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        電針干預(yù)對肌萎縮側(cè)索硬化SOD1 G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓SOD1、GSH-Px含量和Bax、Bcl2表達(dá)的影響

        2021-11-25 10:57:06孫嫘韓敏娟李娜劉娟喬海法
        環(huán)球中醫(yī)藥 2021年11期
        關(guān)鍵詞:曲池電針轉(zhuǎn)基因

        孫嫘 韓敏娟 李娜 劉娟 喬海法

        肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一種神經(jīng)退行性疾病,以上、下運(yùn)動神經(jīng)元選擇性損害為特征,平均生存率為3.5年[1]。調(diào)查顯示,中國ALS患病率約為3.1/10萬人[2]。目前,僅利魯唑?qū)LS有暫時(shí)緩解作用[3]。ALS患者相關(guān)基因突變或通路異常表達(dá),動態(tài)平衡破壞而導(dǎo)致體內(nèi)氧自由基累積,引起氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致ALS運(yùn)動神經(jīng)元的進(jìn)行性損傷及丟失。肌萎縮側(cè)索硬化SOD1 G93A轉(zhuǎn)基因小鼠(SOD1 G93A transgenic mice,SOD1G93A)與人類ALS 發(fā)病特點(diǎn)極為相似,該鼠從胚胎發(fā)育后期已出現(xiàn)神經(jīng)退行性變[4],同時(shí)客觀反映了氧化應(yīng)激對運(yùn)動神經(jīng)元的損傷機(jī)制,為研究提供可靠的動物模型[5]。故本研究采用 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)對象,通過電針干預(yù)雙側(cè)足三里穴、曲池穴,觀察小鼠體質(zhì)量、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)潛伏期的改變,檢測脊髓組織銅鋅超氧化物歧化酶(Cu, Zn-Superoxide dismutase,SOD1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的含量,以及B淋巴細(xì)胞瘤基因-2相關(guān)X蛋白(BCL2-Associated X,Bax)和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl2)的表達(dá),探討電針干預(yù)調(diào)控脊髓抗氧化酶水平以及抗細(xì)胞凋亡水平,從而保護(hù)神經(jīng)元,改善ALS運(yùn)動功能及癥狀,提高存活率的作用。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動物

        SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠24只,同窩陰性小鼠12只,12周齡,體質(zhì)量(20±3) g,由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供,合格證編號:SCXK(蘇)2016-0010。動物實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守國家實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例規(guī)定,所有SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠均飼養(yǎng)于明暗交替(12小時(shí)/12小時(shí))、恒溫(25±2)℃、恒濕(50%~70%)、無特定病原菌(specific pathogen free, SPF)環(huán)境中,以滅菌的SPF級顆粒型鼠類飼料和無菌水飼養(yǎng)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

        一次性無菌針灸針(0.30 mm×15 mm,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);SDZ-Ⅱ型電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司) ;小鼠固定器(眾實(shí)科技,批號:1056714)。SOD1測定試劑盒(南京建成,批號:A001-2-2);GSH-Px試劑盒(南京建成,批號:A005-1-1);Anti-Bcl-2 (北京博奧森,批號:bs-4563R);Anti-Bax(北京博奧森,批號:bs-0127M);山羊抗鼠IgG(北京鼎國昌盛,批號:SH-0011)。PVDF轉(zhuǎn)印膜(美國Thermo Fisher公司);石蠟切片機(jī)(德國SLEE公司);顯微鏡(日本OLTMPUS公司) ;電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)。

        1.3 分組與干預(yù)方法

        SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠24只按照對照隨機(jī)數(shù)字表法分為電針組、模型組,每組12只,同窩陰性小鼠12只作為空白組。根據(jù)《常見實(shí)驗(yàn)動物穴位圖譜》足三里穴定位:在膝關(guān)節(jié)外側(cè)、腓骨小頭下3.5 mm,直刺2 mm;曲池穴定位:位于橈骨近端的關(guān)節(jié)外側(cè)前方的凹陷中,直刺2毫米。電針組針刺雙側(cè)足三里穴、曲池穴后,采用1 mA,2 Hz斷續(xù)波,持續(xù)刺激1分鐘,后留針15分鐘,不作任何手法;空白組及模型組采取同樣抓取手法并固定15分鐘。三組均于每日上午干預(yù)1次,每周5次,周六、周日不予針刺,連續(xù)干預(yù)4周。

        1.4 觀測指標(biāo)及檢測方法

        1.4.1 體質(zhì)量 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠早期體質(zhì)量下降主要是由于運(yùn)動神經(jīng)元的丟失導(dǎo)致肌肉萎縮而致。3組小鼠分別于干預(yù)前1天及干預(yù)1周、2周、3周、4周末干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行體質(zhì)量測量,每只測量3次,取平均值[6]。

        1.4.2 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 也稱潛伏期,主要觀察小鼠在轉(zhuǎn)棒儀器上停留時(shí)間,用于評定小鼠協(xié)調(diào)性及肌力。轉(zhuǎn)棒儀轉(zhuǎn)速為15 r/min,超過200秒按照200秒記錄,不足200秒則按照實(shí)際時(shí)長記錄。實(shí)驗(yàn)前對小鼠進(jìn)行1周適應(yīng)性訓(xùn)練。測試時(shí)間為干預(yù)前1天及干預(yù)1周、2周、3周、4周末干預(yù)結(jié)束后,記錄小鼠每次潛伏期的時(shí)間,每只小鼠重復(fù)測量3次,每次間隔15分鐘,取平均值。

        1.4.3 取材與檢測 三組小鼠完成最后1次干預(yù)、測量體質(zhì)量,并禁食24小時(shí)(正常飲水)后,每組隨機(jī)取6只使用冰PBS和4%多聚甲醛進(jìn)行小鼠全身固定灌流,取脊髓腰4~5節(jié)段組織置于4%多聚甲醛后固定。采用免疫組化法,觀察SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓組織Bax、Bcl2陽性細(xì)胞表達(dá)。每組剩余6只小鼠予10%水合氯醛(3.5 mL/kg) 腹腔注射麻醉,斷頭處死,于冰塊上迅速剪取脊髓腰4~5節(jié)段組織,放入凍存管中,并保存于-80℃的冰箱備用。利用比色法,檢測SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓組織 SOD1、GSH-Px的含量。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        2 結(jié)果

        2.1 電針干預(yù)對ALS小鼠體質(zhì)量的影響

        干預(yù)期間,空白組體質(zhì)量呈增加趨勢;電針組較模型組減輕幅度小,但均較空白組體質(zhì)量明顯減輕,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明電針干預(yù)后,SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠體質(zhì)量得到了一定的保持或增加,因運(yùn)動神經(jīng)元的丟失而導(dǎo)致的肌肉萎縮得到了一定的改善。見表1。

        表1 各組ALS小鼠電針干預(yù)前后體質(zhì)量比較

        2.2 電針干預(yù)對ALS小鼠潛伏期的影響

        模型組、電針組較空白組潛伏期均縮短(P<0.05);電針組較模型組停留時(shí)間長,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明電針干預(yù)后,SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動功能得到一定的改善。見表2。

        表2 各組ALS小鼠電針干預(yù)前后轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)潛伏期比較

        2.3 電針干預(yù)對ALS小鼠脊髓組織SOD1、GSH-Px含量的影響

        與模型組相比,電針組SOD1、GSH-Px表達(dá)明顯升高(P<0.05),但仍顯著低于空白組(P<0.05)。表明電針干預(yù)可能通過增加SOD1、GSH-Px的表達(dá),抗氧化應(yīng)激,抑制神經(jīng)元進(jìn)一步損傷,進(jìn)而改善SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠疾病的狀態(tài)。見表3。

        表3 各組ALS小鼠電針干預(yù)前后脊髓組織SOD1、GSH-Px含量的比較

        2.4 電針干預(yù)對ALS小鼠脊髓組織Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

        干預(yù)結(jié)束后,Bax 在各組小鼠脊髓中均有表達(dá)。與空白組相比,模型組與電針組Bax陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯升高,平均灰度值降低 (P<0.05),表明SOD1G93A小鼠脊髓腰4~5節(jié)段中細(xì)胞凋亡相關(guān)酶增多。與模型組相比,電針組脊髓中Bax 陽性表達(dá)降低,平均灰度值增高(P<0.05)。同時(shí),電針干預(yù)4周后出現(xiàn)脊髓中抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-2 增加的現(xiàn)象(如圖2),表明各組小鼠Bcl-2 在脊髓中均有表達(dá)。與空白組相比,模型組與電針組Bcl-2 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯降低,平均灰度值升高(P<0.05),表明SOD1G93A小鼠抗細(xì)胞凋亡基因減少。與模型組相比,電針組Bcl-2 陽性表達(dá)增高,平均灰度值降低(P<0.05),表明電針干預(yù)可能通過降低Bax的表達(dá),升高Bcl-2的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡,改善SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠疾病的狀態(tài)。(見圖1、圖2)

        3 討論

        中醫(yī)古籍無ALS的相關(guān)記載,大多數(shù)醫(yī)家以其進(jìn)行性的肌無力、肌萎縮等主要臨床表現(xiàn),將其歸入“痿病”的范疇?!端貑枴ゐ粽撈?“論言治痿者,獨(dú)取陽明何也?”《靈樞·根結(jié)》曰:“太陽為開,陽明為闔,少陽為樞……故痿疾者,取之陽明?!睆埥橘e云:“陽明虛則血?dú)馍伲荒軡欚B(yǎng)宗筋……故足痿為用,此所以當(dāng)治陽明也。”可見“治痿獨(dú)取陽明”理論是針灸治療痿證的核心內(nèi)容之一。歷代醫(yī)家無不以此為治療痿證之理論,遣方用針之臨床指南。在此理論基礎(chǔ)之上,應(yīng)用針灸方法治療運(yùn)動神經(jīng)元病,如ALS等,取得了一定的臨床療效。臨床實(shí)踐證明,針刺以陽明經(jīng)足三里、曲池為主穴,具有通經(jīng)絡(luò)、益脾胃、強(qiáng)筋骨、潤肌肉之功效[7-9]。本實(shí)驗(yàn)即以“治痿獨(dú)取陽明”為理論基礎(chǔ),取雙側(cè)足三里穴、曲池穴,以電針代替人工手法操作,減少人為操作的誤差。

        現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為ALS的發(fā)病與多種因素有關(guān),而氧化應(yīng)激是主要發(fā)病因素之一。在ALS患者尸檢中發(fā)現(xiàn)脊髓和大腦運(yùn)動皮層中羰基衍生物水平明顯升高,提示ALS患者神經(jīng)系統(tǒng)中存在氨基酸的直接氧化[10]。正常人體內(nèi)會不斷產(chǎn)生和消除各類活性氧基團(tuán),而ALS患者由于基因突變等因素導(dǎo)致體內(nèi)自由基過度積累,同時(shí)抗氧化系統(tǒng)清除能力下降,從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[11]。中樞系統(tǒng)所含抗氧化物總量相對不足,耗氧量高,細(xì)胞膜含有大量不飽和脂肪酸及具有氧化還原活性金屬離子,在發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),神經(jīng)細(xì)胞易首先受到損傷,從而引起ALS的各種癥狀[12]。SOD1占SOD總量的86%,是生物內(nèi)源性抗氧化劑,可通過歧化作用清除體內(nèi)超氧陰離子自由基, 減輕細(xì)胞損傷, 在維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能中起著十分關(guān)鍵的作用[13-14]。而GSH-Px作為活性過氧化氫的清除劑,可加強(qiáng)SOD1保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白組相比,模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低,潛伏期也明顯縮短,同時(shí)脊髓組織中抗氧化酶SOD、GSH-Px的表達(dá)明顯偏低,說明SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠隨著發(fā)病時(shí)間的進(jìn)展,體內(nèi)確實(shí)存在氧化應(yīng)激。電針干預(yù)可顯著提高SOD1、GSH-Px的含量,使失衡的氧化/抗氧化酶系統(tǒng)趨于正常,從而減輕氧化損傷,保護(hù)神經(jīng)元。Bax、Bcl-2是一對凋亡與抗凋亡的基因表達(dá)的蛋白,共屬Bac-2基因家族。Bcl-2與Bax蛋白水平的高低與凋亡調(diào)控直接相關(guān),Bcl-2是細(xì)胞凋亡的抑制基因,而Bax拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用,且具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能。Bax與Bcl-2共存于線粒體,Bcl-2與Bax蛋白可形成同二聚體,也可相互作用形成異二聚體。其中,Bax自身可組成同二聚體,而Bcl-2必須結(jié)合Bax形成異二聚體,從而阻抑凋亡[16]。Bcl-2基因所編碼的蛋白質(zhì)屬于胞內(nèi)膜整合蛋白,它對大多數(shù)因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有拮抗作用。而Bcl-2蛋白能夠影響活性氧水平,可有效清除氧自由基,減輕細(xì)胞的損傷[17-18]。同時(shí)Bcl-2能促進(jìn)谷胱甘肽進(jìn)入核內(nèi),改變核內(nèi)氧化還原狀態(tài),從而抑制凋亡[19-20]。電針干預(yù)足三里穴和曲池穴可使Bax表達(dá)降低、Bcl-2表達(dá)升高,提高了脊髓組織抗細(xì)胞凋亡能力,從而減少神經(jīng)元的凋亡。

        注:A 空白組;B 模型組;C 電針組

        注:A 空白組;B 模型組;C 電針組

        綜上所述,電針干預(yù)足三里穴和曲池穴可改善SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動功能,提高脊髓組織對活性氧誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的負(fù)性調(diào)節(jié)作用,抑制神經(jīng)元的凋亡,從而有效發(fā)揮對神經(jīng)元的保護(hù)作用,減少神經(jīng)元損傷,起到早期治療ALS的效果,對ALS早期臨床防治具有重要意義。

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