黃松麗 張琳婧 張秋艷 王媛媛 梁羽茜 胡秀華

帕金森病是一種中樞神經(jīng)性疾病，神經(jīng)元的丟失與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。中醫(yī)藥可能通過針對不同致病因素的多重作用保護(hù)存活的多巴胺神經(jīng)元[1]。牽正散和大補(bǔ)陰丸是中醫(yī)臨床常用的兩個方劑，柴原等[2]研究表明牽正散和大補(bǔ)陰丸及其合方對小鼠腦神經(jīng)有保護(hù)作用。此外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)6 μmol/L蛋白酶抑制因子I(proteasome inhibitor I，PSI)誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞可成功復(fù)制帕金森病體外細(xì)胞模型，而一定濃度的牽正散水煎劑能夠改善PSI對該細(xì)胞的抑制作用[3]。本研究通過PSI對大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(pheochromocy-toma cells，PC12)進(jìn)行誘導(dǎo)，復(fù)制帕金森病體外細(xì)胞模型，研究牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對該細(xì)胞模型細(xì)胞增殖、凋亡及總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量的影響，檢測牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對泛素/蛋白酶體途徑中相關(guān)因子TBP1-19和PA28α蛋白表達(dá)的影響，確定牽正散合大補(bǔ)陰丸對帕金森病體外細(xì)胞模型的影響及作用機(jī)制，為中醫(yī)臨床治療提供新思路和可靠依據(jù)，并為合方用藥提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(pheochromocy-toma cells，PC12)，編號：3111C0001CCC000024，購于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心。該細(xì)胞為疏松貼壁細(xì)胞，以多角形為其形態(tài)特性，85% RPMI 1640和10% 胎牛血清以及5%馬血清的完全培養(yǎng)基為其培養(yǎng)條件，于恒溫恒濕(37℃，5%CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥物制備

PSI(德國默克集團(tuán)，批號：539160)粉末溶于DMSO中，配制為2 mmol/L的儲存濃度，于-20℃冰箱避光分裝保存。

大補(bǔ)陰丸、牽正散兩方劑藥物購于北京同仁堂藥業(yè)有限公司。依據(jù)常規(guī)煎煮方式將大補(bǔ)陰丸(熟地黃18 g、龜板18 g、黃柏12 g、知母12 g)水煎濃縮并經(jīng)過無菌處理，以2 g/mL的水煎劑濃度4℃冰箱中保存?zhèn)溆?長期則保存于-20℃冰箱)。牽正散(白附子9 g、白僵蠶9 g、全蝎9 g)水煎劑的制備方式和儲存濃度與之相同[3]。

1.3 主要試劑

Annexin-FITC/PI雙染試劑盒(江蘇凱基生物科技有限公司，批號：KGA106)，SOD檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號：R22261)，TBP1-19(美國Enzo公司，批號：03051248)，PMSE1多克隆抗體(又名：PA28α，美國PROTEINTECH GROUP公司，批號：10543-1-AP)，β-actin(美國PROTEINTECH GROUP公司，批號：20536-1-AP)，羊抗小鼠IgG-HRP(北京索萊寶生物科技有限公司，批號：SE131)，羊抗兔IgG-HRP(北京索萊寶生物科技有限公司，批號：SE134)。

1.4 分組處理

根據(jù)MTT法計算出對PC12細(xì)胞抑制率為0%、25%(即IC0、IC25)時的牽正散水煎劑的濃度分別為0.20 mg/mL(下文為Q0)、12.29 mg/mL(下文為Q25)，大補(bǔ)陰丸水煎劑的濃度分別為0.81 mg/mL(下文為D0)、4.49 mg/mL(下文為D25)。據(jù)此將實驗分組設(shè)置為9組：模型組；模型加單方組分為PSI+Q0組，PSI+Q25組和PSI+D0組，PSI+D25組；PSI加合方組分為P+D25+Q25組，P+D25+Q0組和P+Q25+D0組；空白對照組。模型組給藥為6 μmol/L PSI[4]，PSI加藥組即6 μmol/L PSI及上述各組對應(yīng)濃度藥物共同處理，空白對照組予等量培養(yǎng)液培養(yǎng)。每組設(shè)三個平行樣本。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡

將PC12細(xì)胞按每孔6×104個/mL的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時后按照1.4分組及給藥處理，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，將懸浮在培養(yǎng)液中的PC12細(xì)胞收集于離心管中離心(2 000 r/min，5分鐘)后加入預(yù)冷的PBS吹打混勻；用不含EDTA的胰酶將貼壁生長的PC12細(xì)胞消化收集于離心管中離心，加入預(yù)冷的PBS吹打混勻；將兩離心管中的細(xì)胞混合，重懸離心后用PBS洗滌一次。用500 μL Binding buffer吹打混勻PC12細(xì)胞后，避光加入5 μL Annexin-FITC混勻，再加入5 μL Propidium Iodide，室溫避光環(huán)境下放置10分鐘后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 NBT核黃素比色法檢測細(xì)胞上清液SOD含量

細(xì)胞培養(yǎng)、接種方式、分組及給藥處理均同1.5，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時，保留細(xì)胞上清液儲存于-20℃冰箱備用。設(shè)置分組，根據(jù)說明制備工作液，于EP管中加入各組分混勻，隨后光照對照組和待測樣品組分別加入96孔板中。將空白對照組EP管單獨(dú)置于暗處避光反應(yīng)；96孔板暴露在4 000 LX日光燈下反應(yīng)20分鐘后，將空白對照組移至96孔板，酶標(biāo)儀讀出560 nm處吸光度，根據(jù)吸光度計算各樣品組SOD含量。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對泛素/蛋白酶體途徑中相關(guān)因子表達(dá)的影響

以2×105個/mL的密度將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞傳至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24小時后分組及給藥處理方式同1.4，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。用RIPA裂解收集貼壁細(xì)胞的蛋白，取少量稀釋后測定蛋白濃度，并將其余蛋白進(jìn)行變性。配制12%分離膠和濃縮膠，制膠后將各組樣品加入上樣孔中進(jìn)行電泳，待各蛋白組分分離明顯時用PVDF膜覆蓋于SDS-PAGE膠上進(jìn)行電轉(zhuǎn)，隨后將PVDF膜移至孵育盒中，用5%的脫脂奶粉室溫條件下封閉2小時，加入一抗4℃孵育過夜，第二天加入二抗室溫孵育1小時，TBST洗膜三次后，避光滴加發(fā)光液，曝光機(jī)中曝光掃描。使用Image J軟件分析所得目的蛋白條帶。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對PSI誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型凋亡的影響

與空白對照組相比，模型組及模型加藥組壞死細(xì)胞百分比、凋亡細(xì)胞百分比不同程度升高，正常細(xì)胞百分比不同程度降低。與模型組相比，P+Q0組、P+Q25組及P+Q25+D0組壞死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞百分比下降，正常細(xì)胞百分比增加。如表1及圖1所示。

表1 牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對PSI誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型凋亡的影響

圖1 牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對PSI誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型凋亡的影響

2.2 牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對PSI誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型上清液SOD活力檢測

與空白對照組相比，模型組SOD活力值降低(P<0.05)；與模型組相比，除P+Q0組外，6個模型加藥組SOD活力值均提高(P<0.05)。如表2所示。

表2 牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對PSI誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型上清液中SOD活力的影響

2.3 牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對PSI誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型TBP1-19蛋白表達(dá)水平的影響

與空白對照組相比，模型組TBP1-19蛋白表達(dá)水平降低；加藥組的TBP1-19蛋白表達(dá)量較模型組高，其中P+Q0組、P+Q25+D0組和P+D25+Q25組的TBP1-19蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組。由此可見，PSI誘導(dǎo)PC12細(xì)胞后可下調(diào)TBP1-19蛋白水平的表達(dá)；牽正散和大補(bǔ)陰丸水煎劑兩方合用對PSI誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞中TBP1-19蛋白表達(dá)的下降有明顯改善作用。 如圖2、圖3所示。

圖2 牽正散及牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對PSI誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型TBP1-19蛋白表達(dá)的影響

圖3 大補(bǔ)陰丸及牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對PSI誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型TBP1-19蛋白表達(dá)的影響

2.4 牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對PSI誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型PA28α蛋白表達(dá)水平的影響

蛋白免疫印跡法檢測PA28α蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖4、圖5所示，模型組與空白對照組相比PA28α蛋白表達(dá)水平降低；各模型加藥組與模型組相比，P+Q0組、P+Q25+D0組的PA28α蛋白表達(dá)水平升高。由此可知，PSI誘導(dǎo)PC12細(xì)胞后，可下調(diào)PA28α蛋白的表達(dá)；牽正散和大補(bǔ)陰丸及其合方水煎劑可明顯提高PSI誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞模型中PA28α蛋白的表達(dá)。

圖4 牽正散及牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對PSI誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型PA28α蛋白表達(dá)的影響

圖5 大補(bǔ)陰丸及牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對PSI誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型PA28α蛋白表達(dá)的影響

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為帕金森病屬于“顫證”范疇，該病多以肝腎陰虛、氣血不足為本，以風(fēng)、痰、瘀、火為標(biāo)[4]。帕金森病的中醫(yī)臨床治療以熄風(fēng)止顫為主，以補(bǔ)益肝腎、益氣養(yǎng)血、清熱祛痰及活血化瘀為輔[5]。《黃帝內(nèi)經(jīng)素問》 指出“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”，而明代王肯堂在《證治準(zhǔn)繩》中提出該病病機(jī)為“老年陰血不足，少水不能治盛火”，說明該病與肝風(fēng)及陰虛火旺關(guān)系密切。牽正散與大補(bǔ)陰丸是經(jīng)典的中醫(yī)方劑，前者熄風(fēng)止顫，后者補(bǔ)益肝腎，與本病治法相符?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究指出，牽正散具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用[6-8]。大補(bǔ)陰丸組成藥物的活性成分對神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的多個系統(tǒng)具有廣泛藥理作用[9-10]，其中龜板也具有保護(hù)神經(jīng)的作用[11]。

目前應(yīng)用PSI誘導(dǎo)PC12細(xì)胞是構(gòu)建帕金森病體外細(xì)胞模型的常用方法，PSI作用24小時后，PC12細(xì)胞內(nèi)可形成典型帕金森病特征[12]。而細(xì)胞凋亡在帕金森神經(jīng)元損傷與丟失過程中起了重要作用[13]，熒光染色后，流式細(xì)胞儀檢測可將凋亡、壞死以及正常細(xì)胞區(qū)分出來。檢測發(fā)現(xiàn)各組不同濃度的藥物作用于PC12細(xì)胞模型48小時后，模型組與空白對照組相比顯示出PSI處理后PC12細(xì)胞壞死、凋亡比例升高，而加藥組與模型組相比則均有不同程度降低細(xì)胞壞死和凋亡的作用，其中P+Q25+D0組及P+Q0組、P+Q25組效果較好。此外，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)是中醫(yī)藥治療帕金森病相關(guān)作用機(jī)制之一[13]。SOD是生物體內(nèi)氧化應(yīng)激過程中一種重要的抗氧化酶，其活力升高能夠消除或減輕氧自由基造成的傷害，保護(hù)機(jī)體。結(jié)果顯示，模型組PC12細(xì)胞經(jīng)PSI誘導(dǎo)后SOD較空白對照組活性下降，不同濃度的牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑干預(yù)后，與模型組相比可使SOD值升高，達(dá)到緩解PSI造成的損傷、發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。

帕金森病以中腦黑質(zhì)中多巴胺神經(jīng)元損傷、路易小體形成為病理特征，泛素是路易小體的成分之一，因此，泛素/蛋白酶體途徑可能是帕金森病發(fā)病的相關(guān)通路。泛素/蛋白酶體途徑與蛋白質(zhì)代謝和功能緊密相關(guān)，是生物體內(nèi)細(xì)胞蛋白降解系統(tǒng)的重要途徑，TBP1-19、PA28α是該通路中的重要靶點，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解。泛素/蛋白酶體途徑中的FBXO7和Parkin兩種蛋白與帕金森病發(fā)病有關(guān)，且有研究表明帕金森病患者發(fā)生黑質(zhì)20S蛋白酶體的α2亞基以及激活亞基TBP1-19、PA28蛋白丟失[14-15]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對泛素/蛋白酶體途徑中的相關(guān)因子TBP1-19、PA28α蛋白的表達(dá)均有影響，且不同濃度的牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑均可以改善PSI誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型中的TBP1-19及PA28ɑ蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，不同濃度的牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑可在不同程度上改善PSI誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型壞死及凋亡情況，改善PSI誘導(dǎo)細(xì)胞模型中的SOD降低，提高TBP1-19、PA28α蛋白表達(dá)水平。體外實驗驗證了牽正散合大補(bǔ)陰丸水煎劑對帕金森病具有一定的保護(hù)作用，與柴原等人進(jìn)行的小鼠體內(nèi)實驗結(jié)果一致[2]，這為臨床治療帕金森病提供了新思路。