宋志姣，周藝垠，郭燕，李德煥，曹瓊卉，李曉嬌，李悅

（保山學院資源環(huán)境學院，云南保山678000）

懸鉤子屬（Rubus）植物的果實，是當今風靡全球的“第三代水果”，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）向全球推薦的健康小漿果；因其獨特的藥用、食用價值深受消費者青睞[1-3]。我國懸鉤子資源豐富，有209種，其中139種為特有種[4]。我國懸鉤子產(chǎn)業(yè)發(fā)展起步晚、產(chǎn)品種類和數(shù)量少、主栽品種來自國外、國內良好的懸鉤子屬種質資源尚未得到充分的利用[5-6]。紅泡刺藤（Rubus niveus）是我國野生樹莓資源中極具開發(fā)利用價值的一個種[7-8]。

紅泡刺藤廣泛分布于我國西南各省海拔500 m～2 800 m區(qū)域[9]。因果實成熟期集中、機械化采收難度高、采摘期與雨季重疊等原因，使得紅泡刺藤運輸難度大；果實嬌嫩、果皮極薄、呼吸速率高等原因，使得紅泡刺藤果實難以長期保鮮[10]。釀造果酒作為重要的深加工工藝之一，不僅能一定程度上緩解紅泡刺藤運輸和保鮮的困難，解決季節(jié)性成熟導致的浪費；而且填補了這個領域研究的空白，增加紅泡刺藤的附加值，創(chuàng)造良好的經(jīng)濟效益。目前，紅泡刺藤果酒的研究尚未展開，但其同屬植物紅樹莓的研究表明，紅樹莓果酒中保留了果實中大部分生物活性物質，其中樹莓酮、總酚、花色苷、原花青素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等含量較高，且具有抗氧化、抗炎和體外降血糖等功效[11-14]。

本研究借鑒同屬植物紅樹莓的研究方法，以紅泡刺藤果實為原料，在前期預試驗的基礎上探討初始pH值、主發(fā)酵溫度、酵母接種量、初始糖度對紅泡刺藤果酒的影響，以單因素和正交試驗探索果酒發(fā)酵工藝；對最優(yōu)工藝果酒的抗氧化活性和揮發(fā)性風味物質進行分析，以期能為懸鉤子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和生產(chǎn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生紅泡刺藤果實：摘自云南省保山市隆陽區(qū)附近山林；葡萄酒-果酒專用酵母（Saccharomyces cerevisiae）、果膠酶（40 000 U/g）、檸檬酸：帝伯仕酵母有限公司；亞硫酸氫鈉、無水乙醇、酚酞、磷酸二氫鈉、抗壞血酸：天津市風船化學試劑科技有限公司；葡萄糖標準品：天津市光復精細化工研究所；氫氧化鈉：廣州新港化工廠；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀：國藥集團化學試劑有限公司；苯酚：浙江杭州雙林化工試劑廠；硫酸：浙江臨平化工試劑廠；磷酸氫二鈉：德國Merck公司；硫酸亞鐵：北京化工廠；鄰二氮菲：上海試劑三廠；以上試劑均為分析純。白砂糖、礦泉水、食用堿：市售。

1.2 儀器與設備

UV-2600紫外-可見分光光度計：日本島津公司；GXZ-15恒溫培養(yǎng)箱：寧波東南儀器有限公司；JYLC012榨汁機：九陽股份有限公司；BCD 576 WDUP冰箱：海爾集團公司；HH-442664恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；SW CJ ZD無菌接種臺：蘇州凈化設備有限公司；TDL 5A離心機：上海安亭科學儀器有限公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；336號酒精計：上海華辰醫(yī)用儀表有限公司；0%～32% Brix手持折光儀：邦西儀器科技（上海）有限公司；頂空固相微萃取裝置（含SPME手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭）：美國Supelco公司；TRACE1300+ISQ GC-MS聯(lián)用儀：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

紅泡刺藤果實→挑選原料→-20℃冷凍→20℃～25℃室溫解凍→榨汁→酶解→調整成分→滅菌→接種→主發(fā)酵→后發(fā)酵→澄清→成品

操作要點：選擇無病、無蟲、無害、成熟度高的新鮮紅泡刺藤果實冷凍備用；試驗前12 h置于4℃冰箱解凍，然后用榨汁機將紅泡刺藤果實榨汁，按果漿總質量的0.02%加入果膠酶，攪拌均勻后20℃～25℃室溫酶解3 h；調整成分：添加160 mg/L亞硫酸氫鈉[15]后，根據(jù)試驗需要用濃白砂糖水調整紅泡刺藤果汁的初始糖度，用檸檬酸、食用堿水溶液調整紅泡刺藤果汁的初始pH值。滅菌：75℃水浴鍋中恒溫滅菌15 min[15]。酵母活化：將干酵母溶于10倍質量分數(shù)為5%的蔗糖水溶液中，32℃活化30 min。主發(fā)酵：滅菌冷卻后，于無菌接種臺內將活化好的酵母接種到紅泡刺藤果漿中，在試驗溫度下主發(fā)酵8 d[13]。后發(fā)酵：將主發(fā)酵后的果酒轉移至28℃培養(yǎng)箱中，恒溫發(fā)酵30 d。澄清：離心機3 500 r/min離心3 min，上清液即為紅泡刺藤果酒。

1.3.2 單因素試驗

變量為擬研究的單因素，固定其它因素進行控制：初始pH值為3.3、主發(fā)酵溫度為26℃、酵母接種量為0.6%、初始糖度為27%、主發(fā)酵時間為8 d，后發(fā)酵溫度28℃后，發(fā)酵時間30 d。設置4個考察因素：初始 pH 值（2.5、2.9、3.3、3.7、4.1）、主發(fā)酵溫度（18、22、26、30、34℃）、酵母接種量（0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）、初始糖度（23%、25%、27%、29%、31%）。在前期預試驗的基礎上，以發(fā)酵果酒的酒精度為主要考察指標，輔以總酸、總糖、可溶性固形物、pH值等指標判斷發(fā)酵進程，并對優(yōu)化后的果酒進行感官評價。

1.3.3 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝

結合單因素試驗結果，以初始pH值、主發(fā)酵溫度、酵母接種量、初始糖度4個因素建立L9（34）正交試驗，對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，以感官評分為考察指標，同時關注發(fā)酵果酒的總酸、酒精度、可溶性固形物、pH值。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal expriment

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 理化指標測定

pH值的測定采用酸度計法[16]；酒精度的測定采用酒精計[16]；可溶性固形物的測定采用手持糖度計測定法[17]；總酸（以酒石酸計）的測定采用酸堿滴定法[18]?？偺堑臏y定采用苯酚-硫酸法[16]以葡萄糖為標準品，繪制一元線性回歸方程：y=0.849 6x＋0.002 9，R2＝0.999 8。

1.3.4.2 感官評價

由10位選修過《感官評價》課程的食品質量與安全專業(yè)學生（5男5女），組成的評審小組，從色澤、透明、香氣、滋味等方面參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的感官評定方法對理論和實際最優(yōu)發(fā)酵工藝果酒進行評分[18]，品評杯為統(tǒng)一的玻璃酒杯，評分標準見表2，最終得分以平均分±標準差記。

表2 感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards

1.3.4.3 抗氧化能力測定

DPPH自由基清除能力測定，參考文獻[19]的方法進行；羥基自由基清除能力測定，參考文獻[20]的方法進行。

1.3.4.4 揮發(fā)性風味物質分析

果酒揮發(fā)性風味物質檢測：由昆明理工大學分析測試中心測定，進樣程序和參數(shù)設置參考曾朝珍等[21]的研究。檢測結果經(jīng)計算機檢索，與美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）譜庫相匹配，并分析可能屬于紅泡刺藤果酒的風味物質，取匹配度≥75%的組分；峰面積歸一化法計算各揮發(fā)性風味物質的相對百分含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

發(fā)酵和測量試驗均為3次重復，所有用Excel2016繪圖制表，并以SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 初始pH值對紅泡刺藤果酒發(fā)酵影響

初始pH值對紅泡刺藤果酒發(fā)酵效果的影響見圖1。

圖1 初始pH值對紅泡刺藤果酒發(fā)酵效果的影響Fig.1 Effect of initial pH value on fermentation of R.niveus fruit wine

由圖1可知，隨著初始pH值的逐漸增加，果酒總酸迅速下降；而酒精度呈先上升后下降的趨勢，當初始pH值為3.7時，酒精度最高，為9.33%vol；可溶性固形物呈平緩下降；總糖先上升，初始pH值高于2.9后緩慢下降；發(fā)酵后果酒的pH值隨著初始pH值的增加而增加。發(fā)酵液初始pH值會影響果酒的發(fā)酵進程，從而影響酒精度[22]。當發(fā)酵初始pH值過低時，不僅抑制了酵母菌的生長，導致發(fā)酵不徹底，還會阻礙發(fā)酵液中的酸性物質分解，從而造成揮發(fā)酸的含量增加[23]，一定程度上影響紅泡刺藤果酒的口感。當發(fā)酵液的初始pH值過高時，可能導致發(fā)酵體系中的雜菌生長，雜菌將糖等營養(yǎng)物質分解產(chǎn)生醋酸物質[24]，給果酒的風味帶來不良影響。綜合考慮最佳初始pH值為3.7。

2.1.2 主發(fā)酵溫度對紅泡刺藤果酒發(fā)酵影響

發(fā)酵溫度對紅泡刺藤果酒發(fā)酵效果的影響見圖2。

圖2 主發(fā)酵溫度對紅泡刺藤果酒發(fā)酵效果的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on fermentation effect of R.niveus fruit wine

隨著發(fā)酵溫度的不斷升高，果酒的總酸先逐漸下降后緩慢上升；酒精度逐漸升高后下降，在30℃時酒精度最高為10.21%vol。不同主發(fā)酵溫度下產(chǎn)生的果酒其pH值變化不大。過低的主發(fā)酵溫度會抑制酵母的代謝，在一定程度上降低酵母對糖的利用率，不利于果酒發(fā)酵，可能會導致紅泡刺藤果酒發(fā)酵不徹底。當發(fā)酵溫度過高時，發(fā)酵反應劇烈，但酵母衰老速度快，果酒風味物質揮發(fā)明顯，高溫條件下使腐敗微生物快速生長發(fā)育，可能導致紅泡刺藤果酒品質下降[25]。綜合考慮最佳發(fā)酵溫度為30℃。

2.1.3 酵母接種量對紅泡刺藤果酒發(fā)酵影響

酵母接種量對紅泡刺藤果酒發(fā)酵效果的影響見圖3。

圖3 酵母接種量對紅泡刺藤果酒發(fā)酵效果的影響Fig.3 Effect of yeast inoculation on fermentation of R.niveus fruit wine

由圖3可知，隨著發(fā)酵液中酵母接種量的逐漸增加，紅泡刺藤果酒中的酒精度先升高隨后降低，當酵母接種量達到0.5%時，酒精度最高，為9.47%vol；總酸先升后降，當酵母接種量達到0.6%時，總酸含量最高為14.20 g/L；可溶性固形物含量呈先上升后下降的趨勢，當酵母接種量大于0.7%時，可溶性固形物含量下降；總糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在酵母接種量為0.5%時，總糖含量最高；發(fā)酵后果酒的pH值呈緩慢上升，在酵母接種量為0.8%時達到最大值。酵母接種量是影響果酒發(fā)酵的重要因素之一，直接影響到發(fā)酵過程的生物轉化程度和酒精生成量[26]。接種量較少時，生物質利用速率慢，可能導致發(fā)酵周期的延長；接種量過多時，紅泡刺藤果酒發(fā)酵進程受到酵母殘體的影響。因此，最佳酵母接種量為0.5%。

2.1.4 初始糖度對紅泡刺藤果酒發(fā)酵影響

初始糖度對紅泡刺藤果酒發(fā)酵效果的影響見圖4。

圖4 初始糖度對紅泡刺藤果酒發(fā)酵效果的影響Fig.4 Effect of initial sugar concentration on fermentation effect of R.niveus fruit wine

由圖4可知，隨著初始糖度的增加，紅泡刺藤果酒中的總酸先增加后下降，當發(fā)酵液初始糖度為25%時，總酸最高，為14.38 g/L；酒精度和可溶性固形物呈先平穩(wěn)增加后緩慢下降的趨勢，在初始糖度為29%時均達到最高；總糖先下降后升高，發(fā)酵液初始糖度為31%時，果酒總糖最高，為5.95 g/L。果汁中的糖分在酵母菌的作用下分解產(chǎn)生酒精和CO2等物質，適宜的初始糖度能夠有效促進酵母代謝和繁殖。因此在一定范圍內，果酒酒精度隨著初始糖度增加而增加，當初始糖度大于一定范圍時，滲透壓的變化會使酵母菌的代謝和繁殖受到抑制，甚至導致死亡[26]，同時過高的初始糖度還會增加成本。當初始糖度達到29%時，果酒酒精度最高，為9.96%vol。

2.2 正交試驗

基于單因素試驗結果，設計L9（34）正交試驗，結果見表3。

表3 發(fā)酵正交試驗結果Table 3 Fermentation orthogonal experiment results

影響紅泡刺藤果酒發(fā)酵的4個因素中，按各因素對酒精度的影響，從大到小依次為B＞D＞C＞A，即主發(fā)酵溫度＞初始糖度＞酵母接種量＞初始pH值。通過k值比較可知組合A3B2C2D2最優(yōu)，正交試驗結果則表明試驗2組為最佳發(fā)酵工藝組合A1B2C2D2，需進一步驗證。驗證試驗結果見表4。

表4 驗證試驗結果Table 4 The result of validation experiment

經(jīng)驗證，組合A1B2C2D2的酒精度與感官評分均大于組合A3B2C2D2，即初始pH值為3.3，主發(fā)酵溫度為30℃，酵母接種量為0.5%，初始糖度為29%為最適工藝。在最適發(fā)酵工藝下，所得紅泡刺藤果酒酒精度為12.79%vol，總酸為 6.08 g/L，可溶性固形物為 3.89 °Bx，總糖為3.39 g/L，pH值為3.75。果酒色澤：鮮明、協(xié)調、有光澤、酒紅色；透明度：澄清透亮、無雜質和沉淀；香氣：具有純正果香與和諧酒香；滋味：酒體較豐滿、酸甜適當；感官評分為92.4分。

2.3 果酒抗氧化性分析

羥基自由基可通過加成、脫氫或電子轉移等方法與體內的多種分子發(fā)生反應，從而造成營養(yǎng)物質及細胞組織的氧化，可能導致細胞壞死或突變。通過比較稀釋后紅泡刺藤果酒的DPPH自由基的清除能力和羥基自由基清除能力，可以反映紅泡刺藤果酒抗氧化性的強弱[27]，具體結果見圖5。

圖5 DPPH自由基和羥基自由基清除率比較Fig.5 Comparison of DPPH·and hydroxyl radical scavenging rate

由圖5可知，稀釋后20倍的紅泡刺藤果酒的DPPH自由基和羥基自由基清除率顯著高于5 mg/L的維生素C溶液。

2.4 揮發(fā)性風味物質分析

果酒中的揮發(fā)風味物質，既受果實本身揮發(fā)性風味物質的影響，又與發(fā)酵過程中微生物的代謝密切相關[28]。在不同的發(fā)酵工藝下，果酒的揮發(fā)性風味物質不同[29]。感官最優(yōu)的紅泡刺藤果酒的揮發(fā)性物質分析結果見表5。

表5 紅泡刺藤果酒中揮發(fā)性物質分析Table 5 Analysis of volatile flavor components in R.niveus fruit wine

由表5可知，紅泡刺藤果酒中檢測并鑒定出27種揮發(fā)性成分，其中包含醇類物質6種，總相對含量為51.63%；酯類物質7種，總相對含量為21.80%；酸類物質2種，相對含量為6.96%；酸酐類物質2種，相對含量為2.07%；酮類物質5種，相對含量為11.46%；醛類物質4種，相對含量為5.83%，醚類物質1種，相對含量為0.15%。相對含量較大揮發(fā)性風味物質為醇類、酯類和酮類物質（占總揮發(fā)性物質的84.89%），是構成紅泡刺藤果酒揮發(fā)性風味成分的主要基礎物質。

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗優(yōu)化紅泡刺藤果酒發(fā)酵工藝，考察初始pH值、主發(fā)酵溫度、酵母接種量、初始糖度4個因素對果酒品質和感官評分的影響。初步探索得到紅泡刺藤果酒的最適發(fā)酵條件：初始pH3.3，主發(fā)酵溫度30℃，酵母接種量0.5%，初始糖度29%，所得紅泡刺藤果酒酒精度為12.79%vol，總酸為 6.08 g/L，可溶性固形物為 3.89 °Bx，總糖為3.39 g/L，pH值為3.75。此時果酒色澤鮮明、協(xié)調、有光澤、酒紅色；透明度澄清透亮、無雜質和沉淀；具有純正果香與和諧酒香；酒體較豐滿，酸甜適當；感官評分92.4分。抗氧化活性方面，稀釋20倍后的紅泡刺藤果酒對DPPH自由基和羥基自由基的清除率均顯著高于5 mg/L維生素C溶液。揮發(fā)性風味物質分析表明，紅泡刺藤果酒中的醇類、酯類和酮類物質為其揮發(fā)性風味物質的主要基礎物質，占總揮發(fā)性風味物質的84.89%。研究填補了紅泡刺藤果酒發(fā)酵工藝上的研究空白，為高值化綜合加工利用紅泡刺藤資源提供了新的途徑。