.3 Cell viability of HUVECs treated with various con?centrations of H2O2

2.3 不同濃度NaHS 對細胞活力的影響 內(nèi)皮細胞接種于 96 孔板，生長 24 h 后，分別給予 50、100、200、500 μmo/lL NaHS，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后對細胞進行 MTT 活性檢測。500 μmo/lL NaHS 組細胞活力為（80.3±4.6）%，與對照組存在統(tǒng)計學差異。而其他濃度對內(nèi)皮細胞的生長均無明顯影響（圖4）。為避免NaHS 自身損傷作用，后續(xù)實驗選用50、100、200 μmo/lL 3個濃度對細胞進行干預(yù)。

圖4 不同濃度NaHS處理對HUVECs細胞活力的影響Fig.4 Effect of different concentrations of NaHS on cell viability

2.4 NaHS 對H2O2損傷細胞活力的影響 內(nèi)皮細胞接種于 96 孔板，生長 24 h 后，分別給予 50、100、200 μmo/lL NaHS，共同孵育1 h 后，加入80 μmo/lL H2O2，培養(yǎng) 24 h。100 μmo/lL 和 200 μmo/lL NaHS組內(nèi)皮細胞活力分別為（77.3±8.2）%和（70.6±7.4）%，與H2O2組比較差異均有統(tǒng)計學意義（圖5）。

圖5 NaHS對H2O2損傷HUVECs細胞活力的影響Fig.5 Effect of NaHS on cell viability in H2O2-injured HU?VECs

綜合以上NaHS 對內(nèi)皮細胞活力的影響結(jié)果，100 μmo/lL NaHS 為研究外源性H2S 對內(nèi)皮細胞損傷作用的最優(yōu)濃度。后續(xù)研究將以100 μmo/lL NaHS探討其對內(nèi)皮損傷的保護作用。

2.5 NaHS 對H2O2損傷的內(nèi)皮細胞NO 系統(tǒng)的影響 通過Western blot 檢測蛋白發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，H2O2組細胞eNOS 蛋白的表達水平和NO 的濃度均明顯降低。與H2O2組相比，NaHS 組細胞eNOS 蛋白的表達和NO的濃度均明顯升高（圖6）。

圖6 NaHS 對 H2O2 損傷 HUVECs 細胞內(nèi) eNOS 表達及 NO濃度的影響Fig.6 Effect of NaHS on eNOS expression and NO con?centration in HUVECs injured by H2O2

3 討論

本課題研究發(fā)現(xiàn)，80 μmol/L H2O2能夠誘導(dǎo)原代人內(nèi)皮細胞損傷模型；NaHS 部分拮抗H2O2對NO系統(tǒng)的影響，改善內(nèi)皮細胞損傷。

內(nèi)皮細胞損傷模型是闡明內(nèi)皮損傷機制的重要工具［4］。目前，用于損傷模型制備的內(nèi)皮細胞類型有原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞和內(nèi)皮細胞株。原代內(nèi)皮細胞，需分離培養(yǎng)且傳代次數(shù)有限。內(nèi)皮細胞株大多為商品化的腫瘤細胞株，如EA. hy926 和HUVEC-12。引起內(nèi)皮細胞損傷的因素有多種，如H2O2、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）和細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）［5-7］。應(yīng)用原代細胞誘導(dǎo)的疾病模型無論從臨床上還是生理上都更接近人類疾病，鑒于此本研究選擇了原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞作為研究對象。同時H2O2來源方便、價格低廉、損傷效果明顯，其誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷模型為目前廣泛應(yīng)用的研究內(nèi)皮損傷的工具藥物［4］。H2O2在過氧化條件下可分解成氧自由基，通過對生物膜中不飽和脂肪酸的過氧化反應(yīng)引起細胞損傷，是內(nèi)皮細胞損傷的理想模型［8］。綜合以上因素，本研究選用了H2O2誘導(dǎo)的原代HUVECs損傷模型。

H2S 是繼 CO 和 NO 之后在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第 3 種內(nèi)源性氣體信號分子，在心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［9］。在哺乳動物細胞中，H2S由L-半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶（CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）的作用下合成，而在血管系統(tǒng)中其合成主要受CSE 調(diào)控。在高血壓患者中，CSE 的表達及其合成H2S 的活性明顯減低，導(dǎo)致了微血管內(nèi)皮功能障礙［10］。XIAO 等［11］研究者發(fā)現(xiàn)給予 20 周 NaHS 處理能夠明顯改善高血壓大鼠的內(nèi)皮功能。此外，有研究提示H2S 通過增加 NO 生物利用度改善內(nèi)皮細胞功能［12］。在本研究中，H2S 增強了H2O2損傷的內(nèi)皮細胞的活力，增加了eNOS 蛋白表達，并最終增加了NO 的合成。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果保持一致。

本研究結(jié)果提示，H2S 改善H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷，這可能與其增加eNOS 表達和NO 合成有關(guān)。后續(xù)的研究將進一步闡述H2S 對于eNOS/NO具體的調(diào)控機制，以豐富和深化H2S 在內(nèi)皮細胞功能乃至心血管系統(tǒng)中的作用和靶點。