劉男男 于雪 張藝 馬煜洋 潘佳創(chuàng) 孫彤彤 吳璐蔚 倪鈺瑩 范淑月 劉敏

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種發(fā)生在鼻粘膜上主要由免疫球蛋白 E(immunoglobulin E, IgE)介導的Ⅰ型變態(tài)性反應，臨床上以鼻癢、流清涕、打噴嚏等為主要表現(xiàn)，常遷延不愈、反復發(fā)作[1]。研究表明經卵蛋白(ovalbumin,OVA)致敏的小鼠肺部存在著廣泛的氧化應激損傷[2]，線粒體損傷是導致活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)增加、氧自由基大量產生、誘發(fā)或加重氧化應激損傷與炎癥之間級聯(lián)反應的重要原因[3]。因此研究對線粒體氧化應激損傷具有保護作用的藥物對于減緩AR發(fā)病的病理進程，發(fā)揮治療AR作用具有重要的指導意義。本實驗從線粒體氧化應激的角度入手，探討麻黃細辛附子湯治療AR的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6J雄性小鼠21只，體質量(18±2)克，購買于北京斯貝福生物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0002。小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院SPF級動物房[許可證號：SYXK(京)2019-0013]，溫度(24±2)℃，濕度50%±10%，12/12小時光照周期，實驗室定時通風，通風狀態(tài)良好，實驗期間動物自由進食和進水。本實驗通過北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院倫理委員會批準(倫理審批號：201921)。

1.2 實驗藥物

麻黃細辛附子湯常規(guī)用藥量[4]麻黃6 g、附子9 g、細辛3 g，均購買于北京仟草中藥飲片公司。常規(guī)法煎煮，濃縮至藥物濃度0.7 g/mL,按照成人與小鼠體表面積換算法[5]，換算成小鼠劑量7.8 g/kg體質量進行中藥灌胃。

1.3 實驗試劑與儀器

腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)α2抗體(英國abcam公司，批號：ab3760)，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated AMPK，p-AMPK)Thrl72位點 (40H9)兔單克隆抗體(美國Cell signaling公司，批號：2535T)，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α, PGC-1α)抗體(英國abcam公司，批號：ab191838)。PageRulerTMPrestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa(美國Thermo公司，批號：26617)。SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(美國BIO-Rad)，4℃低溫高速離心機(美國Thermo)。酶標儀(ZS-3板式酶標儀)。凝膠成像儀(美國BIO-Rad)。

1.4 造模與分組

SPF級C57BL/6J小鼠適應性飼養(yǎng)7天之后按隨機數(shù)字表法隨機抽取5只作為空白組，其余16只按照如下方法進行AR模型制備：用OVA 150 μg+佐劑、PBS各50 μL對模型組小鼠進行腹腔注射，隔日注射1次，共7次。基礎致敏完成后第2天，用500 μg OVA+PBS 20 μL進行滴鼻激發(fā)，每次每只單側鼻腔各10 μL，連續(xù)7天。自激發(fā)階段開始，對小鼠的行為學進行觀察和評分，每次觀察20分鐘，評分疊加達5分及以上者為造模成功，評分指標包括擦鼻、流涕和噴嚏，評分原則如表1所示。

表1 AR模型小鼠行為學評分表[8-9]

在最后一次OVA滴鼻激發(fā)24小時后對小鼠行眶后靜脈叢取血0.3 mL，常溫靜置2小時血液分層之后離心取上清(4℃，12000 r/min，5分鐘)，用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測血清中IgE抗體。實驗過程中因操作不當造成個別小鼠死亡，最后總得AR模型小鼠12只，將造模成功的12只小鼠隨機分為模型組和麻黃細辛附子湯治療組，每組6只。

1.5 給藥方法

造模成功7天后，麻黃細辛附子湯治療組每只小鼠灌胃給藥0.2 mL，每天一次，連續(xù)14天; 模型組每只小鼠灌胃等量的生理鹽水，空白組不做任何處理。

1.6 檢測指標

1.6.1 肺組織病理學變化 用脫頸椎法處死小鼠，在冰盒上取出肺臟，用PBS溶液沖洗掉組織表面的血跡之后放在4%的多聚甲醛中固定，石蠟包埋后進行蘇木精和伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，顯微鏡下觀察肺組織的病理學變化。

1.6.2 透射電鏡觀察肺組織中線粒體的超微結構 前期操作同上，之后取肺置于2%PFA+2.5%戊二醛固定液中，用消毒刀片將固定液中的肺組織切成1 mm3小塊并放到盛有2%PFA+2.5%戊二醛的注射器中，排空肺中氣體后將肺組織放到冰上盛有1 mL 2%PFA+2.5%戊二醛的1.5 mL的EP管架中，之后依次經過如下步驟進行操作：(室溫)0.1 MPB沖洗；(冰盒)特制鋨酸(1%鋨酸+1.5%亞鐵氰化鉀)后固定；(室溫)超純水清洗樣品；1%醋酸雙氧鈾染色；(室溫)超純水清洗樣品；(冰盒)梯度乙醇脫水；(冰盒)環(huán)氧丙烷置換2次；(室溫)滲透；60℃烘箱包埋聚合，最后置于電鏡下觀察。

1.6.3 比色法檢測脾組織SOD活性、MDA含量 在冰盒上取出小鼠脾臟，用生理鹽水洗掉組織表面的血跡，制成組織勻漿，嚴格按照試劑盒操作檢測超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。

1.6.4 比色法檢測脾組織ATP含量 前期處理同1.6.3，組織勻漿提取脾組織線粒體之后嚴格按照試劑盒操作。

1.6.5 比色法檢測脾組織呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅸ活性 操作同1.6.4。

1.6.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot，WB)檢測AMPKα2、p-AMPK(Thrl72)、PGC-1α的表達 取適量脾組織加5倍體積的RIPA裂解液在冰上研磨，研磨充分后靜置30分鐘，之后4℃，12 000 r/min，15分鐘離心取上清放在-20℃的冰箱里備用。用BCA試劑盒進行蛋白定量。取樣品蛋白和5×蛋白上樣緩沖液混合，沸水煮5～15分鐘后立即冰浴進行上樣，上樣后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)電泳，65 V轉膜2小時，5%脫脂牛奶室溫搖床封閉1小時，1×TBST洗膜3次，每次10分鐘。一抗孵育4℃過夜，1×TBST洗3次，每次10分鐘。二抗室溫搖床孵育1小時，1×TBST洗膜3次，每次10分鐘。配制ECL顯色液，孵育后顯影，曝光，保存條帶，用Image J進行軟件灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組AR小鼠血清IgE含量比較

與空白組比較，模型組小鼠血清中IgE抗體含量增加(P<0.01)。經麻黃細辛附子湯治療后，IgE抗體含量明顯降低(P<0.01)，但仍高于空白組(P<0.01)。見表2。

表2 各組AR小鼠血清IgE含量比較

2.2 各組AR小鼠肺組織病理學變化

空白組肺組織結構完整，形態(tài)正常，肺泡及支氣管結構清晰可見，肺泡隔、支氣管腔無增厚，氣道周圍組織無充血水腫，黏膜及黏膜下層組織內未出現(xiàn)炎癥細胞浸潤的情況，模型組支氣管壁及肺泡隔增厚、支氣管腔狹窄、氣道周圍組織充血水腫、杯狀細胞增多、黏膜及黏膜下層組織內出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤等情況，麻黃細辛附子湯治療組較模型組各病理表現(xiàn)均有明顯的改善。見圖1。

2.3 各組AR小鼠肺組織線粒體超微結構變化

空白組線粒體呈啞鈴狀、短桿狀，未發(fā)生水腫、變性，基質電子密度中等且均勻，線粒體膜完整，線粒體嵴呈板層狀，排列整齊，與線粒體長軸平行或者垂直。模型組線粒體水腫、變性、呈空泡狀改變，基質電子密度降低，線粒體膜溶解，線粒體嵴減少、排列紊亂，大部分線粒體嵴斷裂。經麻黃細辛附子湯治療之后大部分線粒體水腫和空泡狀改變消失，基質電子密度影均勻，線粒體大部分呈短桿狀、啞鈴狀，雙層膜恢復，線粒體嵴增多、排列整齊，與線粒體長軸垂直或平行。見圖2。

2.4 各組AR小鼠脾組織SOD活性、MDA含量比較

與空白組比較，模型組脾組織SOD活性降低(P<0.01)，MDA含量升高(P<0.01)。經過麻黃細辛附子湯治療之后，SOD活性升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組AR小鼠脾組織SOD活性、MDA含量比較

2.5 各組AR小鼠脾組織ATP含量比較

與空白組比較，模型組ATP含量減少(P<0.01)，經麻黃細辛附子湯治療之后ATP含量增加(P<0.05)。見表4。

表4 各組AR小鼠脾組織ATP含量比較

注：A 空白對照組；B 模型組；C 麻黃細辛附子湯治療組;標尺=100 μm

注：A 空白對照組；B 模型組；C 麻黃細辛附子湯治療組；標尺=1 μm

2.6 各組AR小鼠脾組織呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅸ活性比較

與空白組比較，模型組呼吸鏈復合物Ⅰ活性降低(P<0.01)，呼吸鏈復合物Ⅸ活性降低(P<0.01)。經過麻黃細辛附子湯治療之后，呼吸鏈復合物Ⅰ活性升高，但與模型組比較，差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；呼吸鏈復合物Ⅸ活性升高(P<0.05)，見表5。

表5 各組AR小鼠脾組織中呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅸ活性比較

2.7 各組AR小鼠脾組織AMPKα2、p-AMPK(Thrl72)、PGC-1α蛋白的相對表達量比較

與空白組比較，模型組AMPKα2蛋白表達減少(P<0.05)，p-AMPK(Thrl72)蛋白表達減少(P<0.05)，PGC-1α蛋白表達減少(P<0.01)。經麻黃細辛附子湯治療之后，AMPKα2蛋白表達增加(P<0.05)，p-AMPK(Thrl72)蛋白表達增加(P<0.05)，PGC-1α蛋白表達增加(P>0.05)。見表6。

表6 各組AR小鼠脾組織AMPKα2、p-AMPK(Thrl72)、PGC-1α蛋白的相對表達量比較

3 討論

氧化應激損傷是指機體氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，與炎癥反應之間具有協(xié)同作用，可通過正反饋機制加速AR病理進程[4]。線粒體在平衡ROS生成、細胞凋亡及通過氧化磷酸化生成ATP的過程中具有重要的作用。研究表明經OVA誘導的小鼠肺部存在廣泛的氧化應激損傷。在炎癥環(huán)境下，氧化應激反應產生大量的氧自由基導致線粒體損傷，外膜破裂，膜轉運孔道開放造成線粒體基質內高滲透壓,使線粒體內外梯度消失，呼吸鏈脫偶聯(lián)，能量產生異常[7]并釋放出包括細胞色素C在內的各種活性蛋白和ROS[8]。釋放的線粒體成分充當細胞外“損傷相關模式分子”，通過與病原相關分子模式的受體關聯(lián)而觸發(fā)免疫級聯(lián)反應。加重炎癥和氧化應激反應[4]。

AMPK是PGC-1α的上游通路蛋白，是重要的能量調節(jié)因子。Thr172是AMPK活化的關鍵磷酸化位點，PGC-1α在調節(jié)線粒體的生成和功能方面具有重要作用。當機體內AMP/ATP比值增加時，AMPK活化，活化的AMPK可以直接或通過PGC-1α間接激活核呼吸因子調節(jié)線粒體的生物發(fā)生、線粒體穩(wěn)態(tài)和線粒體的融合與裂解，從而緩解線粒體損傷進而減輕線粒體損傷與炎癥反應、氧化應激之間的級聯(lián)反應，并且通過促進SOD2、解偶聯(lián)蛋白2等抗氧化酶的表達清除ROS，保護氧化應激損傷，調節(jié)抗氧化和氧化應激之間的平衡[9]。

AR屬于中醫(yī)學“鼻鼽”范疇，主要臨床表現(xiàn)為鼻癢、流清涕和打噴嚏。本實驗中觀察到與空白組相比，AR模型組小鼠毛發(fā)枯槁、活躍度下降，其主要病機當為肺氣虛寒、脾腎陽虛。麻黃細辛附子湯出自《傷寒論》，方中麻黃發(fā)汗解表，附子溫補腎陽，細辛溝通表里，三藥合用，溫少陰之經而發(fā)太陽之表，臨床治療AR優(yōu)勢突出。本課題組的前期研究證明，麻黃細辛附子湯能通過恢復輔助性T細胞1/輔助性T細胞2平衡發(fā)揮治療AR的作用[10-11]。線粒體是真核生物重要的供能細胞器，ATP驅動的嘌呤能炎癥體信號通路是一種危險的信號級聯(lián)，會加重炎性反應[12]，本實驗則從線粒體氧化應激的角度入手，探討麻黃細辛附子湯治療AR的作用機制。

本實驗中與空白組比較，模型組小鼠血清中IgE含量顯著升高(P<0.01)且肺組織病理表現(xiàn)出典型的炎性改變，說明造模成功。SOD是機體中廣泛存在的一種清除氧自由基的抗氧化酶，MDA是過氧化的主要產物，其異常表達會加重線粒體膜的損傷程度。本實驗的結果顯示，麻黃細辛附子湯可以升高SOD活性，降低MDA含量，并可以增加ATP含量、呼吸鏈復合物Ⅳ活性，修復線粒體的超微結構，說明該方可以減輕線粒體的氧化應激損傷。進一步探討其抗氧化機制，發(fā)現(xiàn)麻黃細辛附子湯可以上調AMPKα2和p-AMPK(Thrl72)蛋白的表達，PGC-1α蛋白表達雖有增加但不具有統(tǒng)計學意義，可能麻黃細辛附子湯通過緩解線粒體氧化應激損傷發(fā)揮治療AR的作用除了AMPK、p-AMPK(Thrl72)蛋白之外還有其他的靶點蛋白，需要進一步展開實驗研究。

本實驗發(fā)現(xiàn)氧化應激損傷與線粒體能量代謝可以通過AMPKα2和p-AMPK(Thrl72)蛋白建立正反饋聯(lián)系。中醫(yī)學的“氣”可能與線粒體具有一定的關系[9,13-14]，線粒體的能量代謝有可能是“陽氣”的現(xiàn)代生物學基礎依托。麻黃細辛附子湯可能通過緩解線粒體氧化應激損傷，保護線粒體結構和能量代謝功能從而發(fā)揮溫補脾腎經陽氣治療AR的作用。本研究為線粒體與“氣”之間的關系及扶陽作用的生物學基礎提供了一定的實驗依據(jù)。