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        青石止癢軟膏對特應(yīng)性皮炎小鼠信號素3A/神經(jīng)生長因子及相關(guān)信號分子的影響

        2021-11-25 10:57:10鄧宇童蔡玲玲任雪雯李雪胡博馮蕙裳杭小涵趙欣楠于心薈李元文
        環(huán)球中醫(yī)藥 2021年11期
        關(guān)鍵詞:青石軟膏皮損

        鄧宇童 蔡玲玲 任雪雯 李雪 胡博 馮蕙裳 杭小涵 趙欣楠 于心薈 李元文

        特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種以濕疹樣皮疹、瘙癢、局部干燥等癥狀為特征的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病[1]。近年來,AD在中國的發(fā)病率增長迅速。目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),新生的表皮神經(jīng)纖維與AD的發(fā)病關(guān)系密切[2-4]。表皮神經(jīng)纖維的生長受到神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)和信號素3A(semaphorin3A,Sema3A)雙向調(diào)控,同時還有其他相關(guān)因子共同參與。當(dāng)AD發(fā)病時皮膚屏障被破壞,表皮新生神經(jīng)纖維密度增加,而通過調(diào)控Sema3A/NGF及相關(guān)分子水平,可以減少AD病患皮損部位新生表皮神經(jīng)纖維的密度,減輕皮膚炎癥,改善AD臨床癥狀[5]。本團隊通過前期臨床觀察發(fā)現(xiàn),應(yīng)用青石止癢軟膏治療濕疹[6-8]、銀屑病[9-10]、神經(jīng)性皮炎[11-14]及AD等炎癥性皮膚病療效顯著,相關(guān)作用機制研究有待完善。故本研究以不同濃度青石止癢軟膏干預(yù)2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorbenzene,DNCB)誘導(dǎo)的小鼠AD模型,觀察皮損癥狀評分、組織病理學(xué)改變、Sema3A/NGF及其相關(guān)信號分子表達的情況,從分子水平探討青石止癢軟膏治療AD的作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物

        SPF級雌性BALB/C小鼠56只,8周齡,購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,動物質(zhì)量合格證號:110324201103138756;實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCKX(京)2019-0010。于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院SPF級動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

        1.2 實驗藥物、主要試劑及儀器

        陽性對照試劑為丁酸氫化可的松(尤卓爾,天津藥業(yè)集團有限公司,批號:20061033);陰性對照試劑為青石止癢軟膏所用基質(zhì)軟膏,由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院皮膚科外治室制備,將橄欖油、蜂蠟按照10∶1配置而成;不同濃度青石止癢軟膏由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院皮膚科外治室制備,將青黛20 g、煅爐甘石60 g、煅石膏30 g、苦參30 g、黃柏30 g加8倍量70%乙醇,加熱回流提取,離心過濾,合并提取液,減壓回收乙醇并濃縮為1g生藥/mL提取液濃度的浸膏,冰片10 g趁熱加入濃縮液中混合均勻,悶潤30分鐘,過濾,蒸干后加入基質(zhì)軟膏,配制含藥量不同的青石止癢高濃度軟膏(0.36 g/g)、中濃度軟膏(0.18 g/g)、低濃度軟膏(0.09 g/g)。

        Trizol(美國Invitrogen公司,批號:326411);氯仿、異丙醇(南京化學(xué)試劑有限公司,批號:20180907、2020120)、DEPC(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號:20210125);cDNA第一鏈合成試劑盒、One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II(日本TaKaRa公司,批號:AJE1627A、AJE1687A);rabbit Anti-GAPDH、羊抗兔IgG-HRP(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號:20210121、20210115);Rabbit Anti-Semaphorin 3A(美國abcam,批號:GR295523-1);Rabbit Anti-PLPAK1(武漢三鷹,批號:00069245);NGF、IL-31 ELISA試劑盒(美國Raybiotech,批號:409210572、521211755);NT-4 ELISA試劑盒(美國RbD Systems,批號:0730210209);H.E染色試劑盒、中性樹膠封片劑(北京中科萬邦生物科技有限公司,批號:RY-0002、FP-0001);丙酮(北京化工廠,批號:20190801);DNCB(天津光復(fù)精細化工研究所);硫化鈉(福晨化學(xué),批號:20190827)。

        ST16R高速冷凍離心機(美國 Thermo Sorvall);Spectramac M3多功能酶標(biāo)儀(美國 MD);XW-80A渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);熒光定量PCR循環(huán)儀、普通梯度PCR儀(美國ABI);UV-2450紫外光度儀(日本 SHIMADZU);電泳儀(美國 Bio-rad);THZ-312臺式恒溫振蕩器(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);G:BOXChemiXR5凝膠成像系統(tǒng)(英國 SYNGENE);JT-12S脫水機、JB-P7包埋機(武漢俊杰電子有限公司)。

        1.3 造模及分組

        將56只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,全部予脫毛處理,脫毛方法為:用電推器及8%硫化鈉溶液對小鼠進行實驗部位脫毛,于腹部去毛,面積約為1 cm×2 cm,背部去毛面積約2 cm×3 cm。脫毛后,以隨機數(shù)字表法將56只小鼠隨機分為空白組8只,實驗組48只。結(jié)合參考文獻[15]及團隊相關(guān)實驗經(jīng)驗[16]以DNCB丙酮溶液對實驗組小鼠進行特應(yīng)性皮炎造模,造模方法略有調(diào)整,具體方法為:造模第一天,于腹部脫毛處涂7%的DNCB丙酮溶液致敏,3天后于同一位置進行第二次致敏;造模第8天,于背部涂0.5%的DNCB丙酮溶液進行激發(fā),后每5天激發(fā)一次,連續(xù)激發(fā)6次。

        造模成功后,再次以隨機數(shù)字表法將實驗組48只特應(yīng)性皮炎模型小鼠隨機分為模型組、陽性對照組、陰性對照組、青石止癢高濃度組、青石止癢中濃度組、青石止癢低濃度組,每組8只。

        1.4 干預(yù)方法

        造模完成后,各組均予常規(guī)喂養(yǎng)??瞻捉M、模型組不予任何干預(yù)措施;陽性對照組于背部皮損部位涂丁酸氫化可的松乳膏,每日2次;陰性對照組于背部皮損部位涂基質(zhì)軟膏每日2次;青石止癢高、中、低濃度組于背部皮損部位涂分組對應(yīng)濃度的青石止癢軟膏,每日2次。各組用藥參考指尖單位標(biāo)準(zhǔn),每次用藥按照1指尖單位/2 cm2藥量外用,連續(xù)用藥7天。用藥期間若小鼠毛發(fā)生長則用4%硫化鈉溶液外涂補充脫毛。

        1.5 皮損評分[17]

        觀察記錄除空白組外各組小鼠皮損部位皮損評分,參考臨床特應(yīng)性皮炎積分(scoring atopic dermatitis,SCORAD)指數(shù)標(biāo)準(zhǔn),在取材前,對皮損嚴重程度進行評分:包括紅斑、鱗屑、水腫/丘疹、表皮剝脫,分為無(0分)、輕(1分)、中(2分)、重(3分)4個等級,各癥狀分級之間可記半級分數(shù)即0.5分、1.5分、2.5分。特應(yīng)性皮炎總積分(表示小鼠AD嚴重程度)記為各項評分總和,區(qū)間為0~12分。

        1.6 取材

        藥物干預(yù)結(jié)束后1天,對小鼠予4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)腹腔注射進行麻醉,取實驗組背部造模部位皮膚及空白組同部位皮膚后予頸椎脫臼處死。將2 cm×1 cm大小皮膚組織于4%多聚甲醛中固定;將1 cm×1 cm大小皮膚組織3塊,分裝后于液氮速凍,置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

        1.7 皮損病理切片觀察

        取固定于4%多聚甲醛中的皮膚組織,進行常規(guī)脫水、包埋、切片等操作后,予HE染色。用全自動數(shù)字病理切片掃描儀對病理切片進行掃描,以K-Viewer軟件觀察皮損部位組織病理學(xué)變化。

        1.8 皮膚組織勻漿檢測

        取凍存于-80℃冰箱的皮膚組織進行相關(guān)分子檢測。

        以實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)定量法檢測皮損中microRNA-145相對表達水平,從每組中隨機抽取4只小鼠的皮膚組織進行檢測。采用Trizol試劑提取皮損組織總RNA,測定濃度后制備cDNA進行反轉(zhuǎn)錄。擴增程序為:95℃,預(yù)變性5分鐘;共40個PCR循環(huán)(95℃變性15秒;60℃退火20秒;72℃延伸40秒)。熒光定量PCR循環(huán)儀進行定量,每個樣本基因做3個復(fù)孔;通過2-△△ct法計算microRNA-145相對表達量。microRNA-145引物序列:上游引物5′-CGCGATTCCTGGAAATACTG-3′,下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。U6序列:上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,94bp。

        以蛋白免疫印跡法檢測Sema3A、P21活化激酶(p21-activated kinase,PAK)水平。對皮損組織蛋白提取、定量后,配置分離膠、濃縮膠每孔上樣適量(30 μg)蛋白,90V電泳后進行轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,取出NC膜并作好標(biāo)記,用TBST洗膜5分鐘×3次后以5%脫脂奶封閉,搖床振蕩2小時。封閉后再次以TBST洗膜5分鐘×3次后將膜放入含一抗(Semaphorin 3A,1∶1 000;PLPAK1,1∶1 000;GAPDH,1∶5 000)的平皿中,4℃搖床振蕩孵育過夜。吸棄一抗,洗膜后加入山羊抗兔二抗(1∶2 000),室溫搖床振蕩反應(yīng)2小時。ECL顯色后曝光、顯影。使用G:BOX chemiXR5成像。使用Gel-Pro32軟件對結(jié)果進行灰度分析。

        以酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測白細胞介素31(interleukin-31,IL-31)、NGF、神經(jīng)生長因子4(neurotrophin-4,NT-4)含量。采用BCA試劑盒檢測皮損組織細胞裂解液蛋白濃度,按照說明書完成操作后立即在酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)。采用Sigmaplot 12.0軟件計算濃度值。

        1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

        2 結(jié)果

        2.1 各組AD小鼠皮損表現(xiàn)及評分比較

        取材前觀察各組小鼠背部皮膚情況,空白組小鼠未見皮損;模型組、陰性對照組小鼠皮膚存在不同程度的紅斑、鱗屑、表皮剝脫、抓痕、結(jié)痂等皮損;陽性對照組及青石止癢各濃度組,上述皮損較模型組、陰性對照組明顯減少。皮損評分結(jié)果顯示,治療后模型組與陰性對照組SCORAD評分無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);與模型組、陰性對照組相比,陽性對照組及青石止癢各濃度組SCORAD評分降低,皮損癥狀改善(P<0.05);陽性對照組與青石止癢中濃度組相比,二者皮損評分無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),青石止癢高、低濃度組皮損評分高于陽性對照組(P<0.05)。結(jié)果見表1。

        表1 各組AD小鼠SCORAD評分結(jié)果比較

        2.2 各組AD小鼠皮膚組織病理學(xué)變化比較

        空白組:角質(zhì)層連續(xù),角質(zhì)形成細胞排列整齊,連接緊密,無明顯炎癥細胞浸潤;模型組:棘層、顆粒層增厚,可見角化過度及角化不全,真皮層有大量淋巴細胞浸潤,局部水腫明顯,提示慢性炎癥;陰性對照組:與模型組表現(xiàn)基本一致;陽性對照組:角質(zhì)層較薄,偶可見角化過度,與模型組相比棘層變薄,少量炎癥細胞浸潤,角質(zhì)形成細胞排列整齊,無明顯水腫;青石止癢各濃度組:與模型組相比棘層變薄,真皮層淋巴細胞浸潤減少,細胞間水腫較輕。見圖1。

        2.3 各組AD小鼠皮膚組織microRNA-145表達水平比較

        與空白組相比,治療后模型組、陰性對照組、青石止癢高、低濃度組的microRNA-145表達水平降低(P<0.05);與模型組相比,青石止癢高、中濃度組的microRNA-145表達水平升高(P<0.05);與陽性對照組比較,青石止癢各濃度組microRNA-145表達水平無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表2。

        表2 各組AD小鼠皮膚組織microRNA-145表達水平比較

        2.4 各組AD小鼠皮膚組織Sema3A、PAK蛋白表達水平比較

        與空白組相比,治療后模型組、陰性對照組、青石止癢高、低濃度組皮膚Sema3A蛋白表達水平降低(P<0.05),PAK蛋白表達水平升高(P<0.05);與模型組相比,陰性對照組在兩種蛋白表達水平上無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);與模型組、陰性對照組相比較,陽性對照組、青石止癢中、低濃度組Sema3A蛋白表達水平升高(P<0.05),PAK蛋白表達水平降低(P<0.05);與陽性對照組相比,青石止癢高濃度組PAK蛋白表達水平升高(P<0.05),陽性對照組與青石止癢中、低濃度組的Sema3A蛋白、PAK蛋白表達水平無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見圖2、表3。

        注: A 空白組;B 模型組;C 陽性對照組;D 陰性對照組;E 青石止癢高濃度組;F 青石止癢中濃度組;G 青石止癢低濃度組。

        注:A 空白組;B 模型組;C 青石止癢中濃度組;D 青石止癢高濃度組;E 青石止癢低濃度組;F 陰性對照組;G 陽性對照組。

        表3 各組AD小鼠皮膚組織Sema3A、PAK蛋白表達比較

        2.5 各組AD小鼠皮膚組織NGF、NT-4、IL-31含量比較

        與空白組相比,治療后模型組、陰性對照組及青石止癢高濃度組皮膚NGF含量升高(P<0.05),模型組NT-4含量升高(P<0.05),模型組、陰性對照組IL-31含量升高(P<0.05);與模型組相比,陽性對照組、青石止癢各濃度組NGF、NT-4、IL-31含量均降低(P<0.05),陰性對照組NT-4、IL-31含量降低(P<0.05);與陽性對照組相比、陰性對照組,青石止癢高濃度組NGF含量升高(P<0.05),陰性對照組、青石止癢低濃度組IL-31含量升高(P<0.05),青石止癢中濃度組NGF、NT-4、IL-31含量與陽性對照組相比無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表4。

        表4 各組AD小鼠皮膚組織NGF、NT-4、IL-31含量比較

        3 討論

        AD作為皮膚科臨床常見疾病,其病因及發(fā)病機制復(fù)雜,至今未能明確。目前學(xué)界主要認為AD的發(fā)病原因是環(huán)境因素作用于遺傳易感性個體從而導(dǎo)致一系列免疫失調(diào)所致[18],這與中醫(yī)“兩虛相得”的認識一致。青石止癢軟膏原名甘石青黛膏,源自已故名老中醫(yī)金起鳳教授經(jīng)驗方,后經(jīng)李元文教授[19]根據(jù)幾十年的臨床應(yīng)用進行優(yōu)化改良而得。方中重用爐甘石收濕止癢斂瘡為君;青黛瀉火解毒,涼血燥濕,與燥濕生肌的煅石膏相伍為臣;黃柏、苦參為佐以增強燥濕止癢之力;冰片解毒療瘡為使,諸藥合用共奏清肝瀉火,燥濕止癢之功。青石止癢軟膏現(xiàn)作為北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院院內(nèi)制劑被廣泛應(yīng)用于辨證為濕熱證或肝郁化火證的炎癥性皮膚病,療效顯著。其治療AD的分子機制還有待完善。

        本研究顯示,DNCB誘導(dǎo)造模后,模型組小鼠出現(xiàn)紅斑、鱗屑、表皮剝脫等皮損,組織病理學(xué)可見真皮層有大量淋巴細胞浸潤,局部水腫明顯棘層、顆粒層增厚,角化過度及角化不全的表現(xiàn),提示造模成功。用藥7天后,青石止癢各濃度組以及陽性對照組在皮損評分與組織病理學(xué)表現(xiàn)上較模型組明顯改善,提示青石止癢軟膏對AD療效明確。

        研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)內(nèi)分泌—免疫—皮膚系統(tǒng)下屬的神經(jīng)營養(yǎng)因子家族所包含的NGF、腦源性神經(jīng)因子、神經(jīng)生長因子3及NT-4等因子在促進神經(jīng)生長方面扮演重要角色,是神經(jīng)元和角質(zhì)形成細胞的生長因子,具有抗凋亡、參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及調(diào)控皮膚炎癥的作用[20-21]。而同樣由角質(zhì)形成細胞表達的Sema3A作為神經(jīng)排斥因子,則具有抑制神經(jīng)生長的作用,與NGF等因子共同支配表皮神經(jīng)纖維的生長,起到雙向調(diào)節(jié)的作用。有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)皮膚屏障破壞后,表皮神經(jīng)正常生長受影響,表現(xiàn)為表皮神經(jīng)的密度增加[22]。相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn),在患有AD的人類[23-25]和小鼠皮膚活檢[26]中觀察到NGF高于正常表皮表達,其他因子如NT-4在AD患者中表達也有增加[27],與之相對的Sema3A的表達則會減少[28]。應(yīng)用神經(jīng)生長因子抑制劑[29]或Sema3A軟膏[30]可以有效干預(yù)AD的發(fā)展,其他干預(yù)手段也可以通過對Sema3A/NGF相關(guān)分子水平產(chǎn)生影響從而治療AD[31-32]。

        本研究顯示,陽性對照組以及青石止癢中、低濃度組Sema3A表達水平高于模型組;陽性對照組、青石止癢各濃度組NGF、NT-4含量低于模型組。而與空白組比較,青石止癢高、低濃度組分子水平上仍存在差異,未恢復(fù)到正常水平,提示不同濃度藥物治療效果可能存在差異,考慮可能與藥膏濃度、透皮吸收度以及療程等因素相關(guān),具體還需進一步研究。

        此外本研究結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組microRNA-145表達降低,PAK表達增多,IL-31含量增加;經(jīng)7天用藥后,陽性對照組及青石止癢中濃度組microRNA-145表達上調(diào),PAK表達減少,陽性對照組及青石止癢各濃度組IL-31含量減少,與空白組相比無顯著差異。microRNA-145是調(diào)控Sema3A蛋白基因表達的重要靶向micro RNA,當(dāng)microRNA-145上調(diào)時,mRNA以及蛋白質(zhì)水平上的Sema3A都會出現(xiàn)過度表達[33]。PAK是Rac1的效應(yīng)結(jié)合蛋白,有研究表明PAK對Sema3A及其誘導(dǎo)的神經(jīng)塌陷反應(yīng)有一定的抑制作用[34],因此推測其可能與AD有潛在聯(lián)系。除此之外,還有許多因子可能影響到AD患者表皮神經(jīng)纖維的生長。有研究報道AD患者皮膚瘙癢部位的IL-31含量高于正常皮膚[35],這可能與IL-31誘導(dǎo)神經(jīng)元的生長,從而導(dǎo)致皮損部位神經(jīng)密度增加有關(guān)[36]。有研究也證實了抗IL-31可顯著抑制AD小鼠模型的瘙癢癥狀[37]。

        綜上,青石止癢軟膏一方面可以改善AD皮損癥狀以及組織病理學(xué)變化,另一方面在分子層面,可能是通過降低NGF、NT-4的水平,并通過增強microRNA-145基因表達,從而提高Sema3A蛋白表達水平,同時抑制PAK蛋白表達,從而降低皮損部位新生表皮神經(jīng)纖維密度,對AD起到積極的治療作用。此外,青石止癢軟膏還可以通過降低皮損部位IL-31分子水平,進一步減少新生表皮神經(jīng)纖維對皮損部位的影響。

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