李春青 過建春 荀運(yùn)浩 王薇薇 石偉珍

自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎（spontaneous bacterial peritonitis，SBP）可加劇慢加急性肝衰竭并發(fā)肝功能損害，明顯增加死亡風(fēng)險(xiǎn)，盡早診斷及預(yù)防SBP 發(fā)生對(duì)降低慢加急性肝衰竭病死率有重要意義[1]。越來越多的研究證實(shí)腸道菌群與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系，腸道微生態(tài)紊亂對(duì)肝衰竭病情進(jìn)展也有一定影響，但尚待深入研究[2-4]。本研究運(yùn)用16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)慢加急性肝衰竭患者糞便菌群基因組進(jìn)行分析，對(duì)比有無SBP患者腸道菌群在結(jié)構(gòu)和功能上的異同，旨在探討慢加急性肝衰竭患者并發(fā)SBP 的腸道菌群特征，為提高SBP 診治能力并最終改善肝衰竭患者預(yù)后提供線索。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2017 年6 月—2019 年8 月在杭州市西溪醫(yī)院住院的慢加急性肝衰竭患者37例，留取大便標(biāo)本。所有入組患者依據(jù)指南及臨床經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行規(guī)范化治療，并隨訪至24 周。入院診斷為SBP的患者及隨訪期間發(fā)生SBP 的22例患者設(shè)為觀察組，其余未并發(fā)SBP 的15例患者為對(duì)照組。本研究經(jīng)杭州市西溪醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過（審批號(hào)：2017 年（科）倫審第04 號(hào)）。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）符合2015 年《慢性乙型肝炎防治指南》[5]及2012 年《肝衰竭診療指南》[6]的診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為慢加急性（亞急性）肝衰竭患者；（2）有慢性乙型肝炎或乙型肝炎肝硬化發(fā)病基礎(chǔ)；（3）SBP 診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2017 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制定的《肝硬化腹水及相關(guān)并發(fā)癥的診療指南》[7]；（4）自愿參加本研究并簽署知情同意書者；（5）年齡16～65 歲。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）急性肝衰竭、慢性肝衰竭；（2）其他病因（包括自身免疫性、藥物性、酒精性、中毒性、寄生蟲性）導(dǎo)致的慢加急性（亞急性）肝衰竭；（3）原發(fā)性肝癌；（4）抗HIV 陽性，合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒或巨細(xì)胞病毒、EB 病毒等其他非嗜肝病毒活動(dòng)感染；（5）入組時(shí)即合并中度腦水腫、嚴(yán)重感染（包括感染性休克、深部真菌感染、2 部位以上感染、二重感染等）、1 型肝腎綜合征、消化道大出血等；（6）2 周內(nèi)使用抗生素或微生態(tài)調(diào)節(jié)劑；（7）膽囊切除或消化道手術(shù)史、脾切除史；（8）合并有其他臟器功能嚴(yán)重?fù)p傷者及精神病患者；（9）妊娠或哺乳期婦女；（10）不愿合作及依從性差的患者。

2 方法

2.1 標(biāo)本采集檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

2.1.1 標(biāo)本采集 入組時(shí)采集所有受試者新鮮且未被污染的糞便于無菌容器中，置于-80℃冰箱保存；測(cè)序前統(tǒng)一提取樣本DNA。

2.1.2 16S rDNA 擴(kuò)增及高通量測(cè)序 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）分別對(duì)16S rDNA V4-V5 區(qū)擴(kuò)增，擴(kuò)增引物根據(jù)選定的檢測(cè)區(qū)域確定，利用帶有Index 序列的引物，通過高保真PCR 向文庫末端引入特異性標(biāo)簽序列。擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，核酸純化磁珠法純化擴(kuò)增產(chǎn)物，得到原始文庫。對(duì)已經(jīng)帶有各自Index 標(biāo)簽的樣本文庫濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋，后利用Qubit 熒光計(jì)對(duì)文庫進(jìn)行精確定量，根據(jù)不同樣本的測(cè)序通量要求，按相應(yīng)比例（摩爾比）混合樣本，通過Agilent 2100 生物分析儀檢測(cè)測(cè)序文庫插入片段的大小，確認(rèn)在120～200bp 之間無非特異性擴(kuò)增，并準(zhǔn)確定量測(cè)序文庫濃度，采用Miseq 測(cè)序儀，2×250bp 的雙端測(cè)序策略對(duì)文庫進(jìn)行測(cè)序，然后將得到的序列與特定數(shù)據(jù)庫比對(duì)，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過濾，使用（practical extraction and report language，Perl）軟件對(duì)得到的優(yōu)化序列進(jìn)行總序列數(shù)、總堿基數(shù)、序列平均長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)，再行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

2.2 生物信息學(xué)分析 采用R 軟件、功能預(yù)測(cè)軟件（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states，PICRUSt）軟件對(duì)可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）進(jìn)行群落組成分析、多樣性分析及PICRUSt 功能分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組均數(shù)之間的比較采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；對(duì)分組樣本的群落結(jié)構(gòu)以及物種組成進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，兩組樣本間COG 功能差異分析采用Welch's t檢驗(yàn)，以雙側(cè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)對(duì)OTUs 等變量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。

3 結(jié)果

3.1 兩組慢加急性肝衰竭患者一般資料比較 研究共納入37例慢加急性肝衰竭患者，其中男28例，女9例，年齡20～64（51.28±11.32）歲；對(duì)照組22例，男17例，女5例，年齡（49.27±11.31）歲，病程9～26（18.42±2.71）天；觀察組15例，男11例，女4例，年齡（54.13±11.06）歲，病程11～30（21.0±3.16）天；兩組間一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。

3.2 慢加急性肝衰竭患者腸道菌群群落組成分析豐度Bubble 圖顯示，在屬的水平上觀察組患者腸道菌群豐度較高的為擬桿菌屬（bacteroides）、大腸桿菌志賀菌屬（escherichia/Shigella）、腸球菌屬（enterococcus）、副擬桿菌屬（parabacteroides）、韋榮氏球菌屬（veillonella）、魏斯氏菌屬（weissella），而未發(fā)生SBP的對(duì)照組患者腸道菌群豐度較高的菌屬不同，主要有擬桿菌屬（bacteroides）、乳桿菌屬（lactobacillus）、克雷伯菌屬（klebsiella）、普雷沃菌屬（prevotella）、鏈球菌屬（streptococcus）、韋榮氏球菌屬（veillonella）。觀察組擬桿菌屬、腸球菌屬等豐度高于對(duì)照組，而克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬、普雷沃菌屬的豐度低于對(duì)照組。見圖1。

圖1 未合并SBP 與合并SBP 慢加急性肝衰竭患者腸道菌群屬水平高豐度物種豐度Bubble 圖

3.3 慢加急性肝衰竭患者腸道菌群多樣性分析

3.3.1 OTUs 的維恩圖（Venn）分析 利用Venn 圖展示兩組患者腸道菌群OTUs 檢出情況，觀察組和對(duì)照組分別含有896和1156 個(gè)OTUs，觀察組患者可進(jìn)行腸道菌群后續(xù)生物信息學(xué)分析的數(shù)量低于對(duì)照組。見圖2。

圖2 未合并SBP 與合并SBP 慢加急性肝衰竭患者腸道菌群間共有與特有的OTUs

3.3.2 腸道菌群整體結(jié)構(gòu)分析 基于Bray-Crutis 距離的主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）顯示，觀察組和對(duì)照組之間的分布有一定的距離，表明兩組菌群結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖3。

圖3 未合并SBP（A）與合并SBP（B）慢加急性肝衰竭患者腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)分析（基于Bray-Crutis 距離的PCoA 圖）

3.4 PICRUSt 功能分析 以PICRUSt 預(yù)測(cè)腸道菌群功能，發(fā)現(xiàn)兩組之間共有8 條差異通路：細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、RNA 加工與修飾、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和伴侶蛋白等（P 均＜0.05），見圖4。

圖4 未合并SBP（A）與合并SBP（B）慢加急性肝衰竭患者腸道菌群COG 功能組間差異分析

4 討論

腸道菌群紊亂是指腸道菌群在結(jié)構(gòu)、數(shù)量、整體功能等方面發(fā)生改變，原有的動(dòng)態(tài)平衡被打破；SBP的發(fā)生與機(jī)體免疫力下降、腸道黏膜屏障受損以及腸道細(xì)菌過度生長(zhǎng)和易位相關(guān)，已知腸道菌群紊亂是SBP 重要的發(fā)病機(jī)制之一[8]。腸道與肝臟之間通過門脈系統(tǒng)聯(lián)系，肝臟大約70%的血液供應(yīng)來自腸道，慢加急性肝衰竭患者發(fā)生SBP 與其腸道菌群的變化有著密切的關(guān)系[9]。腸道免疫系統(tǒng)通過腸-肝軸影響免疫介導(dǎo)的肝損傷，腸道微生態(tài)失衡與肝衰竭發(fā)病機(jī)制有關(guān)，微生物群落組成的變化與肝病嚴(yán)重程度相關(guān)[10]。慢加急性肝衰竭為腸道細(xì)菌過度生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件，腸道細(xì)菌易位的發(fā)生率明顯增高，研究顯示，細(xì)菌易位常發(fā)生于臨床SBP 出現(xiàn)之前[11-12]。本研究中，腹膜炎組與未發(fā)生腹膜炎組患者腸道菌群中多個(gè)高豐度菌屬的差異提示腸道菌群易位可能參與了慢加急性肝衰竭患者并發(fā)SBP 的過程。

革蘭氏陰性腸桿菌是失代償期肝硬化患者最常見的易位細(xì)菌之一，腸桿菌在腸道內(nèi)過度生長(zhǎng)和產(chǎn)毒素作用破壞腸道黏膜的屏障作用，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生菌血癥和毒血癥，而腸腔中大腸埃希菌更容易穿透腸系膜淋巴結(jié)[13-14]。有研究對(duì)SBP 分布特點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，SBP患者腹腔積液培養(yǎng)分離的病原菌中首位為大腸埃希氏菌[15]。本研究結(jié)果顯示，在合并SBP患者中腸道菌群大腸桿菌志賀菌屬豐度明顯高于未發(fā)生SBP 組，進(jìn)一步證實(shí)慢加急性肝衰竭患者臨床上并發(fā)SBP 與特定微生物過度生長(zhǎng)并向腸外播散有關(guān)[16]。乳酸菌是腸道微生物中重要的有益菌之一，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示乳酸桿菌通過激活腸道固有淋巴細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素（IL）-22 增強(qiáng)腸黏膜屏障功能，還可通過抑制致病菌調(diào)節(jié)菌群紊亂[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，未發(fā)生腹膜炎組患者腸道菌群中乳酸菌屬有著較高的菌群豐度，認(rèn)為乳酸菌可通過上述功能，減少患者腹膜炎的發(fā)生。

慢加急性肝衰竭并發(fā)腹膜炎患者不僅腸道有益菌菌群豐度明顯降低，菌群數(shù)量也明顯減少[18]，本研究中腹膜炎組和無腹膜炎組分別含有896和1156個(gè)OTUs，無腹膜炎患者腸道菌群物種數(shù)量多于腹膜炎組，推測(cè)腸道菌群豐度的降低可能影響肝衰竭患者并發(fā)SBP 的風(fēng)險(xiǎn)。慢加急性肝衰竭患者并發(fā)SBP不僅與腸道菌群豐度、數(shù)量的改變有關(guān)，可能與腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的改變也有關(guān)系，本研究中PCoA 分析結(jié)果顯示，并發(fā)SBP 與未發(fā)生SBP患者腸道菌群結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。一項(xiàng)評(píng)估利福昔明臨床療效的研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化腹水消退后患者腸道菌群結(jié)構(gòu)與治療前有明顯的差異，可能通過影響腸道菌群整體結(jié)構(gòu)來治療SBP[19]。

腸道微生物的多個(gè)功能通路參與了機(jī)體糖、氨基酸和外源物質(zhì)等的代謝，肝臟疾病會(huì)影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，而腸道菌群的變化對(duì)肝臟葡萄糖和脂質(zhì)代謝等也有著一定作用[2，20]。目前對(duì)慢加急性肝衰竭并發(fā)SBP 腸道菌群功能通路的研究較少，本研究中通過篩選差異性代謝物并進(jìn)行COG 功能差異分析，結(jié)果顯示慢加急性肝衰竭患者有無并發(fā)腹膜炎兩組間在多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝途徑存在明顯差異，主要集中在氨基酸、碳水化合物、無機(jī)離子等轉(zhuǎn)運(yùn)代謝途徑，據(jù)此推測(cè)腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化可能引起機(jī)體代謝異常，慢加急性肝衰竭并發(fā)SBP 可能與上述代謝途徑及通路的異常有關(guān)，腸道菌群通過多個(gè)代謝途徑影響機(jī)體的代謝，是調(diào)節(jié)肝臟疾病的重要參與者。本研究?jī)H應(yīng)用16S rDNA 進(jìn)行了初步的功能預(yù)測(cè)，每種代謝內(nèi)部基因調(diào)控的變化后續(xù)需行宏基因組進(jìn)行功能分析。

腸道菌群易位可能參與了SBP 的一系列疾病變化過程，加速病情進(jìn)展，因此研究其早期發(fā)病機(jī)制，可以延緩甚至阻止肝病的進(jìn)展及SBP 發(fā)生[21]。通過調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂可改善腸道微生態(tài)環(huán)境，減少腸道屏障損傷，進(jìn)而改善肝臟功能[22]。機(jī)體腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，腸道菌群與終末期肝病自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎之間的因果關(guān)系還需要進(jìn)一步研究?？梢詳U(kuò)大樣本量進(jìn)行縱向深入的研究，建立腸道微生物與血清代謝物相結(jié)合的預(yù)測(cè)模型，用于終末期肝病SBP 的臨床診斷，提高SBP 的早期診斷率，從而降低死亡率。